Introduction
Полимерные микрочипы миниатюризированы с высокой пропускной способностью платформ , в которых до 7000 полимеров 1 напечатанным на стеклянные слайды для параллельного анализа с прокариотических или эукариотических клетках 2. Изложенный здесь метод основан на том , что мы впервые описана в 2010 году 3. Эта система скрининга была применена к многочисленным типам клеток , включая гепатоцитов человека 4, стволовые клетки 5, почечных эпителиальных клеток канальцев 2, бактерий и 3,6 протозойных патогенов 7. В каждом случае полимеры , которые способствуют или резист связывания клеток исследуемых были идентифицированы 8. Комплексы ДНК с синтетическими полимерами поликатионных также использовались в формате микрочипов для высокопроизводительного скрининга трансфекция гена кандидатов 9. А также для скрининга клеток-субстратного взаимодействия, полимерные микрочипы также были использованы для оценки свойств материала 10.
"> Способность синтетических полимеров модулировать прикрепление бактерий к поверхности хорошо установлена 3,6,11. Многих факторов , включая заряд, гидрофобность и шероховатости поверхности полимерной поверхности , как известно, влияют на бактериальную переплета. Общепризнанные подходы обнаружения биоматериалов противящиеся связывание бактерий через последовательно или опытным путем разработки и тестирования одного материала в то время, являются трудоемкими, дорогостоящими и отнимает много времени процессы. Полимерные микрочипов предлагают привлекательную альтернативу для обхода таких ограничений.Поверхностно-ассоциированные бактерии растут как комплекс популяция называется биопленку - такие биопленки обладают высокой устойчивостью ко многим экологическим стрессам и антибиотиками. Это отчасти из - за их плотной внеклеточного матрикса (состоящей из белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот) 12 и частично из - за увеличенного наличия надежных "persistor" клеток в биопленки 13. AlthoУф точные механизмы поверхностного объединения и последующего образования биопленки трудно охарактеризовать, как правило , полагают , что существуют три различных стадий роста поверхности 14 - 16. Начальная, обратимое присоединение сопровождается более сильной адгезии клеток, создание биопленки производства внеклеточного белка и полисахарида матрикса и пролиферации клеток. И, наконец, зрелые релизы биопленки свободно живущих планктонные клетки, которые могут инициировать новые инфекции в других местах. Бактерии-отталкивающие полимеры, которые предотвращают первоначальное прикрепление бактерий, и, следовательно, предотвратить ранние стадии образования биопленки, потенциально представляют собой отличное решение для минимизации инфекций. Учитывая повышение резистентности к антибиотикам (а также по своей природе большее сопротивление поверхностно-ассоциированных бактерий 12), к антибиотикам свободных средств уменьшения инфекции, представляют особый интерес. В условиях стационара, бактерии-отталкивающие полимерПокрытия могут иметь прямое медицинское применение в сокращении внутрибольничных инфекций, которые обычно формируются вокруг имплантированных устройств 17.
Здесь, метод с высокой пропускной способностью для скрининга 381 полимеров для репеллента активностью против патогенных бактерий , связанных с внутрибольничных инфекций, с последующим попаданием проверки и последующего покрытия и анализа центрального венозного катетера материалов, описывается (рисунок 1). Вкратце, эти полимеры были замечены на агарозном покрытые предметные стекла с помощью контактной печати и, после сушки и стерилизации, миниатюризированное массивы инкубировали с клинически важных бактериальных культур. После инкубации микрочипы осторожно промывают и прилипшие бактериальные клетки окрашивали и визуализировали с помощью флуоресценции. Впоследствии, полимеры, которые ингибируют бактериальный связывание исследовали в большем масштабе, путем нанесения на стеклянные покровных стеклах и визуализировали с помощью электронной микроскопии. Выбранный отталкиваютсяодолжил полимеры были затем наносили на коммерческих катетеров и показано, чтобы уменьшить прикрепление бактерий почти в 100 раз.
Protocol
1. Приготовление Агарозном с нанесенным Слайды
Примечание: Перед тем как изготовления полимерных микрочипов, aminoalkylsilane покрытые предметные стекла покрыты агарозном IB , чтобы минимизировать неспецифическое связывание и фона можно было провести оценку полимеров , которые связываются или отталкивать бактерии 6. Силан покрытие облегчает связывание агарозы с горками.
- Приготовить 2% (вес / объем) раствора агарозы IB в дистиллированной воде в бутылке объемом 250 мл.
- После укупорки бутылки свободно, нагревать суспензию в микроволновой печи в течение 30 периодов сек до растворения. Убедитесь в том, что крышка не плотно закрыты, чтобы избежать возможной сборки давление вверх. Удалите бутылку регулярно и вихревой нежно.
- Убедитесь в том, что твердое вещество не растворится и раствор не станет прозрачным. Налейте этот раствор агарозы в химический стакан на 100 мл, а место в С водяной бане при 65 ° для поддержания жидкого раствора.
- Dip слайды силана покрытием в раствор агарозы, обеспечивая равномерное покрытие, и Wiпэ заднюю часть слайда с бумажной салфеткой.
- Сухие слайды с покрытой стороной вверх, в пыли окружающей среды (например, внутри шкафа или вытяжном шкафу) в течение как минимум 24 часов.
- Подтвердите равномерное покрытие путем визуального осмотра. Покрытие может быть легко оценена с помощью дыхания на слайде - образовывается конденсация на непокрытых областей. Только слайды полностью и равномерно покрыты следует использовать для микрочипов печати.
2. Получение полимерных растворов для печати
- Готовят растворы (1% вес / об) из выбора предварительно сформованных полимеров , состоящих из полиакрилатов, полиакриламиды и полиуретаны в N -methylpyrrolidone (NMP) в стеклянных флаконах. (Готовят 1 мл каждого полимера). Вихревой пока полимер полностью не растворится. Синтез полимеров описано в другом месте 6.
- С помощью микро-пипетки, заполнить каждую лунку 384 планшете с полимерным раствором 25 мкл, гарантируя, что нет никакого креста Контаmination и каждая лунка содержит уникальный полимер. Используйте NMP в качестве отрицательного контроля, по крайней мере, 2-х скважин. Запишите идентичность полимерного раствора в каждую лунку на хорошо шаблон пластины или файл электронной таблицы.
3. Печать Полимерные Microarrays с использованием контактного принтера
Примечание: Печать микрочипов была выполнена с использованием контактного принтера. Конкретные указания относительно полимера микрочипов печати приведены ниже. Для общих руководящих принципов по использованию рекомендаций принтера и безопасности, следуйте инструкции от производителя. Несмотря на то, мы используем контактный принтер, также может быть использован подходящий ручное устройство тиснения.
- Как сообщили в руководстве принтера, создать подпрограмму (см шаг 3.3), что позволяет печатать 384 жидкостей (растворов полимеров или NMP) в quadruplicates, используя microarraying головку 32-контактный разъем (расположенный как 8 строк и 4 столбцов).
- Печать 1536 места, расположенные в 48 строк и 32 столбцов. Программирование подпрограммы для печати в разделе 12s, то есть., 32 решения в то время, так что принтер может быть остановлен после печати каждой секции , чтобы для очистки контактов.
- Чтобы создать подпрограмму печати:
- Откройте программу и одну из доступных опций выберите 'Создать новую подпрограмму'. Перейдите на вкладку "Описание" для ввода данных эксперимента. Выберите вкладку "голова" и выберите '32 -контактный голову microarraying '.
- Выберите вкладку "источник" и выберите держатель пластин (держатель источника пластины (1x5)), тип пластины (плиты 384 х 6000), общей пластины (1) и порядок источника (по столбцам).
- На вкладке "дизайн Slide ', выберите' 3x1 '' слайд 'и выберите' выстроив по номеру поля". Затем выберите 'выстроив шаблон'. Input 'Пятно вид' как 'макет' и 'размеров Pattern' как 'Количество строк' (6), 'Количество столбцов' (8), 'Row шаг' (750) и "Колонка основного тона '(560). Выберите одну секцию для печати пихтыт.
- В «макет слайда» вкладки ввода количество слайдов используется для печати. Выберите вкладку "Печать" для ввода параметров печати (количество марок в рисовании: 1, количество марок на месте: 5, время штамповки: 200 мс, время красочного: 100 мс).
Примечание: Процедура, сейчас создается для печати 384 жидкости (полимерные растворы или NMP) в quadruplicates, используя microarraying головку 32-контактный разъем (расположенный в 8 строк и 4 столбцов). В общей сложности программа должна печатать 1536 точек, расположенных в 48 строк и 32 столбцов с шагом строки 750 мкм и шагом столбцов 560 мкм.
- Поместите агарозном покрытием слайды на платформе и обеспечить хорошее вакуумное уплотнение, чтобы удерживать слайды в нужном положении.
- Отрегулируйте печатающую головку так, чтобы все штифты на той же высоте. Это можно проверить вручную опускание головки на предметное стекло и подтверждая, что штифты двигаться вверх в то же время. Если есть какие-либо расхождения с высоты, отрегулируйте с помощью sleevе на контактном вверх или вниз.
- Поместите луночного планшета на держателе в правильной ориентации, то есть., А A1 является в верхней правой части держателя и убедитесь , а пластина фиксируется надежно.
- Использование высоты регулятора высоты, убедитесь, что высота держателя пластины такова, что при выборе полимерных растворов, штифты не касались дна лунок.
Примечание: Это важно для равномерного полимерного пятнистость, а также, чтобы не замарать полимерных растворов в соседних скважинах, вызывая тем самым перекрестное загрязнение. - Выберите вкладку "Пуск" и выберите "Run типа" как "Normal". Нажмите кнопку "Выполнить", и убедитесь , что слайд, а пластины и т.д., находятся в положении , когда будет предложено.
- Печать 1 раздел в то время (32 решений в то время, 12 секций), что позволяет для чистки штырей между секциями. Очистите контакты тщательно с бумажным полотенцем, смоченной в ацетоне, а затем с помощью бумаги сухой ткани, чтобы обеспечить контакты полностью сухими.
- По завершении печати микрочипов, поместите их в держатель слайдов и высушить их в течение ночи в вакуумной печи при 45 ° С для удаления NMP в полимерных пятен. После стерилизации с УФ-светом в течение 30 мин, микрочипов готовы к инокуляции бактерий.
- Перед инокуляции слайды с бактериями, проводить измерение фоновой флуоресценции (как описано в разделе 5). Используйте это измерение при расчете бактериального связывания.
4. Прививка полимерных микрочипов с бактериями
Примечание: Обеспечить хорошую асептики. Все обработки культур следует проводить в стерильных условиях: либо с помощью горелки Бунзена или в ламинарном проточном. Культуры должны быть выращены с наличием кислорода, среднего роста, и температура регулируется с требованиями каждого вида.
- Приготовьте в течение ночи культуры путем инокуляции 5 мл Лурии-Бертани бульон (LB: 10 г · л -1 Бакто-триптона, 5 г л -1 NaCl и 10 г L <SUP> -1 дрожжевой экстракт) с колонией из пластины. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С, встряхивая при 200 оборотах в минуту.
- Приготовьте запасы морозильнике в течение ночи культур добавлением глицерина (10% концентрации в целом) и хранить запас при -80 ° С.
- Для определения числа клеток из образцов талой бактериальных запасов, выполнять серийные разведения каждого запаса и расти бактерии в течение ночи на твердых средах. Точное определение количества клеток в запасах обеспечивает соответствующую инокуляции каждого вида 6.
- Подготовка инокулята для микрочипов. Одиночные культуры видов выращивают, как описано выше, и применяется непосредственно к микрочипов. BacMix-1 представляет собой бактериальную смесь Klebsiella пневмонии (К.), пневмонии стафилококк сапрофитный (S. saprophyticus) и золотистого стафилококка (золотистого стафилококка). BacMix-2 представляет собой бактериальную смесь , состоящую из стрептококками (S. Mutans), С. стафилококк К. Пневмококк и Enterococcus фекальный (E. фекальный).
- Для того, чтобы производить либо смешанную культуру, смешать ночевок в равных объемах (3 мл каждый) и развести четыре раза свежей LB (примерно до 50 мл конечного объема).
- Поместите УФ-стерилизованные полимерные микрочипы в прямоугольных 4-луночные планшеты и инкубируйте их с 6 мл смешанных бактериальных культур при температуре 37 ° С при осторожном перемешивании (30 оборотов в минуту) в течение 5 дней.
- После инкубации, осторожно прополоскать микрочипов дважды фосфатно - буферным раствором (PBS: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 1,8 мМ KH 2 PO 4) и инкубировать с раствором 1 мкг мл -1 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) пятно в PBS в течение 30 мин.
- Вымойте окрашивали микрочипов слайдов в свежей пластинке также путем покрытия с PBS и закрученной мягко, меняя PBS один раз. Сухой в потоке воздуха. Нанесите стекло крышка скольжения на микрочипов горкой и уплотнение в месте с клеем. После того, как гRy, стерилизуют внешнюю поверхность с 70% (об / об) этанола.
- Безопасно распоряжаться культур в соответствии с уровнем их сдерживания.
5. Microarray визуализации и анализа
- Захват отдельных изображений для каждого полимера в пятне и DAPI светлого поля (/ Em = 358 нм / 361 нм Ex) каналов. Выполнить это вручную с помощью флуоресцентного микроскопа или с использованием автоматизированного флуоресцентного микроскопа (с стадии XYZ, управляемым программным обеспечением захвата изображений), снабженными объектива 20х.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству 18 для работы программного обеспечения и настройки микроскопа для получения изображений с помощью Светлое и DAPI каналов. Убедитесь, что время усиление и экспозиция для захвата изображения для всех микрочипов одинаковы. - Получения средней интенсивности флуоресценции каждого пятна в канале DAPI путем выбора зоны точечного и количественной оценки флуоресценции с программным обеспечением для обработки изображений.
- Для фоновой флуоресценции каждого пятна, obtaв образах полимерных пятен на копировщик микрочипов инкубируют только со средствами массовой информации без каких-либо бактерий. Вычесть фоновой флуоресценции от интенсивности пятна, чтобы получить флуоресценцию от бактерий.
- Вычислить среднее нормализованное значение из четырех точек, представляющих каждый полимер, используемый для сравнения бактерий связывания различных полимеров 6.
- Определить полимеры , которые обладают наименее бактериальный связывания ( самый низкий флуоресценции) , как "хит" полимеров 6.
6. Покрытие покровных стеклах для "хит" Validation
- Чтобы покрыть покровные с полимерами:
- Готовят растворы "хит" полимеров (~ 2% вес / об) в тетрагидрофуране (ТГФ), или в другом подходящем растворителе.
- Спин пальто круглое покровные стекла подходящего размера с полимером растворов с использованием спиновый устройства для нанесения покрытия со скоростью 2000 оборотов в минуту в течение 10 сек.
Примечание: В отсутствие спин для нанесения покрытий, покровные или другие материалы могут быть с покрытием погружением, хотя спинпокрытие дает более однородную поверхность. - Сухие покровные покрытие в конвекционной печи при температуре 40 ° С в течение ночи и стерилизовать с помощью УФ света в течение 30 мин перед затравочных бактерий.
- Чтобы покрыть покровные агарозой для отрицательного контроля:
- Чистые покровные либо путем обработки плазмой в течение 10 мин или погружать в 1 М NaOH в течение 4 часов.
- Погрузитесь покровные в ацетонитриле, содержащем 1% (3-аминопропил) триэтоксисилан на ночь. Очистите покровные ацетоном 3 раза и помещают в печь (100 ° C) в течение 1 ч.
- Dip-пальто высушенные покровные с 1% -ном агарозном водного раствора поддерживали на водяной бане при температуре 60 ° C. Поместите агарозном покрытием покровные на плоской поверхности в обеспыленных условиях окружающей среды в течение 24 ч и стерилизовать с помощью УФ-излучения в течение 30 мин до затравочных бактерий.
7. Приложение и анализ покровным, с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ)
- Послестерилизация УФ-светом в течение 30 мин, место покровных стеклах (полимер / агарозы с покрытием или без покрытия стекло) в стандартной пластины 12-луночный или 24-луночного планшета (в зависимости от размера покровные) и инкубировать с бактериями, как описано в разделе 4.
- После инкубации с бактериями, моют без покрытия и с покрытием покровные дважды с помощью 0,1 М какодилатный буфер (рН 7,4), а затем зафиксировать с помощью 2,5% (вес / объем) глутарового альдегида в 0,1 М какодилатный буфер (рН 7,4) в течение 2 часов.
- Образцы после починкой с 1% (вес / объем) осмия в течение 1 ч при комнатной температуре и обезвоживают с последовательными промывками этанола при 50, 70, 90 и 100% (об / об) в течение 30 минут каждый.
- Сухие образцы в CO 2 в соответствии со стандартными протоколами 19. Время сушки будет зависеть от природы образца.
- Образцы Coat в золото / палладий сплава (60/40%) с использованием устройства для нанесения покрытий распылением с током 30 мА и вакууме при 0,75 Торр. Осмотрите под электронным микроскопом в соответствии со стандартом протоколов 20.
Примечание: ЭнсURE адекватные меры безопасности для управления рисками в результате хранения, обработки и удаления четырехокиси осмия, так как она обладает высокой токсичностью. - Визуальное сравнение изображений без покрытия покровные и те, покрытые агарозой или "хит" полимеров для подтверждения бактериальных связывания / отталкивающие способности полимеров.
Примечание: Сопротивление крепления должны быть легко видимыми как уменьшение клеток, присутствующих. - Выберите наиболее перспективным "хит" необязательных полимеров для исследования покрытий с медицинскими устройствами (например, центральные венозные катетеры) 6.
8. Выбор растворителя для покрытия катетеров
- Оценка различных растворителей для их совместимости с пребывающей части катетера, а также их способность растворять "хит" полимера. Вырезать части Cath-1 и в цилиндрические кусочки длиной 5 мм, и измеряют с помощью цифрового Vernier суппортом.
- Оценить различные растворители, такие как ACETIC кислота, аммиак, ацетон, ацетонитрил, диэтиловый эфир, тетрагидрофуран (ТГФ), диметилформамид (ДМФ), N - метил-2-пирролидон (NMP), этанол, метанол, этиленгликоль, толуол и ксилол. Погружают катетер штук в растворителях в течение 12 часов и оценивают визуально на целостность катетера и ясности растворителя.
Примечание: Выберите растворитель, который не вызывает катетеры набухать или разрушаться или результат в мутной растворителе. Растворитель должен распустить "хит" полимеров.
9. Анализ прикрепление бактерий на Катетеры конфокальной микроскопией
- Готовят 2,5% (вес / об) растворы полимера в ацетоне или другом подходящем растворителе, как определено в части 8. Поместите 5 мм катетер штук в маленькие стеклянные ампулы (5 мл) и погружают их в 1 мл раствора полимера в течение 2 мин , Удаления избытка раствора полимера и высушить катетера кусочки в течение ночи в вакуумной печи при 40 ° C.
- Подготовка посевного материала путем смешивания талой бактериальной улocks дать приблизительно 10 6 клеток каждого вида в 50 мл LB 6.
- Стерилизация покрытием и без покрытия частей катетера с УФ - светом в течение 30 мин и инкубировать с 1 мл LB , привитых в 24-луночный планшет при 37 ° С в течение 3 -х дней, при осторожном перемешивании 6.
- После инкубации промыть катетеров с PBS (2x, 2 мл), фиксируют бактерии с 10% параформальдегид в PBS в течение 30 мин и промывают PBS (1 мл). Пятно бактерии на куски с катетером DAPI (1 мкг мл - 1) в течение 20 мин и промывают PBS (1 мл).
- Получение конфокальных изображений частей катетера, используя следующие параметры: 405nm синий лазерный диод, диапазон детектора 414 до 502 нм, ПИНХОЛ - Airy1, изображение Размер - 1,024 × 1,024 пикселей, ширина воксельная - 105,2 нм, Z-стеки Разнос 0,5 мкм м , увеличение - 40х 1,25.
- Заполните конфокальной микроскопии с помощью Z-укладки 50 изображений по всей длине 100 мкм катетера.
- Анализ изображений с помощью подходящие,ле программного обеспечения для анализа: сглаживать Z стеками изображения в Z плоскости, используя функцию, чтобы расширить глубину резкости, чтобы создать единый образ катетера части.
Примечание: Этот образ должен затем быть проанализированы, чтобы получить область катетера, охватываемого бактериями, после фоновой коррекции с использованием функции 'сплющить фона'.
10. Анализ прикрепление бактерий на катетеры с помощью SEM
- Готовят 10% раствор полимера (вес / объем) в ацетоне.
- Нажмите наконечник пипетки (для 200 мкл микропипетки) в средней части разрезанной части катетера, чтобы держать его и опустить кусок в растворе полимера, в течение примерно 30 сек. Высушить кусок покрытие в условиях окружающей среды в течение 30 мин. Нанесите второе покрытие, снова погружая в раствор полимера и сухой в течение ночи в условиях окружающей среды.
- После УФ-обработки и инкубации с бактериями моют части (п = 3) с PBS (2х, 1 мл), и передавать их в 48-луночные планшеты, содержащие 10% формальдегида в PBS в течение 30 мин. После фиксации, мыть части с PBS (1 мл), сухой в течение ночи при комнатной температуре, крепление на окурков с проводящими дисками углерода, и золотой слой с использованием устройства для нанесения покрытия распылением (см шаг 7.5).
- Получение изображений с помощью сканирующего электронного микроскопа 6.
Representative Results
На рисунке 2 показано , прикрепление бактерий (нормированной интенсивности флуоресценции) к ряду полимеров , как определено с помощью анализа микрочипов. Пятна отпечатаны без полимера (только N - МП) являются отрицательный контроль, как агароза сильно сопротивляется бактериальный связывания 6 - записывается флуоресценции очень низок. Полимеры являются все с низким уровнем связывания, хотя в большинстве случаев, отталкивающие свойства полимера значительно варьирует от бактериальных видов тестирования. Это отражает значительные различия между механизмами присоединения через различных видов. Выбор подходящего полимера, следовательно, зависит от приложения, но низкие-связывающие полимеры легко идентифицированы путем сравнения с агарозой. Высокие связывания полимеры могут быть идентифицированы в матрице, и может быть использован в качестве положительного контроля для последующих экспериментов. Для полимеров, которые не показывают автофлуоресценции в канале DAPI, качественное сотрудничествоmparison пятна изображения могут быть сделаны визуально (как показано на рисунке 3, выделяя один представитель высокого связывания полимера и три примера низкого связывания полимеров). Такое сравнение, обеспечивая при этом меньше информации, чем статистический анализ, может быть полезным визуальное подтверждение значений интенсивности вычисленных.
С 22 соответствующие полимеры идентифицируют с использованием микрочипов, масштабных дополнительных экспериментов проводятся с целью подтверждения их свойства бактерии отталкивающий при использовании для покрытия больших поверхностей. Показаны наиболее эффективные примеры, используемые для покрытия стекла покровных стеклах (проанализированных помощью сканирующего электронного микроскопа (4 и 5)) и катетеров срезы (проанализированных с помощью конфокальной микроскопии (рис 6) и SEM (рисунок 7)). Оба микроскопические методы имеют преимущество позволяет подсчета прямых клеток на поверхности, что обеспечивает однозначную данных; уменьшение прикрепления клеток легко visiblе. Эти покрытия, которые лучше всего сохранили свои свойства, отталкивающие от масштабов, а также как поддаются методам крупномасштабных покрытий, были исследованы в дальнейшем. Результаты, показанные иллюстрируют наиболее эффективные полимеры из каждой стадии.
Рисунок 1:. Шаги , участвующие в идентификации бактерий , отпугивающих полимеров через полимерные микрочипы для биомедицинских применений SEM = сканирующей электронной микроскопии.
Рисунок 2:. Бактериальный связывания на серии полимеров, определяли анализом микрочипов низкое содержание бактерий связывание наблюдается по ряду полиакрилатов / акриламидов (ПА) и полиуретаны (ПУ). Результаты полимерных микрочипов зондировали с несколькими бактериальными с pecies (C. jejuni, C. несговорчивый, С. Perfringens, С. Mutans, и два консорциумов; BacMix-1 и BacMix-2) показаны. Бактериальный связывания выражается как фоновая скорректированная средняя интенсивность флуоресценции DAPI (нормализованная). Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение. Взято из ссылки 6. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3:. Пример изображения полимерных пятен флуоресценции (DAPI) и микроскопия светлого изображения BacMix-2 , показывающий прикрепление бактерий на представительных полимеров. Сильно-связывающий полимер включен для сравнения нескольких необязательных полимеров (ПУ-20, PA-336 и ПУ-179). Шкала бар = 100 мкм. Взято из ссылки 6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Шкала дополнительных экспериментов со стеклянным покровных стеклах СЭМ изображения , показывающие прикрепление бактерий на немелованной стекла и стекла с покрытием "хит" полимеров (примеры , выбранные из таблицы 1).. Шкала бар = 20 мкм.
Рисунок 5:. Бактериальный связывания количественно с помощью подсчета клеток из SEM изображений Сравнение клеток , прикрепленных на единицу площади поверхности , покрытые с лучшими "хит" полимеров. Агарозном был использован в качестве "необязательного" поверхности элемента управления, со стеклом в качестве связующего поверхности управления. Усы представляютстандартное отклонение.
Рисунок 6: Сравнение бактериального связывания на мелованной и немелованной срезов катетер Конфокальные изображения сравнивающие необработанную катетера (Cath-1) (а) и катетер , покрытый PA13 (B) после инкубации с BacMix-2.. Снимки, сделанные с целью 40X (Шкала бар = 20 мкм). Взято из ссылки 6.
Рисунок 7:. Сравнение бактериального связывания на мелованной и немелованной срезов с катетером СЭМ изображения показывают сравнение необработанной катетера (интервенционной 1) (а) и катетера , покрытого PA13 (B) после инкубации с бактериальной коктейль , состоящий из BacMix-2 шкалы. бары = 101; м. Взято из ссылки 6.
| полимер | Мономер 1 | Мономер 2 | Мономер 3 | Соотношение Мономеры | ||
| PA465 | MEMA | DEAEMA | АЭМ | 8 | 1 | 1 |
| PA475 | MEMA | DEAEA | ХЕМА | 6 | 1 | 3 |
| PA513 | MEMA | DEAEMA | ММА | 8 | 1 | 1 |
| PA515 | MEMA | DEAEA | ММА | 6 | 1 | 3 |
| PA13 | DMAA | - | 9 | 1 | - | |
| PU1 | PEG2000 | HDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU16 | PEG2000 | MDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU161 | PEG2000 | MDI | BD | 2.5 | 5.2 | 2.3 |
| PU7 | PEG900 | УБХДПО | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU83 | PEG900 | HMDI | BD | 2.5 | 5.2 | 2.3 |
| PU227 | ППГ-ПЭГ-1900 | HDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU129 | PPG425 | УБХДПО | DMAPD | 2.5 | 5.2 | 2.3 |
| PU10 | PTMG2000 | УБХДПО | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU179 | PTMG2000 | HDI | NMAPD | 2.5 | 5.2 | 2.3 |
| PU20 | PTMG2000 | MDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU5 | PTMG2000 | HDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
Таблица 1: Состав бактерий необязательных "хит" полимеров на рисунке 2.
Discussion
Прикрепление бактерий к поверхности является сложным процессом, определяется широким спектром факторов, в зависимости от вида бактерий, свойства поверхности, окружающей среды и физической среды. Хотя некоторые химические группы , как известно, влияют на бактериальные связывания (полигликоли, например, как правило , сопротивляются приспособление 11), коррелируют биологическое воздействие полимеров с их химических структур трудно, что делает рациональный дизайн полимеров для конкретных функций сложных. В отсутствие детальных механизмов крепления, другие исследования попытались имитировать встречающиеся в природе отталкивающие поверхности, с длительным и обширной оптимизации процессов 21. Миниатюрная метод с высокой пропускной способностью, представленный здесь преодолевает эти проблемы путем облегчения параллельного скрининга сотен полимеров для идентификации потенциальных клиентов для дальнейшего изучения.
Результаты метода микрочипов в основном служат для Identify вероятных кандидатов свинца. Рисунок 2 иллюстрирует 22 кандидатов с низким связыванием по меньшей мере одного вида, а на рисунке 3 показывает явное снижение связывающей способности. Все 22 низкого связывания полимеров , показанные на рис 2 были сделаны вперед в масштабируемых до экспериментов, в ходе которых в наибольшей степени (с точки зрения гидрофобность и покрытия свойств) были определены как PU83, PA13 и PA515 (рисунки 4 и 5). Полиакрилаты предлагают большую гибкость с точки зрения методов полимеризации и поэтому самым низким связывающий полиакрилат, PA13, был выбран для исследования катетер для нанесения покрытий (6 и 7). Более подробная дальнейшая работа над другими кандидатами было проведено и было сообщено в другом месте 6.
Через ряд экспериментальных итераций мы нашли ряд незначительных шагов были ключом к успеху и воспроизводимости. Помимо содействия адгезииполимеры к предметные стекла с использованием агарозы под-покрытием обеспечивает чистый фон, как агароза обладает высокой устойчивостью к бактериальной колонизации. Точно так же последовательность в полимере себя видит, как в одном массиве и между массивами, имеет жизненно важное значение, и поэтому печать массивов необходимо тщательно контролировать. Тщательное регулировка контакты в печатающей головке, а также равномерного заполнения 384-луночного планшета требуется для обеспечения равномерного пятнистость. Поскольку некоторые из полимеров, которые мы использовали демонстрировали степень флюоресценции, принимая данные фоновой флуоресценции для каждого слайда до инкубации с бактериями имеет жизненно важное значение. Для учета изменений и получить надежные данные о повторности микрочипов рекомендуется.
Пятно, используемое здесь (DAPI) не имеет селективность в отношении бактериальных видов, связывание неспецифически с ДНК. Таким образом, хороший асептических имеет важное значение, как только бактериальные культуры вводятся как загрязняющие вещества могут остаться незамеченными, запутывая interpreставление результатов. То же самое можно сказать и о более поздних экспериментах с использованием сканирующей электронной микроскопии, где можно только различать палочки и кокки, но не рода или вида.
После микрочипов скрининга, перспективные полимеры должны быть выбраны для дальнейшей проверки. В примере , представленном здесь, семь полимеров, идентифицировали по их явное снижение флуоресценции на микрочипе , и их ингибирование прикрепления было подтверждено путем нанесения их на больших поверхностях. На рисунках 4 и 5 показывают уменьшение в связывании достигается на покровных стеклах, А практические средства, чтобы проверить поведение полимеров в виде объемных покрытий, а не как микрочипов пятен. Впоследствии эти полимеры были нанесены на медицинские устройства, чтобы в полной мере количественно снижение прикрепление бактерий. Важно, что растворитель выбран (см раздел протокола 8) для этих исследований покрытия является доброкачественным до желаемой подложки (в данном случае, катетер) в то время как сохранитьИнг способность растворять полимер интерес, с тем чтобы обеспечить покрытие. Здесь мы использовали ацетон, который, как и упоминалось свойства, имеет низкую температуру кипения и быстро испаряется, чтобы оставить однородное покрытие.
Средства проверки выбранной будет зависеть от конкретного применения изучаемого. Поскольку наблюдение клеток с помощью электронной и флуоресцентной микроскопии позволяет осуществлять прямой количественной оценки индивидуального прикрепления клеток, мы выбрали эти методы в качестве дополнения к объемном анализе окрашивания микрочипов. Результаты представлены на рисунках 6 и 7, которые демонстрируют важность бесплатных методов проверки. Конфокальный изображения на Рисунке 6 обеспечивают очень четкие изображения отдельных клеток, в то время как СЭМ имеет дополнительное преимущество, что позволяет провести оценку поверхности полимера, который здесь гладкой и однородной. Эти методы ограничены полем зрения микроскопов, и поэтому она является IMPORTAнт, чтобы сделать серию снимков, чтобы иметь уверенность в результатах. Описанный выше способ не может количественно оценить прикрепление бактерий по всей поверхности, только вывести покрытие из ряда малых регионов. Мы считаем, что этого достаточно для применения описанного. Снижение бактериальной связывания может быть оценена с помощью перечисляя поверхности прилипших бактерий на всей мелованной и немелованной частей катетера с использованием методов , как описано в другом месте 22. Однако такие методы требуют биоматериала поверхностей просеивают, чтобы иметь однородную площадь поверхности, что трудно поддерживать, когда анализы выполняются с помощью медицинских устройств, которые часто имеют сложную геометрию.
Очевидно, что любое устройство, предназначенное для клинического применения должно пройти существенное дальнейшее тестирование, чтобы гарантировать безопасность и эффективность в организме человека. Метод , представленный здесь представляет собой начало этого процесса и дальнейшей работы должны включать подтверждение активности в естественных условиях. В этом случае, изучая венозный грatheters, первоначальная работа могла бы исследовать связывание компонентов крови и целых клеток к полимеру. Влияние компонентов крови на бактериальный связывания также следует рассматривать, возможно , путем повторения анализов связывания в присутствии инактивированной сыворотки или де-fibrinated крови 23. Окончательное испытание технологии будет в модели в естественных условиях , таких как модель 24 инфекции подкожного имплантата.
Мы демонстрируем потенциал метода полимерного микрочипов для скрининга поверхностных изменяющих полимеров. Такие полимеры (как противостоящие и способствующие связывания бактериальных) имеют большое количество применений в медицине, пищевой промышленности и биотехнологии, а это означает этот метод может быть полезен во многих областях исследований. Хотя работа здесь используются бактерии, метод может быть адаптирован к другим типам клеток и также другие химические микрочипов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | 05066 | |
| Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
| Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
| NMP | Sigma | 494496 | |
| LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
| Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
| Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
| Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
| Equipment | |||
| Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
| Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
| Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
| Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
| Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |
References
- Hansen, A., Mjoseng, H. K., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv. Healthc. Mat. 3 (6), 848-853 (2014).
- Tourniaire, G., Collins, J., et al. Polymer microarrays for cellular adhesion. Chem. Commun. (20), 2118-2120 (2006).
- Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers. J. Mat. Chem. 21 (1), 96-101 (2010).
- Hay, D. C., Pernagallo, S., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functionala hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Res. 6 (2), 92-102 (2011).
- Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
- Venkateswaran, S., Wu, M., et al. Bacteria repelling poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide) coatings for biomedical devices. J. Mat. Chem. B. 2 (39), 6723-6729 (2014).
- Pickering, H., Wu, M., Bradley, M., Bridle, H. Analysis of Giardia lamblia Interactions with Polymer Surfaces Using a Microarray Approach. Environ.l Sci. Technol. 46 (4), 2179-2186 (2012).
- Mizomoto, H. The Synthesis and Screening of Polymer Libraries using a High Throughput Approach. , (2004).
- How, S. E., Yingyongnarongkul, B., Fara, M. A., Díaz-Mochón, J. J., Mittoo, S., Bradley, M. Polyplexes and lipoplexes for mammalian gene delivery: from traditional to microarray screening. Comb. Chem. High Throughput Screen. 7 (5), 423-430 (2004).
- Thaburet, J. -F., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromol. Rapid Commun. 25 (1), 366-370 (2004).
- Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nat. Biotechnol. 30 (9), 868-875 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P.
- Lewis, K.
- Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G. Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during Development as a Biofilm. J. Bacteriol. 184 (4), 1140-1154 (2002).
- Reisner, A., Haagensen, J. A. J., Schembri, M. A., Zechner, E. L., Molin, S. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms. Mol. Microbiol. 48 (4), 933-946 (2003).
- Watnick, P. I., Kolter, R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm. Mol. Microbiol. 34 (3), 586-595 (1999).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8533-8554 (2013).
- Imstar. Pathfinder Technology for High Content Cellular Screening in Cell Biology and Genetoxicity Software version: 6.04I. , (2012).
- Williams, J. R., Clifford, A. A. Supercritical Fluid Methods and Protocols. 13, Humana Press. New Jersey. (2000).
- Kuo, J. Electron microscopy methods and protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Leslie, D. C., Waterhouse, A., et al. A bioinspired omniphobic surface coating on medical devices prevents thrombosis and biofouling. Nat. Biotechnol. 32 (11), 1134-1140 (2014).
- Bechert, T., Steinrücke, P., Guggenbichler, J. P. A new method for screening anti-infective biomaterials. Nat. Med. 6 (9), 1053-1056 (2000).
- May, R. M., Magin, C. M., et al. An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters. Clin. Transl. Med. 4, (2015).
- Chen, R., Willcox, M. D. P., Ho, K. K. K., Smyth, D., Kumar, N. Antimicrobial peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent subcutaneous infection models. Biomaterials. 85, 142-151 (2016).
