Summary
動脈硬化は、動脈硬化の代理指標と考えることができ、心血管疾患とパルス波速度（PWV）の重要な要素を表します。このプロトコルは、異なる動脈部位に適用された超音波画像処理に基づいて、マウスにおいてPWVを算出するための画像処理アルゴリズムを記述する。
Abstract
動脈硬化は、脈波伝播速度（PWV）、 すなわち 、脈波管容器内で移動する速度を計算することにより評価することができます。このパラメータは、ますます、特定の遺伝子型/治療に関連血管機能の変化を評価するために、または心血管疾患の進行を特徴付けるために使用される小型の齧歯類モデルで研究されています。このプロトコルは、超音波（US）画像のみを使用して、マウスでの非侵襲的動脈PWV測定につながる画像処理アルゴリズムを説明します。本手法は、マウスの腹大動脈のPWVを評価し、その年齢に関連した変化を評価するために使用されています。
腹部大動脈米国スキャン高周波米国プローブを備えた特定のUS装置を用いて、気体麻酔下マウスから得られます。 Bモードとパルス波ドプラ（PWドプラ）の画像は、それぞれ、直径を求め、速度の瞬時値を平均するために分析されています。この目的のために、エッジ検出や輪郭追跡技術が採用されています。シングルビートは、直径と速度波形が時間直径-速度（LND-V）ループを実現するために整列され、組み合わされている意味します。 PWV値は、初期の収縮期に対応するループの直線部分の傾きから得られます。
本発明の方法を用いて、マウスの腹部大動脈約解剖学的及び機能的情報を非侵襲的に達成することができます。 US画像の処理を必要とするだけで、その弾性特性の点で、マウスにおける異なった動脈部位の非侵襲的な特徴付けのために有用なツールを表すことができます。本技術の適用は容易従って、マルチサイト動脈硬化の評価を取得する可能性を提供し、そのような頸動脈のような他の血管の地区に拡張することができます。
Introduction
マウスモデルは、ますます、心血管疾患（CVD）の調査のために使用され、特に、疾患の発症1の異なる相の特徴付けを可能にする長手方向の研究に使用されています。大動脈の弾性特性は異なる病理学的状態に関連しています。技術的な観点から、動脈硬化は、パルス波が導管容器2内を移動する速度を表す脈波伝播速度（PWV）を測定することによって評価することができます。理由は、その臨床的重要性は、ますますも前臨床小動物モデル3で測定されます。
異なる技術は、マウスにおけるPWVを評価するために利用可能です。侵襲的なアプローチは、カテーテル先端の圧力変換器の使用に基づいています。 PWVは、二つの異なる動脈部位に圧力信号を取得する二つの測定の間の距離を割ることによって評価されます信号4との間の時間シフトによってITES。技術のこれらの種類に関連する主な欠点は、2つの測定位置と、従って、縦研究に使用することができないとの間の距離を評価するための動物の犠牲を必要とすることです。この制限を克服するために、異なる画像化技術に基づく非侵襲的なアプローチが、開発されています。以前の研究は、速度エンコードされた磁気共鳴画像データ5とパルスドップラー信号6の通過時間法を適用したマウスにおいて、PWVの評価を報告しています。しかしながら、これらの方法で得られたPWV値は、動脈硬化の地域の評価です。実際には、大きさや弾性特性の点で異なる動脈を占め、平均値を表しています。また、評価のこれらの種類はinfができ、エラーの原因である二つの測定部位間の距離の評価を必要とします最終的な結果をluence。
PWVは、直径、速度（LND-V）ループ7を用いて評価することができます。この方法は、選択された容器の直径及び流速値の同時評価に基づいています。この手法によれば、LND-Vループは自然対数の直径の値をプロットした対速度値を平均し、PWVは、早期収縮期に対応して得られたループの直線部分の傾きを計算することによって推定されます。この方法の実用化に関しては、以前の作品は、すでにin vitroでのセットアップシステム7への応用と人間8の両方の頸動脈および大腿PWVの評価のためのその使用に関する結果を報告しています。
本研究の主な目的は、Uを用いて、マウスにおいて非侵襲的動脈PWV測定値を提供する画像処理アルゴリズムの詳細な説明を提供することですS映像のみ。提案されたアプローチは、Bモードとパルス波ドップラー（PW-ドップラー）画像の両方の処理により、局所動脈硬化を評価することができ、そのような腹部大動脈として、重要な鍵の動脈に適用することができます。
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Protocol
動物実験は、欧州指令（2010年版/ 63 / UE）、イタリア法（D.Lvo 2014分の26）に従って行われ、それが実験動物ケアの原則に従いました。地域の倫理承認パネルが試験を承認しました。
1.イメージング手順
- 1リットル/分純酸素中の2.5％イソフルランで満たされた麻酔導入チャンバー内にマウスを置きます。つま先のピンチに無反応によって麻酔の深さを確認してください。
- 仰臥位で温度制御された基板上の動物を置きます。ドライ実行しているそれらを回避するために、眼軟膏で動物の目を湿ら。専用のノーズコーンにマウスの鼻を配置することによって、麻酔ガスの流れ（1.5％イソフルラン）を供給する。必要に応じて、研究対象の動物に応じて、ケースにケースからイソフルランの割合を調整します。 40℃の基板温度を修正しました。
- コートに埋め込まれたECG電極上に導電性ペーストやテープそれらを持つ動物の四肢ボード。ワセリンで潤滑直腸プローブで体温を測定します。すべての生理学的測定（ECGおよび呼吸信号だけでなく、温度）が正しく取得されて表示されることを確認してください。
- 脱毛クリームと音響結合ゲルとコートをして腹部から化学的に髪を削除します。
- メカニカルアームに（13-24 MHz）の米国のプローブを配置します。
- 動物への米国のプローブの並列を修正し、焦点ゾーンに位置する関心領域と腹部大動脈の長手方向の画像を得るために、その位置を調整します。
- 解剖学的情報を収集します。
- 高フレームレート、心電同期獲得9を可能にするボタンをクリックして、700 fpsのに等しいフレームレート取得を選択し、取得を開始します。注：この方法では、単一の心周期に関連する血管の解剖学的画像を取得することができます。
- 流速の情報を収集します。</強いです>
- 同じスキャン投影を使用して、PW-ドップラーボタンをクリックして、血管の中心にサンプルボリュームを配置し、シネループが3秒より短くはないことを保証する画像を取得します。これらのデータは、できるだけ小さい角度補正を維持し得た米国の投影に基づいて事例にケースからそれを調整し得ます。
- 温度制御ボードから動物を削除し、完全な回復を待ちます。
注：我々の経験では、これは約10分かかります。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人のままにして、動物しないでください。
2.後処理
- DICOMファイルとしてエクスポートBモードとPW-ドップラー画像やパソコン上に保存します。 .TIFF画像にPW-ドップラーDICOMファイルを変換します。
- 工程Bモード画像。
- 専用のグラフィカルユーザインタフェース（GUI）を使用して、対応するDICOMファイルをインポートします。
- 、輪郭を初期化する（それを起動するためのシングルクリック、ダブルクリック、それを終了させるための）容器の奥の壁に近く、ライン描画するには近くの壁に近いダブルクリックします。奥の壁にその近くに平行な線が自動的に表示されます。 「ANALYSE」ボタンを押すことにより、単一のフレーム上のアルゴリズムを適用します。
- 結果を確認してください。エッジが正しく同定されている場合（ すなわち 、初期化されたポイントの進化は後部と前壁の両方を検出した）、「GO」ボタンをクリックすることで、全体シネループ上のアルゴリズムを適用します。エッジが正しく識別されていない場合は、「クリア輪郭」をクリックすることで、それらをクリアし、ポイント2.2.2を繰り返すことによって、それらを再度初期化します。
注：このアルゴリズムは、エッジ検出や輪郭追跡法に基づいており、以前に詳細10に記載されています。 - 「RECORD」ボタンを押すことによって、最終的な結果を取得し、CORRを保存単一の心周期に関連した瞬間直径値を含む.MATファイルをesponding。
- LND-Vループの実装のためのGUIを開きます。
- ベロシティカーブを意味し、シングルビートにつながるPWドップラー画像処理を開始するために、「VELOCITY」ボタンをクリックします。
- PW-ドップラー・トレースを確認し、「WHITE LINE」ボタンを押して、ゼロに等しい速度値に対応する行を見つけます。
- それぞれ、（キャリブレーションパネルで）「VELOCITY」と「TIME」ボタンを使用して、速度キャリブレーションと時間のキャリブレーションを実行します。これらのボタンを押すと1は、その長さが挿入されたキャリブレーション係数に対応する線を描画することができます。
- 手動で「ROIの生理」ボタンを使って、生理的信号を含むROIを選択します。
- 手動で「ROI SIGNAL」ボタンを押して、PW-ドップラートレースを含むROIを選択します。
- CLI「ANALYSE」ボタンをCKとエンベロープが識別されているか確認してください。結果が得られない場合は、（「速度閾値「編集可能なテキストフィールドに新しい値を入力して）、閾値を変更して再度「ANALYSE」ボタンを押してください。画像の品質に応じてチューニングし、場合にしきい値、。 「精緻化」ボタンを押してください。
- ECG信号のRピークの位置を確認し、「UPDATE」ボタンをクリックすることで、それに応じて速度包絡線信号を分割します。ノイズによって壊れているか、「CHOOSE BEATS」ボタンをクリックすることで、吸気相に配置されていないビートを選択してください。このようにして、単一ビート速度波形を意味得ます。
- 周波数領域で選択したビートを補間し、それらのすべてが参照11で詳述したように同じ数の点からなるようにする方法を、高速フーリエ変換を使用してください。単にRETを押すことで、自動的にこの操作を実行ビート一度PCキーボード上の壷キーが選択されています。 「平均速度」チェックボックスが単一のビートをチェックされている場合平均速度信号は、放物線状の速度プロファイル12を仮定し、2によって最大速度曲線を分割することによって達成されます。 「OK」ボタンを押してください。
- 「直径」ボタンをクリックします。 「INTERPOLATE」ボタンを押すことにより、シングルビート速度信号と同じサンプリング周波数を有する単一のビート直径信号を得るために、時間領域における単一ビート直径波形を補間します。 「OK」ボタンをクリックします。
注：単一のビートの直径を有し、同一のサンプル周波数とデータポイントの同じ数の速度曲線を意味するために、それらは周波数領域において補間されます。 - （直径と速度波形を表示するグラフの上）アライメント方式として「第二次誘導体」アプローチを選択し、「UPDATE」buttoをクリックしてくださいn個。 2つの曲線が二次微分法14を使用して自動的に時間整列されます。
- シングルビートに対するシングルビート直径値の自然対数をプロットすることにより、最終的なLND-Vループを構築するには、速度値を意味します。 2つの波形が並んでいるときにこれが自動的に行われます。注：5％シングルビートの最大値の90％の間に含まれる点が速度曲線を自動的に配置され、これらの点の線形補間は、ループの直線部分の傾きを評価するために適用されるわけ。
- 以下の式7に従ってPWVを計算します
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Representative Results
提案されたアプローチは、以前の研究11匹のマウスの腹部大動脈に適用されています。次の図は、実際のマウスの画像に記載されたアプローチの適用の結果を示します。これらのデータは、1匹の動物（：C57BL6、重量：13週齢の野生型マウス、株33 G）からのものである。特に、 図1は、米国の画像の解析の結果を表します。高フレームレートECGゲーティングモダリティで取得Bモード画像に適用されたエッジ検出と輪郭追跡技法は、直径波形を提供します。一方、PWドップラー信号の包絡線の識別は、速度曲線の評価を意味する単一のビートをもたらします。シングルビートの評価速度波形を意味するが、異なる心周期からのデータの平均値を含みます。示したデータは、速度曲線の標準偏差を（で得られた標準偏差の平均値として計算します各時点）は0.0137メートル/秒です。
シングルビート径と平均速度波形は、周波数と時間領域と、時間整列（ 図2A）の両方に補間されます。 図2Bに示すように、LND-Vのループは、自然対数の直径値対平均速度の測定値をプロットしたものです。 PWVは、初期の収縮期に対応することが知られているループの直線部分の傾きを計算することによって評価されます。この部分は、自動的に、平均速度曲線の上り勾配に対応するとして識別されます。これらの図は、提案された技術の実装に必要な画像処理操作は同様のアプローチ7を用いて、ヒトにおいて得られたものと同様であり、最終LND-Vのループをもたらすことを示しています。これは、この技術は、マウスにおいて非侵襲PWVの評価のための有効な代替手段を表すことができることを示唆しています。
図1：BモードとPW-ドップラー画像の処理。 Bモード画像（A）は、エッジ検出及び輪郭追跡技術を使用して処理されます。 PWドップラー画像（B）は、単一のビートは速度波形が得られる平均れる包絡線信号の識別のために処理されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：PWVの計算のためのLND-Vループの実装。 BモードとPWドップラー画像処理から得られた直径及び平均速度波形。 （A）。 LND-Vのループは、天然logariをプロットしたものです平均速度値（B）に対する直径値のTHM。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この研究では、マウスでPWV評価のLND-Vのループに基づいて、画像処理アルゴリズムを詳細に説明してきました。提案されたアプローチは、米国の画像処理に基づいてのみ、したがって、既存の技術6、マウスモデルにおける動脈硬化の評価のために13への有効な代替物を表すことができます。実際には、逆に動脈圧力信号の取得に基づいて屠殺される動物を必要とする侵襲的な方法6に、この技術は、完全に非侵襲的であり、従って、縦方向の研究の場合に特に好適であり得ます。また、地域や地方のない動脈硬化の評価を提供します。提案される方法は、反射波15によって影響されることが知られているが、それはローカルPWのために他の米国ベースのアプローチに対するより正確なPWVの評価を提供することができますこのような断面の投影におけるカラーフローデータの取得を必要とする流れ面積技術13に基づいて、そのようなV評価。 1.69メートル/秒に等しい「代表的な結果」セクションに示すPWV値は、参照11で報告されているものに沿ったものである：実際には、この研究では、腹部大動脈PWVは1.91±0.44メートル/秒でに等しかったです成体マウスと古い動物では2.71±0.63メートル/秒。
PWV評価の誤差を最小にするために、大きな関心は、米国の画像を取得する際に支払わなければなりません。具体的には、Bモード画像は、ノイズによって破損していない直径曲線を達成するために、非常に明確な前方および後方壁を用いて取得されるべきです。 PWドップラー画像に関しては、角度補正が最小化されるべきです。 60度の値は、ほとんどの場合、良好な長軸図及び速度成分の良好な近似との間の良好な妥協点を表すことができます。 Furthermo再、繰り返し測定との長期的な研究の場合には、注意が同じスキャン投影して、 すなわち 、同じように血管を画像化するに取られるべきです。
提示されたアプローチの主な制限は、画像が直径のために必要と速度波形の評価が同時に取得されていない意味という事実に関するものです。同時性の欠如は、PWVの評価のため、エラーの原因を表し、測定はあまり正確に行うことができます。また、実際の同時取得は、二つの曲線間のより良好な時間的整合性を保証し、心拍変動に関連する問題を回避します。実用的な観点からは、別の制限は、高フレームレート心電図同期モダリティの利用可能性の欠如である可能性があります。この問題は、部分的に、Bモードのモダリティの画像を取得し、最高の時間分解能を達成するために取得パラメータを調整することによって克服することができます。この場合、直径信号べきECGベースで割り、単一ビート直径波形を得るためには、速度信号と同様に処理されます。しかし、いくつかの条件で、得られた時間分解能は、有効直径信号を達成するために適切ではないだろう。これらの制限を克服することを目的とした画像処理チェーンの将来の変更は、技術を改善し、局所動脈硬化のより正確な評価につながります。
提示されたアプローチの将来のアプリケーションは、他の動脈の地区に関係するだろう。事実上、それが唯一のBモードとPWドップラー画像の取得を必要とするという事実のおかげで、この方法は、容易にこのように、マルチサイト動脈硬化の評価を提供し、そのような頸動脈のような他の動脈の部位に適用することができます。より高い周波数のプローブは、総頸動脈などのより浅動脈に選択しなければなりません。いずれの場合においても、プローブの選択は、tについて、動脈の正確な視覚化を保証すべきです研究では、彼の動物。結論として、記載されたシステムは、マウスモデルにおいて異なる動脈の機能特性を評価するための簡単な方法を提供するかもしれません。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
なし。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VEVO2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound equipment | |
| MS250 Ultrasound Probe | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound probe | |
| EKV Software | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | Software | |
| Matlab R2015a | MathWorks Inc, Natick, MA, USA | Software | |
| Conductive Paste | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Petroleum Jelly | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Depilatory Cream | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Acoustic Coupling Gel | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Developed Matlab Software | The authors are willing to collaborate with those researchers who are interested in the software and to make the software available under their supervision |
References
- Zaragoza, C., et al.
- Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
- Wang, Y. X., et al. Increased aortic stiffness assessed by pulse wave velocity in apolipoprotein E-deficient mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278, 428-434 (2000).
- Mitchell, G. F., Pfeffer, M. A., Finn, P. V., Pfeffer, J. M. Comparison of techniques for measuring pulse-wave velocity in the rat. J Appl Physiol. 82 (1), 203-210 (1997).
- Parczyk, M., Herold, V., Klug, G., Bauer, W. R., Rommel, E., Jakob, P. M. Regional in vivo transit time measurements of aortic pulse wave velocity in mice with high-field CMR at 17.6 Tesla. J Cardiovasc Magn Reson. 12, 72 (2010).
- Hartley, C. J., Taffet, G. E., Michael, L. H., Pham, T. T., Entman, M. L. Noninvasive determination of pulse-wave velocity in mice. Am J Physiol. 273 (1), Pt 2 494-500 (1997).
- Feng, J., Khir, A. W. Determination of wave speed and wave separation in the arteries using diameter and velocity. J Biomech. 43 (3), 455-462 (2010).
- Borlotti, A., Khir, A. W., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., Vermeersch, S., Segers, P. Noninvasive determination of local pulse wave velocity and wave intensity: changes with age and gender in the carotid and femoral arteries of healthy human. J Appl Physiol. 113 (5), 727-735 (2012).
- Chérin, E., et al. Ultrahigh frame rate retrospective ultrasound microimaging and blood flow visualization in mice in vivo. Ultrasound Med Biol. 32 (5), 683-691 (2006).
- Gemignani, V., Faita, F., Ghiadoni, L., Poggianti, E., Demi, M. A system for real-time measurement of the brachial artery diameter in B-mode ultrasound images. IEEE Trans Med Imaging. 26 (3), 393-404 (2006).
- Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Sicari, R., Faita, F. Non-invasive assessment of pulse wave velocity in mice by means of ultrasound images. Atherosclerosis. 237 (1), 31-37 (2014).
- Nichols, W. W., O'Rourke, M. F. McDonald's Blood Flow in Arteries: Theoretical, Experimental, and Clinical Principles. , Arnold. London. 215-358 (1998).
- Williams, R., et al. Noninvasive ultrasonic measurement of regional and local pulse wave velocity in mice. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1368-1375 (2007).
- Penny, D. J., et al. Aortic wave intensity of ventricular-vascular interaction during incremental dobutamine infusion in adult sheep. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294, 481-489 (2008).
- Segers, P., et al. Wave reflection leads to over- and underestimation of local wave speed by the PU- and QA-loop methods: theoretical basis and solution to the problem. Physiol Meas. 35 (5), 847-861 (2014).
