Introduction
Polymer mikromatriser er miniatyrisert high-throughput plattformer hvor opptil 7000 polymerer 1 er trykt på glassplater for parallell analyse med prokaryote eller eukaryote celler 2. Metoden som presenteres her bygger på det som vi først beskrevet i 2010 tre. Denne screening systemet har blitt brukt på mange celletyper, inkludert humane hepatocytter 4, stamceller 5, tubulære epitelceller 2, bakterier 3,6 og protozo patogener 7. I hvert tilfelle, ble polymerer som fremmer eller motstår binding av cellene som undersøkes identifisert åtte. Komplekser av DNA med syntetiske polykationiske polymerer er også blitt brukt i mikromatriseformat for high-throughput screening av genet transfeksjonsteknikker kandidater 9. I tillegg til å utvelge for celle-substrat interaksjoner, har polymer mikromatriser også blitt anvendt for å vurdere materialegenskaper 10.
"> Muligheten av syntetiske polymerer for å modulere festing av bakterier til en overflate er vel etablert 3,6,11. Mange faktorer, inkludert ladning, hydrofobisitet og overflateruheten av polymeroverflaten er kjent for å påvirke bakteriebinding. De konvensjonelle metoder for å oppdage biomaterialer som motstår binding av bakterier gjennom sekvensielt eller empirisk utforme og teste et materiale på en gang er arbeidskrevende, kostbar og tidkrevende prosesser. Polymer mikromatriser tilby et attraktivt alternativ for å omgå slike begrensninger.Overflatetilknyttet bakterier vokse som en kompleks populasjon betegnet som en biofilm - slike biofilmer er svært motstandsdyktig mot mange miljømessige påkjenninger og antibiotika. Dette er delvis på grunn av deres tette ekstracellulære matrise (sammensatt av proteiner, polysakkarider og nukleinsyrer) 12 og delvis på grunn av økt tilstedeværelse av robuste "persistor" celler i biofilmer 13. Althohuff de nøyaktige mekanismer for overflate krets og påfølgende biofilmdannelse er vanskelige å karakterisere, er det generelt antatt at det er tre forskjellige stadier av overflate vekst 14-16. Initial, reversible feste er etterfulgt av en sterkere adhesjon av celler, etablering av en biofilm ved produksjon av et ekstracellulært protein og polysakkarid-matriks og celleproliferasjon. Til slutt, de modne biofilm utgivelser frittlevende planktoniske celler som kan initiere nye infeksjoner andre steder. Bakterier vannavstøtende polymerer som hindrer den initielle festingen av bakterier, og dermed forebygge tidlige stadier av biofilmdannelse, som potensielt kan representere en utmerket løsning for å minimalisere infeksjoner. Gitt økningen av antibiotikaresistens (og også den iboende større motstand av overflateassosiert bakterier 12), antibiotika-fritt middel for å redusere infeksjoner er av spesiell interesse. I et sykehus, bakterieavvisende polymerbelegg kan ha en direkte medisinsk bruk i reduksjon av nosokomiale infeksjoner, som ofte danner rundt implanterte enheter 17.
Her er en high-throughput metode for screening av 381 polymerer for frastøtende aktivitet mot en rekke sykdomsfremkallende bakterier assosiert med nosokomiale infeksjoner, etterfulgt av hit validering og påfølgende belegg og analysen av sentralt venekateter materialer, beskrevet (figur 1). Kort fortalt ble polymerer prikket inn agarose-belagt glassplater ved kontakt trykking og etter tørking og sterilisering ble miniatyriserte arrays inkubert med klinisk viktige bakteriekulturer. Etter inkubering ble mikromatriser forsiktig vasket og adherente bakterieceller ble farget og visualisert ved fluorescens. Deretter ble polymerer som inhiberte bakterie binding undersøkt i større målestokk av belegg på glassdekkglass og visualisert ved elektronmikroskopi. valgt frastøteUtlånte polymerer ble deretter belagt på kommersielle katetre og vist seg å redusere feste av bakterier med nesten 100 ganger.
Protocol
1. Utarbeidelse av agaroseovertrukne Slides
MERK: Før fabrikere polymer mikromatriser er aminoalkylsilane-belagt glassplater belagt med agarose IB for å redusere ikke-spesifikk bakgrunn binding og tillate evaluering av polymerer som binder eller frastøte bakterier 6. Silane belegg letter bindingen av agarose til lysbildene.
- Utgjør en 2% (vekt / volum) oppløsning av agarose IB i destillert vann i en 250 ml flaske.
- Etter korking av flasken løst, varme opp suspensjonen i en mikrobølgeovn i 30 sekunder perioder inntil oppløsning. Pass på at hetten ikke er tett lukket for å unngå potensielle press bygge opp. Fjern flasken regelmessig og virvle forsiktig.
- Sørge for at det faste stoff er oppløst og oppløsningen er klar. Hell denne agarose løsning i et 100 ml begerglass og plasser i et 65 ° C vannbad for å opprettholde en flytende løsning.
- Dypp silane-belagt lysbilder inn i agarose løsning, som sikrer ensartet belegg, og wipe baksiden av lysbildet med silkepapir.
- Tørk lysbilder, med den belagte siden opp i et støvfritt miljø (for eksempel inne i et skap eller i avtrekk) i minimum 24 timer.
- Bekrefte et jevnt belegg ved visuell inspeksjon. Coating lett kan vurderes ved å puste inn på lysbildet - oppstår kondens på ubestrøket regioner. Bare lysbilder belagt helt og jevnt bør brukes for microarray utskrift.
2. Utarbeidelse av Polymer Løsninger for utskrift
- Fremstille oppløsninger (1% w / v) av et utvalg av på forhånd dannede polymerer bestående av polyakrylater, polyakrylamider og polyuretaner i N-metylpyrrolidon (NMP) i glassflasker. (Utarbeide 1 ml av hver polymer). Vortex inntil polymeren er fullstendig oppløst. Syntese av polymerer er beskrevet andre steder 6.
- Ved hjelp av en mikro-pipette, fylle hver brønn av en 384 mikrobrønnplate med 25 mL polymerløsning, som sikrer at det ikke er kryss contastemmelse og hver brønn inneholder et unikt polymer. Bruk NMP som en negativ kontroll i minst 2 brønner. Spill identiteten til polymerløsning i hver brønn på en godt plate mal eller regneark.
3. Skrive Polymer Mikromatriser Ved hjelp av en kontakt skriver
MERK: Utskrift av mikromatriser ble utført ved hjelp av en kontakt skriver. Spesifikke instruksjoner om polymer microarray utskriften er gitt nedenfor. For generelle retningslinjer for bruk av skriveren og sikkerhetsanbefalinger, følg bruksanvisningen fra produsenten. Selv om vi bruker en kontakt skriver, kan en passende manuell stampeanordning også anvendes.
- Som anbefales i skriveren bruksanvisningen, lage en rutine (se trinn 3.3) som tillater utskrift av 384 væsker (polymer løsninger eller NMP) i quadruplicates, ved hjelp av en 32-pin microarraying hode (arrangert som 8 rader og 4 kolonner).
- Skriv ut 1536 plasser arrangert som 48 rader og 32 kolonner. Programmere rutine å skrive ut i 12 avsnitts, altså., 32 løsninger på en gang, slik at skriveren kan stoppes etter utskrift hver seksjon for å tillate rensing av pins.
- Slik lager du en utskrift rutine:
- Åpne programvaren og fra de tilgjengelige alternativene velger "Opprett en ny rutine. Velg "Beskrivelse-kategorien til inngangs detaljene i forsøket. Velg fanen 'Head "og velge '32 -Pin microarraying hodet".
- Velg kategorien 'Kilde' og velge plate holder (kilde plate holder (1x5)), plate type (plate 384 x 6000), totalt plater (1) og kilde for (av søyler).
- I kategorien "Slide design ', velg' 3x1 '' lysbilde, og velg arraying av" Felt nummer '. Deretter velger oppstillingsmønster ". Input "Spot view" som "layout" og "Mønster dimensjoner 'som' Row count '(6),' Antall kolonner '(8),' Row pitch '(750) og' Kolonne pitch '(560). Velg en seksjon du vil skrive ut grant.
- I "Slide layout kategorien innspill antall lysbilder brukes til utskrift. Velg "Skriv ut" -kategorien for å legge inn utskriftsparametre (antall frimerker per håndskrift: 1, antall frimerker per sted: 5, stempling tid: 200 msek, -håndskriving tid: 100 msek).
MERK: En rutine er nå opprettet for å skrive ut 384 væsker (polymer løsninger eller NMP) i quadruplicates, ved hjelp av en 32-pin microarraying hode (arrangert som 8 rader og 4 kolonner). Totalt rutinen bør skrive 1536 spots arrangert som 48 rader og 32 kolonner med en rad stigning på 750 mikrometer og kolonne stigning på 560 mikrometer.
- Plasser agarose-belagt lysbilder på plattformen og sikre en god vakuum forsegling å holde skinnene på plass.
- Juster skriverhodet slik at alle pinnene er i samme høyde. Kontroller dette ved manuelt å senke mål til et objektglass, og bekrefter at pinnene beveger seg på samme tid. Hvis det er noen uoverensstemmelser med høyde, justere ved hjelp av erme på pinnen opp eller ned.
- Plasser godt plate på plate holderen i riktig retning, altså., Vel A1 er til øverst til høyre i holderen og sikre brønnen platen er festet skikkelig.
- Bruke høyden adjustor, sikre at høyden på platen holderen er slik at når plukke polymerløsninger, gjør pinnene ikke berøre bunnen av brønnene.
MERK: Dette er viktig for jevn polymer fange og også for å unngå søl av polymeroppløsninger inn i tilstøtende brønner, for derved å forårsake kryssforurensning. - Velg fanen "Start" og velg "Kjør type 'som' Normal '. Klikk "Kjør", og bekrefter at lysbildet, godt plate, etc., er på plass når du blir bedt.
- Skriv ut en del om gangen (32 løsninger på en gang, 12 seksjoner), slik at for rengjøring av pinnene mellom seksjonene. Rengjør pinnene grundig med tørkepapir dyppet i aceton, etterfulgt av tørr silkepapir for å sikre pinnene er helt tørre.
- Ved avslutning av trykking av mikromatriser, plassere dem i en lysbildeholder og tørk dem over natten i en vakuum-ovn innstilt på 45 ° C for å fjerne NMP i polymer flekker. Etter sterilisering med UV-lys i 30 minutter, de mikromatriser er klare for inokulering av bakterier.
- Før inokulering lysbilder med bakterier, ta en måling av bakgrunns fluorescens (som beskrevet i kapittel 5). Bruker denne målingen i beregningen av bakteriell binding.
4. Inokulering av Polymer Mikromatriser med bakterier
MERK: Sørg for god aseptisk teknikk. All håndtering av kulturer bør utføres i et sterilt miljø: enten ved hjelp av en Bunsen-brenner eller i en strømningshette. Kulturer bør dyrkes med oksygen tilgjengelighet, vekstmedium, og temperaturen justert til kravene i hver art.
- Forbered natten kulturer ved inokulering 5 ml Luria-Bertani kjøttkraft (LB: 10 g L -1 Bacto-trypton, 5 g L -1 NaCl og 10 g L <sup> -1 gjærekstrakt) med en koloni fra en plate. Inkuber over natten ved 37 ° C risting ved 200 rpm.
- Forbered fryser bestander av natten kulturer ved tilsetning av glyserol (10% konsentrasjon generelle) og lagre den lager ved -80 ° C.
- For å bestemme celle tall fra prøver av de tinte bakterielle aksjer, utføre serielle fortynninger av hvert lager og dyrke bakteriene over natten på faste medier. Nøyaktig bestemmelse av celletall i aksjer sikrer hensiktsmessig inokulering av hver art 6.
- Forbered inocula for microarray. Enkelt art kulturer dyrkes som ovenfor og påføres direkte på mikromatriser. BacMix-1 er en bakteriell blanding av Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) og Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 er en bakteriell blanding bestående av Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus K. pneumoniae og Enterococcus faecalis (E. faecalis).
- For å fremstille enten blandet kultur, bland nights i like volumer (3 ml hver) og fortynnet fire ganger med frisk LB (til ca. 50 ml sluttvolum).
- Plasser UV-steriliseres polymer mikromatriser i rektangulære 4-brønners plater og inkuberes dem med 6 ml av blandede bakteriekulturer ved 37 ° C med forsiktig omrøring (30 rpm) i 5 dager.
- Etter inkubering forsiktig skylle de mikromatriser to ganger med fosfatbuffret saltvann (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na-HPO 2 til 4, 1,8 mM KH 2PO 4) og inkuberes med en oppløsning av 1 ug ml -1 av fire ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) flekk i PBS i 30 min.
- Vask fargede microarray lysbilder i en fersk godt plate ved å dekke med PBS og virvlende forsiktig, endre PBS gang. Til tørrhet under en strøm av luft. Påfør et glass dekkglass til microarray lysbilde og pakningen på plass med lim. Når dry, sterilisere den ytre overflaten med 70% (v / v) etanol.
- Trygg kast kulturer i henhold til deres inneslutningsnivå.
5. Microarray Imaging and Analysis
- Capture enkeltbilder for hver polymer sted i lysfelt og DAPI (Ex / Em = 358 nm / 361 nm) kanaler. Utfør denne manuelt med et fluorescerende mikroskop eller ved hjelp av en automatisert fluorescens mikroskop (med en XYZ trinn styres av et bilde oppkjøpet programvare) utstyrt med en 20X objektiv.
MERK: Se i håndboken 18 for bruken av programvaren og justere mikroskop for å få bilder ved hjelp av lysfelt og DAPI kanaler. Forsikre deg om at gevinst og eksponeringstiden for bildeopptak for alle mikromatriser er de samme. - Skaff gjennomsnittlig fluorescens intensiteten av hver spot i DAPI kanalen ved å velge spot området og kvantifisering av fluorescens med et bildebehandlingsprogram.
- For bakgrunnen fluorescens av hver spot, obtai bilder av polymer flekker på en gjengivelse microarray inkuberes bare med media uten bakterier. Trekke fra bakgrunnsfluorescensen fra intensiteten av flekken for å oppnå fluorescens fra bakterier.
- Beregn gjennomsnittlig normalisert verdi fra de fire plassene, som representerer hver polymer, som brukes for å sammenligne bakterier binding av ulike polymerer 6.
- Identifiser polymerer som viser minst bakteriell binding (laveste fluorescens) som "hit" polymerer 6.
6. Coating av dekkglass for 'Hit' Validering
- Å belegge Dekk med Polymers:
- Fremstille oppløsninger av "hit" polymerer (~ 2% w / v) i tetrahydrofuran (THF), eller et annet egnet løsningsmiddel.
- Spin kles sirkulær dekkglass av passende størrelse med polymerløsninger ved hjelp av en spinne-belegger ved 2000 opm i 10 sek.
MERK: I fravær av en spin coater, Dekk eller andre materialer kan være dukkert belagt, selv om spinbelegg gir et mer ensartet overflate. - Tørk de belagte dekkglass i en konveksjonsovn ved 40 ° C over natten og sterilisere ved hjelp av UV-lys i 30 minutter før inokulering av bakterier.
- Å belegge Dekk med Agarose for negative kontroller:
- Rene Dekk enten ved plasma behandling for 10 min eller fordype i 1 M NaOH i 4 timer.
- Fordyp glassene i acetonitril som inneholder 1% (3-aminopropyl) triethoxysilane over natten. Rens glassene med aceton 3 ganger og settes i en ovn (100 ° C) i 1 time.
- Dip belegge de tørkede Dekkglass med 1% agarose vandig oppløsning som holdes i et vannbad ved 60 ° C. Plasser agarose belagt Dekk på flatt underlag i støvfritt omgivelsesbetingelser for 24 timer og sterilisere ved hjelp av UV-lys i 30 minutter før inokulering bakterier.
7. Vedlegg og analyse av dekkglass ved hjelp av elektronmikroskop (SEM)
- Ettersterilisering med UV-lys i 30 minutter, plasseres dekkglass (polymer / agarose belagt eller ubelagt glass) i en standard 12-brønns plate eller 24-brønners plate (avhengig av størrelsen av objektglassene) og inkuber med bakterier som beskrevet i seksjon 4.
- Etter inkubasjon med bakterier, vask de ubelagte og belagte Dekk to ganger med 0,1 M kakodylatbuffer (pH 7,4) og deretter løse med 2,5% (vekt / volum) glutaraldehyd i 0,1 M kakodylatbuffer (pH 7,4) i 2 timer.
- Post-fix prøver med 1% (w / v) osmiumtetroksyd i 1 time ved romtemperatur og dehydrere med sekvensielle etanolvaskinger ved 50, 70, 90 og 100% (v / v) i 30 minutter hver.
- Tørre prøver i CO 2 i henhold til standard protokoller 19. Tørketiden vil være avhengig av arten av prøven.
- Coat prøver i en gull / palladium legering (60/40%) med en frese belegger med strøm på 30 mA og vakuum ved 0,75 Torr. Undersøke under et elektronmikroskop som per standardprotokoller 20.
MERK: Ensure tilstrekkelige sikkerhetstiltak for å styre risiko som oppstår fra lagring, håndtering og disponering av osmiumtetroksyd, som det er svært giftig. - Visuelt sammenligne bilder av ubestrøket Dekk og de belagt med agarose eller "hit" polymerer for å bekrefte bakterie bindende / repelling evner av polymerer.
MERK: Resistance vedlegg skal være lett synlig som en reduksjon av celler til stede. - Velg den mest lovende 'hit' ikke-bindende polymerer for belegg studier med medisinsk utstyr (for eksempel sentralt venekateter) 6.
8. Valg av et løsemiddel for Coating katetre
- Vurdere ulike løsningsmidler for kompatibiliteten med den iboende del av kateteret, så vel som deres evne til å løse opp "hit" polymer. Skjær deler cath-1 og inn i sylindriske stykker 5 mm i lengde, og måle med en digital Vernier krumpasser.
- Vurdere ulike løsningsmidler slik som acetatic syre, ammoniakk, aceton, acetonitril, dietyleter, tetrahydrofuran (THF), dimetylformamid (DMF), N-metyl-2-pyrrolidon (NMP), etanol, metanol, etylenglykol, toluen og xylen. Dyppe kateter stykker i løsningsmidlene i 12 timer og bedømmer visuelt for integritet av kateteret og klarhet av løsningsmiddel.
MERK: Velg et løsemiddel som ikke forårsaker kateter å hovne opp eller gå i oppløsning eller resultere i en uklar løsemiddel. Løsemiddelet må oppløse "hit" polymerer.
9. Analyse av Bakteriell Vedlegg på katetre ved konfokalmikroskopi
- Fremstille 2,5% (vekt / vol) polymerløsninger i aceton eller et annet egnet oppløsningsmiddel, som bestemt i avsnitt 8. Plasser 5 mm kateter stykker inn i en liten glassampuller (5 ml) og dyppe dem i 1 ml av polymeroppløsningen i 2 min . Fjerne overskytende polymeroppløsningen og tørke den kateterstykkene over natten i en vakuumovn ved 40 ° C.
- Forbered podestoff ved å blande tint bakteriell stocks å gi ca 10 6 celler av hver art i 50 ml LB 6.
- Steriliser belagte og ubelagte kateter stykker med UV-lys i 30 minutter og inkuberes med 1 ml LB inokulert i en 24-brønners plate ved 37 ° C i 3 dager, med forsiktig omrøring 6.
- Etter inkubering vaskes kateter med PBS (2 x 2 ml), fikse bakterier med 10% paraformaldehyd i PBS i 30 minutter, og vaskes med PBS (1 ml). Farge bakteriene på kateter stykker med DAPI (1 pg ml - 1) i 20 minutter og vask med PBS (1 ml).
- Skaff confocal bilder av kateteret brikker bruker følgende innstillinger: 405nm blå diode laser, detektor range 414-502 nm, hull - Airy1, bildestørrelse - 1024 × 1024 piksler, voxel bredde - 105,2 nm, Z-stabler avstands 0.5μ m , forstørrelse - 40X 1,25.
- Fullfør confocal bildebehandling av Z-stabling 50 bilder på tvers av 100 mikrometer lengden på kateteret.
- Analyser bildene ved hjelp av egnet påle analyseprogramvare: flate Z-stablet bilder i Z-planet, ved hjelp av funksjonen til å forlenge dybdeskarphet, for å skape et enkelt bilde av et kateter stykke.
MERK: Dette bildet bør da bli analysert for å oppnå det området av kateteret er dekket av bakterier, etter at bakgrunnskorreksjon ved å bruke 'flate bakgrunnen "funksjon.
10. Analyse av Bakteriell Vedlegg på katetre av SEM
- Fremstille 10% polymerløsning (w / v) i aceton.
- Trykker på en pipettespiss (for 200 ul mikropipette) inn i midtpartiet av den avkappede av kateteret for å holde den og dyppe stykket i polymerløsningen i ca. 30 sek. Tørk det belagte stykket i omgivelsesbetingelser i 30 minutter. Påføre et andre belegg ved neddykking igjen inn i polymerløsningen og tørk over natten i omgivelsesbetingelser.
- Etter UV-behandling og inkubering med bakterier vaskes stykkene (n = 3) med PBS (2 x 1 ml) og overføre dem inn i 48-brønners plater inneholdende ett0% formaldehyd i PBS i 30 min. Etter fiksering, vaskes bitene med PBS (1 ml), tørr over natten ved romtemperatur, montere på stubber med ledende karbon-plater, og gull belegge ved hjelp av en frese-belegger (se trinn 7.5).
- Skaff bilder ved hjelp av en scanning elektronmikroskop 6.
Representative Results
Figur 2 viser bakteriell festing (normalisert fluorescens intensitet) til en rekke av polymerer som bestemt ved mikromatriseanalyse. Flekker trykte uten polymer (NMP bare) er den negative kontrollen, som agarose sterkt motstår bakteriell binding 6 - målt fluorescens er meget lav. Polymerene som vises er alle med lav bindings men i de fleste tilfeller, avvisende egenskaper av en polymer varierer betydelig mellom bakteriearter som ble testet. Dette gjenspeiler de store forskjeller mellom festemekanismer på tvers av ulike arter. Utvelgelsen av en passende polymer er derfor avhengig av anvendelsen, men de lave bindende polymerer som er lett identifiseres ved sammenligning med agarose. Høye-bindende polymerer som er sannsynlig å bli identifisert i en matrise, og kan brukes som positive kontroller for etterfølgende eksperimenter. For polymerer som ikke viser auto-fluorescens i DAPI kanalen, kvalitativ comparison av punktbilder kan gjøres visuelt (som vist i figur 3, som belyser en representant høy-bindende polymer og tre eksempel lav-bindende polymerer). En slik sammenligning, samtidig som det gir mindre informasjon enn den statistiske analysen, kan være en nyttig visuell validering av intensitetsverdiene beregnes.
Med 22 passende polymerer identifiseres ved hjelp av microarray, er oppskalering eksperimenter utført for å bekrefte deres bakterier avvisende egenskap når det brukes til å belegge større flater. Vist er de beste resultatene eksempler, som brukes til å belegge glass dekkglass (analysert av SEM (figur 4 og 5)) og kateter skiver (analysert ved konfokal mikroskopi (figur 6) og SEM (figur 7)). Begge mikroskopiske metoder har fordelen av å la direkte celletall på overflaten, noe som gir entydige data; reduksjon i cellebinding er lett visible. De belegg som best beholdt sine avvisende egenskaper på oppskalering, samt å være mottagelig for store belegg teknikker, ble ytterligere undersøkt. Resultatene viste illustrere de beste resultatene polymerer fra hvert trinn.
Fig. 1: Trinn involvert i identifiseringen av bakterieavvisende polymerer ved polymer mikromatriser for biomedisinske anvendelser SEM = scanning elektronmikroskopi.
Fig. 2: Bakteriell binding på en serie av polymerer, bestemt ved mikromatriseanalyse lav bakteriell binding blir sett på en rekke polyakrylater / akrylamid (PA) og polyuretan (PU). Resultater fra polymer mikromatriser undersøkt med flere bakterie s pecies (C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans, og to konsortier, BacMix-en og BacMix-2) er vist. Bakteriell binding uttrykt som bakgrunn korrigert gjennomsnittlig DAPI fluorescens intensitet (normalisert). Feilfelt representerer standardavvik. Tilpasset fra Nummer 6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Eksempel bilder av polymer flekker fluorescens (DAPI) og lysfelt mikroskopi bilder av BacMix-2 viser bakteriell vedlegg på representative polymerer. En sterkt bindende polymer er inkludert for sammenligning med flere ikke-bindende polymerer (PU-20, PA-336 og PU-179). Scale bar = 100 mikrometer. Tilpasset fra Nummer 6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Scale-up eksperimenter med glass dekkglass SEM bilder som viser bakteriell vedlegg på ubestrøket glass og glass belagt med "hit" polymerer (eksempler valgt fra tabell 1).. Skala barer = 20 mikrometer.
Figur 5:. Bakteriell binding kvantifisert ved celletall fra SEM bilder Sammenligning av celler festet per arealenhet av overflater belagt med de beste "hit" polymerer. Agarose ble anvendt som en kontroll "ikke-binding" overflate, med glass som en kontroll bindeflaten. Feilfelt representererstandardavvik.
Figur 6: Sammenligning av bakteriell binding på belagte og ubelagte kateter skiver Confocal bilder som sammenlignet ubehandlet kateter (cath-1) (A) og kateter belagt med PA13 (B) etter inkubasjon med BacMix-2.. Bilder tatt med en 40X objektiv (skala bar = 20 mikrometer). Tilpasset fra Nummer 6.
Fig. 7: Sammenligning av bakteriell binding på belagte og ubelagte kateter skiver SEM bilder viser sammenligning av ubehandlet kateter (cath-1) (A) og kateter belagt med PA13 (B) etter inkubasjon med en bakteriell cocktail bestående av BacMix-2 Scale. barer = 101; m. Tilpasset fra Nummer 6.
| polymer | monomer 1 | monomer 2 | monomer 3 | Monomerforhold | ||
| PA465 | MEMA | DEAEMA | HEA | 8 | 1 | 1 |
| PA475 | MEMA | DEAEA | HEMA | 6 | 1 | 3 |
| PA513 | MEMA | DEAEMA | MMA | 8 | 1 | 1 |
| PA515 | MEMA | DEAEA | MMA | 6 | 1 | 3 |
| PA13 | DMAA | - | 9 | 1 | - | |
| PU1 | PEG2000 | HDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU16 | PEG2000 | MDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU161 | PEG2000 | MDI | BD | 2,5 | 5.2 | 2.3 |
| PU7 | PEG900 | Bich | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU83 | PEG900 | HMDI | BD | 2,5 | 5.2 | 2.3 |
| PU227 | PPG-PEG-1900 | HDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU129 | PPG425 | Bich | DMAPD | 2,5 | 5.2 | 2.3 |
| PU10 | PTMG2000 | Bich | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU179 | PTMG2000 | HDI | NMAPD | 2,5 | 5.2 | 2.3 |
| PU20 | PTMG2000 | MDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU5 | PTMG2000 | HDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
Tabell 1: Sammensetning av bakteriene ikke-bindende "hit" polymerer i figur 2.
Discussion
Festing av bakterier til en overflate er en kompleks prosess som bestemmes av en lang rekke faktorer avhengig av bakteriearter, egenskapene til overflaten, det omgivende medium, og det fysiske miljø. Selv om bestemte kjemiske grupper er kjent for å påvirke bakterielle bindings (polyglykoler, for eksempel, vanligvis motstå feste 11), å korrelere den biologiske virkningen av polymerer med deres kjemiske strukturer er vanskelig, noe som gjør rasjonell utforming av polymerer for spesifikke funksjoner utfordrende. I fravær av detaljerte festemekanismer Andre studier har forsøkt å etterligne naturlig forekommende vannavstøtende overflater, med lange og omfattende optimalisering prosesser 21. Den miniatyrisert høy gjennomstrømming Metoden som presenteres her overvinner disse utfordringene ved å legge til rette for parallell screening av hundrevis av polymerer for å identifisere potensielle kunder for videre studier.
Resultater fra microarray-metoden hovedsakelig tjene til Identify sannsynlige kandidater bly. Figur 2 illustrerer 22 kandidater med lav binding av minst en art, mens figur 3 viser tydelig reduksjon i bindingskapasiteten. Alle 22 lav-bindende polymerer som er vist i figur 2 ble tatt frem til oppskalering eksperimenter, der den beste (i form av avvisende og belegg egenskaper) ble bestemt å være PU83, PA13, og PA515 (figur 4 og 5). Polyakrylater gir større fleksibilitet i forhold til polymerisasjonsmetoder og så den laveste bindende polyakrylat, PA13, ble valgt for kateter belegg studier (figur 6 og 7). Mer detaljert videre arbeid med andre kandidater ble utført og har blitt rapportert andre steder 6.
Gjennom en rekke eksperimentelle gjentakelser fant vi en rekke mindre trinnene var nøkkelen til suksess og reproduserbarhet. I tillegg til å lette adhesjonen avpolymerer til objektglass, ved hjelp av en agarose under-belegg tilveiebringer en ren bakgrunn, som agarose er meget motstandsdyktig mot bakteriell kolonisering. Likeledes konsistens i polymeren ble seg selv, både innenfor samme matrise og mellom arrays, er viktig og derfor utskrift av matrisene må kontrolleres nøye. Forsiktig justering av pinnene i print-hode og også uniform fylling av 384-brønns plate er nødvendig for å sikre ensartet spotting. Som noen av polymerene vi brukte utviste en grad av autofluorescence, ta bakgrunn fluorescens data for hvert bilde før inkubasjon med bakterier var avgjørende. For å ta høyde for variasjoner og for å få robuste data replikater av mikromatriser anbefales.
Flekken ansatt her (DAPI) har ingen selektivitet for bakteriearter, bindende ikke-spesifikt til DNA. Derfor er god aseptisk teknikk viktig når bakteriekulturer er innført som forurensninger kan gå ubemerket hen, forvirrende interpretering av resultatene. Det samme gjelder for senere eksperimenter ved bruk av scanning elektronmikroskopi, hvor det er bare mulig å skille stenger og cocci men ikke slekt eller arter.
Etter microarray screening, bør lovende polymerer velges for videre validering. I det eksempel som er presentert her, ble syv polymerer av interesse identifisert ved deres klar reduksjon i fluorescens på microarray og deres inhibering av festing ble bekreftet ved å belegge dem på større flater. Figurene 4 og 5 viser den reduksjon i binding oppnådd på dekkglass, noen praktisk måte å teste oppførselen til polymerer som bulk belegg snarere enn som microarray flekker. Deretter ble disse polymerer belagt på medisinsk utstyr for å fullt ut kvantifisere reduksjon i bakterie vedlegg. Det er viktig at velges løsningsmidlet (se protokoll avsnitt 8) for disse belegg studiene er godartet til det ønskede substrat (her, kateteret) mens beholdeing evne til å oppløse polymeren av interesse, for å tillate belegging. Her har vi brukt aceton som, i tillegg til egenskapene nevnt, har et lavt kokepunkt og fordamper raskt å forlate et jevnt belegg.
Midlene for validering valgt, vil avhenge av den spesifikke anvendelse som studeres. Som observasjon av celler ved elektronmikroskopi og fluorescens tillater direkte kvantifisering av individuell celleadhesjon, valgte vi disse teknikkene som et supplement til massefarging mikromatriseanalyse. Resultater er vist i figurene 6 og 7, som viser viktigheten av frie valideringsmetoder. De konfokale bilder i figur 6 gir meget klare bilder av individuelle celler, mens det sem har den ekstra fordelen av å tillate en vurdering av den overflate av polymeren, som her er glatt og jevn. Disse metoder er begrenset av betraktningsfeltet av mikroskop som benyttes, og derfor er det important å ta en serie med bilder som har tillit til resultatene. Fremgangsmåten beskrevet ovenfor kan ikke kvantifisere bakterie tilslutning over hele overflaten, bare antyde dekning fra en rekke små regioner. Vi tror at dette er tilstrekkelig for anvendelse er beskrevet. Reduksjon i bakteriell binding kan vurderes ved å liste opp overflaten levd bakterier på hele bestrøket og ubestrøket kateter brikker bruker metoder som beskrevet andre steder 22. Men slike fremgangsmåter krever biomaterialet flatene screenet for å ha en jevn overflate, noe som gjør det vanskelig å opprettholde når analysene er utført med medisinsk utstyr, som ofte har komplekse geometri.
Åpenbart må alle enheter beregnet for klinisk bruk gå gjennom vesentlig ytterligere testing for å sikre sikkerhet og effekt hos mennesker. Metoden som presenteres her representerer begynnelsen av denne prosessen og videre arbeid skal inkludere bekreftelse på aktivitet in vivo. I dette tilfellet, studere venøs catheters, innledende arbeidet kunne undersøke binding av blodkomponenter og hele celler i polymeren. Effekten av blodkomponenter for bakteriell binding bør også tas i betraktning, eventuelt ved å gjenta bindingsanalyser, i nærvær av inaktivert serum eller de-fibrinated blod 23. Den endelige test av teknologi vil være i en in vivo-modell slik som et subkutant implantat infeksjonsmodell 24.
Vi demonstrerer potensialet av polymeren microarray metode for screening av overflate manipulerer polymerer. Slike polymerer (både motsette og fremme bakteriell binding) har et stort antall søknader innen medisin, næringsmiddelindustrien og bioteknologi, noe som betyr at denne metoden kan være nyttig i mange forskningsområder. Selv om arbeidet her benytter bakterier, kan fremgangsmåten tilpasses til andre celletyper og likeledes andre kjemiske mikromatriser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | 05066 | |
| Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
| Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
| NMP | Sigma | 494496 | |
| LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
| Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
| Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
| Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
| Equipment | |||
| Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
| Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
| Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
| Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
| Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |
References
- Hansen, A., Mjoseng, H. K., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv. Healthc. Mat. 3 (6), 848-853 (2014).
- Tourniaire, G., Collins, J., et al. Polymer microarrays for cellular adhesion. Chem. Commun. (20), 2118-2120 (2006).
- Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers. J. Mat. Chem. 21 (1), 96-101 (2010).
- Hay, D. C., Pernagallo, S., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functionala hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Res. 6 (2), 92-102 (2011).
- Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
- Venkateswaran, S., Wu, M., et al. Bacteria repelling poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide) coatings for biomedical devices. J. Mat. Chem. B. 2 (39), 6723-6729 (2014).
- Pickering, H., Wu, M., Bradley, M., Bridle, H. Analysis of Giardia lamblia Interactions with Polymer Surfaces Using a Microarray Approach. Environ.l Sci. Technol. 46 (4), 2179-2186 (2012).
- Mizomoto, H. The Synthesis and Screening of Polymer Libraries using a High Throughput Approach. , (2004).
- How, S. E., Yingyongnarongkul, B., Fara, M. A., Díaz-Mochón, J. J., Mittoo, S., Bradley, M. Polyplexes and lipoplexes for mammalian gene delivery: from traditional to microarray screening. Comb. Chem. High Throughput Screen. 7 (5), 423-430 (2004).
- Thaburet, J. -F., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromol. Rapid Commun. 25 (1), 366-370 (2004).
- Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nat. Biotechnol. 30 (9), 868-875 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P.
- Lewis, K.
- Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G. Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during Development as a Biofilm. J. Bacteriol. 184 (4), 1140-1154 (2002).
- Reisner, A., Haagensen, J. A. J., Schembri, M. A., Zechner, E. L., Molin, S. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms. Mol. Microbiol. 48 (4), 933-946 (2003).
- Watnick, P. I., Kolter, R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm. Mol. Microbiol. 34 (3), 586-595 (1999).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8533-8554 (2013).
- Imstar. Pathfinder Technology for High Content Cellular Screening in Cell Biology and Genetoxicity Software version: 6.04I. , (2012).
- Williams, J. R., Clifford, A. A. Supercritical Fluid Methods and Protocols. 13, Humana Press. New Jersey. (2000).
- Kuo, J. Electron microscopy methods and protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Leslie, D. C., Waterhouse, A., et al. A bioinspired omniphobic surface coating on medical devices prevents thrombosis and biofouling. Nat. Biotechnol. 32 (11), 1134-1140 (2014).
- Bechert, T., Steinrücke, P., Guggenbichler, J. P. A new method for screening anti-infective biomaterials. Nat. Med. 6 (9), 1053-1056 (2000).
- May, R. M., Magin, C. M., et al. An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters. Clin. Transl. Med. 4, (2015).
- Chen, R., Willcox, M. D. P., Ho, K. K. K., Smyth, D., Kumar, N. Antimicrobial peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent subcutaneous infection models. Biomaterials. 85, 142-151 (2016).
