Summary
La rigidez arterial representa un factor clave en cardiovascular velocidad de la onda de la enfermedad y del pulso (VOP) puede ser considerado como un índice de sustituto de la rigidez arterial. Este protocolo describe un algoritmo de procesamiento de imágenes para calcular la VOP en ratones basados en el procesamiento de imágenes de ultrasonido que es aplicable en diferentes sitios arteriales.
Abstract
La rigidez arterial se puede evaluar mediante el cálculo de la velocidad de onda de pulso (VOP), es decir, la velocidad con la que la onda de pulso se desplaza en un recipiente de conducto. Este parámetro está siendo investigado cada vez más en modelos de roedores pequeños en los que se utiliza para evaluar alteraciones en la función vascular relacionada con genotipos particulares / tratamientos o para la caracterización de progresión de la enfermedad cardiovascular. Este protocolo describe un algoritmo de procesamiento de imágenes que lleva a la medición de la VOP arterial no invasiva en ratones usando sólo las imágenes de ultrasonido (US). La técnica propuesta se ha utilizado para evaluar la VOP aorta abdominal en ratones y evaluar sus cambios asociados con la edad.
aorta abdominal exploraciones estadounidenses se obtienen a partir de ratones bajo anestesia gaseosa utilizando un dispositivo específico de Estados Unidos equipados con sondas de alta frecuencia en Estados Unidos. B-mode y las imágenes de onda de pulso Doppler (PW-Doppler) se analizan con el fin de obtener el diámetro y la media de los valores instantáneos de velocidad, respectivamente. Para este propósito, se emplean técnicas de detección de bordes y de seguimiento del contorno. El único latido significa formas de onda de diámetro y velocidad son alineadas en el tiempo y en combinación con el fin de lograr el diámetro velocidad (lnD-V) de bucle. valores PWV se obtienen a partir de la pendiente de la parte lineal del bucle, que corresponde a la fase sistólica temprana.
Con el presente enfoque, anatómica y funcional de la información sobre el ratón aorta abdominal puede ser alcanzado de manera no invasiva. Requiera el procesamiento de imágenes de los Estados Unidos solamente, puede representar una herramienta útil para la caracterización no invasiva de diferentes sitios arteriales en el ratón en términos de propiedades elásticas. La aplicación de la presente técnica se puede ampliar fácilmente a otros distritos vasculares, tales como la arteria carótida, proporcionando así la posibilidad de obtener una evaluación de la rigidez arterial multi-sitio.
Introduction
Los modelos de ratón se utilizan cada vez más para la investigación de las enfermedades cardiovasculares (ECV) y en particular utilizadas en estudios longitudinales que permiten la caracterización de las diferentes fases del desarrollo de la enfermedad 1. propiedades elásticas de las arterias grandes se relacionan con diferentes condiciones patológicas; desde un punto de vista técnico, la rigidez arterial se puede evaluar mediante la medición de la velocidad de onda de pulso (VOP), que representa la velocidad con la que la onda de pulso se desplaza en un recipiente de conducto 2. Debido a su importancia clínica, se mide cada vez más pequeñas, incluso en modelos animales preclínicos 3.
Diferentes técnicas están disponibles para la evaluación de la VOP en ratones. invasivos se basan en el uso de transductores de presión de punta de catéter. VOP se evalúa mediante la adquisición de señales de presión en dos sitios diferentes arteriales y dividiendo la distancia entre los dos medición sitas por el desplazamiento de tiempo entre las señales 4. La principal desventaja en relación con este tipo de técnicas es que requieren el sacrificio de animales para la evaluación de la distancia entre los dos sitios de medición y, por lo tanto, no pueden ser utilizados en estudios longitudinales. Para superar esta limitación, procedimientos no invasivos, basados en diferentes técnicas de imagen, se han desarrollado. Estudios previos han informado evaluaciones VOP en ratones obtenidos mediante la aplicación del método de tiempo de tránsito en los datos de imagen de resonancia magnética de velocidad codificada 5 y señales de impulsos Doppler-6. Sin embargo, el valor de la VOP obtenida con estos métodos es una evaluación regional de la rigidez arterial. De hecho, representa un valor medio, lo que representa para diferentes arterias en términos de tamaño y propiedades elásticas. Además, este tipo de evaluaciones requieren la evaluación de la distancia entre los dos sitios de mediciones que es una fuente de error que podrían influence el resultado final.
VOP puede evaluarse usando el diámetro velocidad (lnD-V) de bucle 7. Este método se basa en la evaluación simultánea de valores de diámetro y de velocidad de flujo en un recipiente seleccionado. Según este enfoque, el bucle lnD-V se obtiene por valores de diámetro logaritmo natural de trazado vs valores de velocidad media y la VOP se estima mediante el cálculo de la pendiente de la parte lineal del lazo obtenido correspondiente a la fase sistólica temprana. Con respecto a la aplicación práctica de este método, trabajos previos ya han informado sobre los resultados de su aplicación en un sistema de puesta a punto 7 in vitro y su uso para la evaluación tanto de la carótida y femoral PWV en los seres humanos 8.
El objetivo principal del presente estudio es proporcionar una descripción detallada de un algoritmo de procesamiento de imágenes que proporciona una medición de la VOP arterial no invasiva en ratones usando US sólo imágenes. El enfoque propuesto permite la evaluación de la rigidez arterial local mediante los medios del tratamiento tanto de modo B y Doppler de onda pulsada-(PW-Doppler) imágenes y se puede aplicar sobre las arterias de importancia clave, tales como la aorta abdominal.
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Protocol
Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la Directiva Europea (2010/63 / UE) y la ley italiana (D.Lvo 26/2014), y se siguieron los principios de cuidado de los animales de laboratorio. El Comité de aprobación ética local aprobó el estudio.
1. Procedimiento Imaging
- Coloque el ratón en una cámara de inducción de anestesia llenado de 2,5% de isoflurano en 1 L / min de oxígeno puro. Comprobar la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta a la pizca dedo del pie.
- Colocar el animal en una tabla de temperatura controlada en una posición supina. Humedecer los ojos del animal con colirio, con el fin de evitar que el funcionamiento en seco. Suministrar el flujo de gas anestésico (1,5% de isoflurano) mediante la colocación de la nariz del ratón en el cono de la nariz dedicado. Si es necesario, ajustar el porcentaje de isoflurano de un caso a otro, dependiendo del animal en estudio. Fijar la temperatura de la placa a 40 ° C.
- Recubrir las cuatro extremidades del animal con pasta conductora y papeles pegados en los electrodos de ECG incrustados en eltablero. Medir la temperatura corporal con una sonda rectal lubricado con vaselina. Compruebe que todas las mediciones fisiológicas (ECG y la señal de respiración, así como la temperatura) se adquieren y se muestran correctamente.
- Quitar el pelo químicamente del abdomen con crema depilatoria y cubrir con gel de acoplamiento acústico.
- Coloque el (13-24 MHz) de la sonda estadounidense en el brazo mecánico.
- Fijar la sonda paralela de Estados Unidos para el animal y ajustar su posición con el fin de obtener imágenes longitudinales de la aorta abdominal con la región de interés situado en la zona focal.
- Recoger información anatómica.
- Haga clic en el botón que permite la alta velocidad de fotogramas de adquisición 9 ECG-gated, elija una adquisición de frecuencia de imagen igual a 700 fps y comenzar la adquisición. Nota: En este modo las imágenes anatómicas del vaso relacionado a un solo ciclo cardiaco se pueden adquirir.
- Recoger información de la velocidad de flujo. </ Strong>
- Utilizando la misma proyección de exploración, haga clic en el botón PW-Doppler, coloque el volumen de la muestra en el centro del recipiente y adquirir imágenes que aseguren que el bucle de cine no es de menos de 3 s. Obtener estos datos, manteniendo la corrección del ángulo lo más pequeño posible, ajustándolo de caso a caso sobre la base de la proyección de EE.UU. obtenido.
- Retire el animal de la placa de temperatura controlada y esperar a que la recuperación completa.
NOTA: En nuestra experiencia, esto toma alrededor de 10 minutos. No deje desatendida y animal hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
2. Posprocesado
- Exportación modo B y Doppler PW-imágenes como archivos DICOM y guardarlos en un ordenador personal. Conversor de archivos PW-Doppler DICOM de imágenes .tiff.
- Proceso de imágenes en modo B.
- Importe el archivo DICOM correspondiente utilizando la interfaz de usuario gráfica dedicada (GUI).
- Para inicializar contornos, dibuja una línea cerca de la pared del fondo del recipiente (un solo clic para ponerlo en marcha y haga doble clic para acabar con ella) y haga doble clic cerca de la pared cerca. Una línea paralela a la cerca de la pared del fondo aparecerá automáticamente. Aplicar el algoritmo en un único marco pulsando el botón "Analyse".
- Comprobar el resultado. Si los bordes se han identificado correctamente (es decir., La evolución de los puntos inicializados han detectado tanto en la parte posterior y la pared anterior), aplicar el algoritmo en el conjunto de cine loop haciendo clic en el botón "GO". Si los bordes no están correctamente identificados, claro ellos haciendo clic en "Borrar contorno" e inicializar de nuevo en el punto 2.2.2 repetir.
NOTA: El algoritmo se basa en técnicas de rastreo de detección de bordes y curvas de nivel y se ha descrito anteriormente en detalle 10. - Obtener el resultado final pulsando sobre el botón "RECORD" y guardar el corrESPONDER .mat archivo que contiene valores de diámetro instantáneas relacionadas con un solo ciclo cardiaco.
- Abra la interfaz gráfica de usuario para la ejecución del bucle lnD-V.
- Haga clic en el botón de "velocidad" con el fin de iniciar el procesamiento de imágenes Doppler PW-que conduce a un solo latido curva de velocidad significar.
- Identificar la traza PW-Doppler y busque la línea que corresponde a un valor de velocidad igual a cero presionando el botón de llamada "línea blanca".
- Realizar la calibración de la velocidad y el tiempo de calibración utilizando los botones "TIME" "velocidad" y (en el panel de calibración), respectivamente. Al pulsar sobre estos botones permite dibujar una línea cuya longitud corresponde al factor de calibración introducida.
- seleccionar manualmente un retorno de la inversión que contiene las señales fisiológicas utilizando el botón "ROI PHYSIO".
- seleccionar manualmente un retorno de la inversión que contiene la traza PW-Doppler pulsando el botón de "retorno de la inversión SEÑAL".
- Click en el botón "Analyse" y compruebe si se ha identificado el sobre. Si el resultado no es satisfactorio, cambiar el umbral (escribiendo el nuevo valor en el campo de texto "umbral de velocidad" editable) y pulse el botón "Analyse" de nuevo. Sintonizar el umbral de un caso a otro, dependiendo de la calidad de las imágenes. Presione el botón "ELABORACIÓN".
- Localiza el R-picos de la señal de ECG y dividir la señal de velocidad de la envolvente en consecuencia haciendo clic en el botón "Actualizar". Elija latidos que no están corrompidos por ruido o se encuentran en la fase de inspiración haciendo clic en el botón "Elegir GOLPES". De esta manera, obtener un solo latido significa onda de velocidad.
- Utilice la Transformada Rápida de Fourier método para interpolar los latidos seleccionados en el dominio de la frecuencia y hacer que todas compuestas del mismo número de puntos, como se detalla en referencia 11. Realizar esta operación de forma automática con sólo pulsar el returna clave en el teclado de PC una vez que los latidos han sido seleccionados. Si la casilla de verificación "velocidad media" se comprueba el único latido significa señal de velocidad se consigue dividiendo la curva de la velocidad máxima en dos, la hipótesis de un perfil de velocidad parabólico 12. Presione el botón "OK".
- Haga clic en el botón "diámetro". Interpolar la forma de onda de diámetro de un solo golpe en el dominio del tiempo con el fin de obtener una señal de diámetro de un solo golpe con la misma frecuencia de muestreo que la señal de velocidad de un solo latido pulsando el botón "Interpolar". Haga clic en el botón "OK".
NOTA: Con el fin de tener el diámetro de un solo golpe y la media de curvas de velocidad con la misma frecuencia de muestreo y el mismo número de puntos de datos, que se interpolan en el dominio de la frecuencia. - Seleccionar el enfoque de "segunda derivada" como método de alineación (por encima de la gráfica que representa las formas de onda de diámetro y velocidad) y haga clic en el botón c "UPDATE"norte. Las dos curvas serán automáticamente alineada en el tiempo con el segundo método derivado 14.
- Construir el último bucle lnD-V trazando el logaritmo natural de los valores de diámetro de un solo golpe contra el único latido valores de velocidad media. Esto se hace automáticamente cuando las dos formas de onda están alineados. Nota: Los puntos incluidos entre el 5% y el 90% del valor máximo de la solo-beat significan curva de velocidad están situados de forma automática y se aplica una interpolación lineal en estos puntos para evaluar la pendiente de la parte lineal del bucle.
- Calcular la VOP de acuerdo con la siguiente ecuación 7
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Representative Results
El enfoque propuesto se ha aplicado a los ratones aorta abdominal en un estudio previo 11. Las siguientes figuras muestran los resultados de la aplicación del enfoque descrito en las imágenes ratones reales. Estos datos son de un solo animal (ratones de tipo salvaje, 13 semanas de edad, cepa: C57BL6, peso: 33 g) En particular, la figura 1 representa el resultado del análisis de las imágenes de los Estados Unidos. técnicas de detección de bordes y la adaptación al suelo aplicadas a las imágenes en modo B adquiridos con la alta velocidad de cuadro ECG-modalidad de proporcionar la forma de onda de diámetro; Por otra parte, la identificación de la envolvente de la señal Doppler PW-conduce a la de un solo latido significa evaluación curva de velocidad. La evaluación de la de un solo latido significa ondas de velocidad incluye la media de los datos de diferentes ciclos cardiacos. Para muestran los datos, la desviación estándar de las curvas de velocidad (calculado como el promedio de la desviación estándar obtenida encada punto de tiempo) es 0,0137 m / s.
De diámetro y la media de la onda de velocidad de un solo golpe se interpolan tanto en el dominio de la frecuencia y la hora y luego alineadas en el tiempo (Figura 2A). El bucle lnD-V se obtiene mediante el trazado de los valores de diámetro logaritmo natural frente a las mediciones de la velocidad media, como se muestra en la Figura 2B. VOP se evaluó mediante el cálculo de la pendiente de la parte lineal del bucle, que se sabe que corresponden a la fase sistólica temprana. Esta porción se identifica automáticamente como la que corresponde a la pendiente de subida de la curva de velocidad media. Estas cifras indican que las operaciones de procesamiento de imágenes requeridas para la aplicación de la técnica propuesta conduce a un bucle final de lnD-V que es similar a la obtenida en los seres humanos utilizando un enfoque similar 7. Esto sugiere que esta técnica podría representar una alternativa válida para la evaluación de la VOP no invasiva en ratones.
Figura 1: Procesamiento de Imágenes PW-Doppler en modo B y. Imágenes en modo B (a) se procesan utilizando técnicas de detección de bordes y la adaptación al suelo. Imágenes PW-Doppler (b) se procesan para la identificación de la señal de la envolvente de la que significa que el único latido se obtiene onda de velocidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Aplicación de lnD V-Loop para el cálculo VOP. De diámetro y la media de la onda de velocidad obtenidos de modo B y procesamiento de imágenes PW-Doppler. (A). El bucle lnD-V se obtiene representando gráficamente la Logari naturalesthm de los valores de diámetro en contra de los valores medios de velocidad (b). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, un algoritmo de procesamiento de imágenes basado en el bucle lnD-V para la evaluación de la VOP en ratones se ha descrito en detalle. El enfoque propuesto se basa en el procesamiento de imágenes de los Estados Unidos solamente y, por lo tanto, podría representar una alternativa válida a las técnicas existentes 6, 13 para la evaluación de la rigidez arterial en modelos de ratón. De hecho, por el contrario a los métodos invasivos 6 que se basan en la adquisición de señales de presión intra-arteriales y requieren el animal a ser sacrificado, esta técnica es completamente no invasiva y, por lo tanto, puede ser particularmente adecuado en el caso de estudios longitudinales. Además, proporciona una evaluación de la rigidez arterial que es local y no regional. A pesar de que se conoce el método propuesto para ser influenciado por la onda reflejada 15, puede proporcionar una evaluación más precisa VOP con respecto a otros enfoques basados en Estados Unidos para PW localesEvaluación de V, tal como el basado en la técnica de flujo de la zona 13 que requiere la adquisición de datos de flujo de color en la proyección de la sección transversal. El valor de la VOP se muestra en la sección "Los resultados representativos", igual a 1,69 m / seg, está en línea con lo que se informa en la referencia 11: de hecho, en este estudio, abdominal VOP de la aorta era igual a 1,91 ± 0,44 m / seg en ratones adultos y 2,71 ± 0,63 m / seg en los animales viejos.
Con el fin de minimizar los errores en las evaluaciones de la VOP, gran atención tiene que ser pagado en la adquisición de imágenes de Estados Unidos. En particular, las imágenes B en modo deben ser adquiridos con paredes anterior y posterior muy claras con el fin de lograr una curva de diámetro que no está corrompida por ruido. Con respecto a las imágenes PW-Doppler, la corrección del ángulo debe ser minimizado. El valor de 60 grados puede representar, en la mayoría de los casos, un buen compromiso entre una buena vista eje largo y una buena aproximación de componentes de la velocidad. FurthermoRe, en el caso de estudios longitudinales con mediciones repetidas, se debe tener cuidado en la formación de imágenes del recipiente de la misma manera, es decir, con la misma proyección de exploración.
La principal limitación de este enfoque presentado se refiere al hecho de que las imágenes necesarias para el diámetro y la media de las evaluaciones de forma de onda de velocidad no se adquieren simultáneamente. Esta falta de simultaneidad puede representar una fuente de error para la evaluación de la VOP y hacer la medición menos precisa. Además, una adquisición simultánea real sería garantizar una mejor alineación de tiempo entre las dos curvas y evitar problemas relacionados con la variabilidad del ritmo cardíaco. Desde un punto de vista práctico, otra limitación podría ser la falta de disponibilidad de la modalidad sincronizada con ECG de alta velocidad de fotogramas. Este problema puede superarse parcialmente mediante la adquisición de imágenes en modalidad de modo B y el ajuste de los parámetros de adquisición con el fin de lograr la más alta resolución temporal. En este caso, la señal de diámetro debeser dividido por la base de ECG y procesado en la misma forma que la señal de velocidad, a fin de obtener una forma de onda solo diámetro ritmo. Sin embargo, en algunas condiciones, la resolución temporal obtenida no será apropiado para lograr una señal de diámetro válido. Las eventuales modificaciones de la cadena de procesamiento de imágenes destinado a superar estas limitaciones podrían mejorar la técnica y dar lugar a una evaluación más precisa de la rigidez arterial local.
Las futuras aplicaciones del enfoque presentado se referirían a otros distritos arteriales. Efectivamente, gracias al hecho de que requiere la adquisición de modo B y sólo imágenes PW-Doppler, este método se puede aplicar fácilmente a otros sitios arteriales, tales como la arteria carótida, proporcionando así una evaluación de la rigidez arterial multi-sitio. Una sonda de frecuencia más alta debe ser elegido para las arterias más superficiales, tales como la carótida común; en cualquier caso, la elección de la sonda debe garantizar la correcta visualización de la arteria para tél los animales en el estudio. En conclusión, el sistema descrito puede ofrecer una forma sencilla de evaluar las propiedades funcionales de diferentes arterias en modelos de ratón.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Ninguna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VEVO2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound equipment | |
| MS250 Ultrasound Probe | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound probe | |
| EKV Software | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | Software | |
| Matlab R2015a | MathWorks Inc, Natick, MA, USA | Software | |
| Conductive Paste | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Petroleum Jelly | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Depilatory Cream | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Acoustic Coupling Gel | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Developed Matlab Software | The authors are willing to collaborate with those researchers who are interested in the software and to make the software available under their supervision |
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