Introduction
Polymer microarrays geminiaturiseerde high-throughput platforms waarin tot 7000 1 polymeren op glazen objectglaasjes geprint parallelle analyse met prokaryote of eukaryote cellen 2. De hier gepresenteerde methode gebaseerd op wat we eerst in 2010 3 beschreven. Dit bewakingssysteem is toegepast op tal van celtypen waaronder humane hepatocyten 4, 5 stamcellen, renale tubulaire epitheelcellen 2, bacteriën 3,6 en protozoïsche pathogenen 7. In elk geval, polymeren ter bevordering of weerstaan binding van de cellen onder studie werden geïdentificeerd 8. Complexen van DNA met synthetische polykationische polymeren zijn ook gebruikt in de microarray-formaat voor high-throughput screening van kandidaten gentransfectie 9. En het screenen op cellen-substraatinteracties zijn polymeer microarrays ook gebruikt voor het evalueren materiaaleigenschappen 10.
"> Het vermogen van synthetische polymeren hechting van bacteriën te moduleren op een oppervlak is goed gevestigd 3,6,11. Talrijke factoren lading, hydrofobiciteit en oppervlakteruwheid van het polymeeroppervlak is bekend dat invloed bacteriële binding. De conventionele benadering van het ontdekken biomaterialen dat weerstaan binding van bacteriën door middel van opeenvolgend of empirisch ontwerpen en testen van een materiaal op een moment zijn arbeidsintensief, kostbaar en tijdrovend proces. Polymer microarrays bieden een aantrekkelijk alternatief voor het omzeilen van dergelijke beperkingen.-Oppervlak geassocieerde bacteriën groeien als een complexe populatie een biofilm genoemd - zoals biofilms zijn zeer goed bestand tegen een groot aantal milieu-invloeden en antibiotica. Dit is gedeeltelijk te wijten aan hun dichte extracellulaire matrix (bestaande uit eiwitten, polysacchariden en nucleïnezuren) 12 en voor een deel te wijten aan de verhoogde aanwezigheid van robuuste "persistor" cellen in biofilms 13. although de precieze mechanismen oppervlakte vereniging en daaropvolgende biofilmvorming moeilijk te karakteriseren, wordt algemeen aangenomen dat er drie verschillende stadia van groei oppervlak 14-16. Aanvankelijk, omkeerbare bevestiging wordt gevolgd door een sterkere hechting van cellen, de instelling van een biofilm door productie van een extracellulair eiwit en polysaccharide matrix en celproliferatie. Ten slotte is de mature biofilm releases vrij levende plankton cellen, die nieuwe infecties elders kunnen initiëren. Bacteriën-afstotende polymeren die de initiële hechting van bacteriën te voorkomen en verhinderen aldus vroege stadia van biofilmvorming, potentieel vormen een uitstekende oplossing voor het minimaliseren van infecties. Gezien de toename van antibioticaresistentie (en ook de intrinsiek hogere weerstand van oppervlakte-geassocieerde bacteriën 12), antibiotica-vrij middel om infecties van bijzonder belang. In een ziekenhuis, bacteriën-afstotende polymeercoatings kunnen direct medische toepassing bij de reductie van nosocomiale infecties, die ongeveer geïmplanteerde apparaten 17 gewoonlijk te vormen.
Hier wordt een high-throughput werkwijze voor het screenen van polymeren voor 381 afstotende werking tegen diverse pathogene bacteriën geassocieerd met nosocomiale infecties, gevolgd door hit validatie en navolgende bekleding en kwantitatief centrale veneuze catheter vervaardigd beschreven (figuur 1). In het kort werden de polymeren gespot op agarose gecoate objectglaasjes door contactdruk en na drogen en sterilisatie werden de geminiaturiseerde arrays geïncubeerd met klinisch belangrijke bacterieculturen. Na incubatie werden de microarrays voorzichtig gewassen en bacteriële hechtende cellen werden gekleurd en gevisualiseerd door fluorescentie. Vervolgens polymeren die bacteriële binding remden werden onderzocht op grotere schaal door bekleding op glazen dekglaasjes en gevisualiseerd door elektronenmicroscopie. geselecteerde repelleende polymeren werden vervolgens gecoat op commerciële katheters en naar aanhechting van bacteriën te verminderen met bijna 100-voudig.
Protocol
1. Bereiding van Agarose Coated Slides
Opmerking: Voor het vervaardigen van het polymeer microarrays worden glasplaatjes-aminoalkylsilane bekleed bekleed met agarose IB om niet-specifieke achtergrondbinding verkort en de evaluatie van polymeren die binden of afstoten bacteriën 6. Silaancoating vergemakkelijkt de binding van agarose op de objectglaasjes.
- Vormen een 2% (w / v) oplossing van agarose IB in gedestilleerd water in een fles van 250 ml.
- Na afdekken van de fles los, verwarm de suspensie in een microgolfoven in 30 seconden perioden tot opgelost. Zorg ervoor dat de kap niet goed is afgesloten om eventuele drukopbouw te voorkomen. Verwijder de fles regelmatig en schud zachtjes.
- Zorgen dat de vaste opgelost en de oplossing helder is. Giet dit agarose oplossing in een bekerglas van 100 ml, en plaats in een 65 ° C waterbad tot een vloeibare oplossing te handhaven.
- Dompel de silaan gecoate dia's in de agarose oplossing, uniforme coating, en wipe de achterkant van de slede met een tissuepapier.
- Droog de glaasjes met de beklede kant naar boven, in een stofvrije omgeving (bijvoorbeeld in een kast of zuurkast) gedurende minimaal 24 uur.
- Bevestigen van een uniforme bekleding door visuele inspectie. Coating kan gemakkelijk worden beoordeeld door de ademhaling op de slide - condens zal vormen op ongecoat regio's. Slechts slides volledig en gelijkmatig bedekt moet worden gebruikt voor microarray afdrukken.
2. Voorbereiding van Polymer Solutions voor afdrukken
- Bereid oplossingen (1% w / v) van een selectie van voorgevormde polymeren bestaande uit polyacrylaten, polyacrylamiden en polyurethanen in N-methylpyrrolidon (NMP) in glazen flesjes. (Bereiden 1 ml van elk polymeer). Vortex totdat het polymeer volledig is opgelost. Synthese van polymeren elders 6 beschreven.
- Met behulp van een micro-pipet, vul elk putje van een 384 microwell plaat met 25 pi polymeeroplossing, ervoor te zorgen dat er geen kruis Contaling en elk putje bevat een unieke polymeer. Gebruik NMP als negatieve controle in tenminste 2 putjes. Noteer de identiteit van de polymeer-oplossing in elk putje op een plaat met sjabloon of spreadsheet-bestand.
3. Printing Polymer Microarrays Met behulp van een printer Contact
LET OP: Het afdrukken van microarrays werd uitgevoerd met behulp van een contact printer. Specifieke instructies betreffende polymeer microarray afdrukken worden hieronder gegeven. Voor algemene richtlijnen over het gebruik van de aanbevelingen van de printer en de veiligheid, volg de handleiding van de fabrikant. Hoewel we een contact printer, kan een geschikte handmatige stempelen inrichting ook worden gebruikt.
- Zoals geadviseerd in de printer handleiding, het creëren van een routine (zie stap 3.3) dat het drukken van 384 vloeistoffen (de polymeeroplossingen of NMP) in viervoud maakt, met behulp van een 32-pins microarraying kop (ingericht als 8 rijen en 4 kolommen).
- Print 1536 plekken ingericht als 48 rijen en 32 kolommen. Programmeer de routine om af te drukken in 12 secties, dwz., 32 oplossingen tegelijk, zodat de printer kan worden gestopt na het afdrukken van elke sectie om voor het reinigen van pennen.
- Om een drukkerij routine te maken:
- Open de software en van de beschikbare opties te kiezen 'Maak een nieuwe routine'. Selecteer het tabblad 'Beschrijving' voor het invoeren van gegevens van het experiment. Selecteer het tabblad 'Head' en kies '32 pins microarraying head '.
- Selecteer het tabblad 'Source' en kies plaathouder (bron plaat houder (1x5)), typeplaatje (plate 384 x 6000), de totale platen (1) en de bron bestelling (door kolommen).
- In het tabblad 'Slide design', kies '3x1' 'slide' en kies arraying door 'Field nummer'. Selecteer vervolgens 'arraying patroon'. Input 'Spot view' als 'lay-out' en 'Pattern dimensies' als 'Row count' (6), 'Column count' (8), 'Row pitch' (750) en "Column pitch '(560). Kies een sectie naar sparren afdrukkent.
- In de 'Slide layout' tab-ingang het aantal dia's gebruikt voor het afdrukken. Selecteer het tabblad 'Afdrukken' voor het invoeren van de drukkerij parameters (aantal postzegels per inkt: 1, aantal zegels per spot: 5, stampen tijd: 200 msec, inkten tijd: 100 msec).
LET OP: Een routine is nu gemaakt voor het afdrukken van 384 vloeistoffen (de polymeeroplossingen of NMP) in viervoud, met behulp van een 32-pins microarraying kop (ingericht als 8 rijen en 4 kolommen). In totaal moet de routine 1536 plekken ingericht als 48 rijen en 32 kolommen met een rij steek van 750 urn en de kolom steek van 560 urn te drukken.
- Plaats de met agarose gecoate glaasjes op het platform en zorgen voor een goede vacuümafdichting op de objectglaasjes zijn plaats te houden.
- Pas de printkop zodat alle pennen op dezelfde hoogte. Controleer dit door het hoofd handmatig verlagen op een glasplaatje en wordt bevestigd dat de pennen bewegen op hetzelfde moment. Als er verschillen zijn met de hoogte, aan te passen met behulp van de sleeve op de pin omhoog of omlaag.
- Plaats de plaat goed op de plaat houder in de juiste richting, dwz., Goed A1 is om de top rechts van de houder en zorgen voor de wells plaat wordt stevig bevestigd.
- Met de hoogteversteller, opdat de hoogte van de plaathouder is zodanig dat bij het kiezen van de polymeeroplossingen de pennen niet de bodem van de putjes raken.
Opmerking: Dit is belangrijk voor gelijkmatige polymeer spotten en ook om morsen van polymeeroplossingen in aangrenzende putjes, waardoor kruisbesmetting veroorzaken. - Selecteer het tabblad 'Start' en kies de 'Run soort' als 'normaal'. Klik op 'Uitvoeren' en bevestig dat glijbaan, well plaat, enz., Zijn in de positie als daarom wordt gevraagd.
- Afdrukken 1 sectie per keer (32 oplossingen op een moment; 12 delen), waardoor voor het reinigen van de pennen tussen de secties. Reinig de pennen grondig met een papieren handdoek gedrenkt in aceton, gevolgd door droge tissue papier om te zorgen voor de pinnen volledig droog.
- Na voltooiing van het afdrukken van de microarrays, plaats ze in een houder en drogen gedurende de nacht in een vacuümoven ingesteld op 45 ° C aan de NMP te verwijderen in het polymeer vlekken. Na sterilisatie met UV licht gedurende 30 minuten, de microarrays klaar voor inoculatie van bacteriën.
- Voordat het enten van dia's met bacteriën, neem een meting van de achtergrond fluorescentie (zoals beschreven in paragraaf 5). Met deze meting bij de berekening van bacteriële binding.
4. Enten van Polymer Microarrays met Bacteriën
OPMERKING: Zorg voor een goede aseptische techniek. Alle behandeling van kweken worden uitgevoerd in een steriele omgeving: ofwel met een Bunsen brander of in een stroomkast. Culturen worden gekweekt met zuurstofbeschikbaarheid, groeimedium en temperatuur aangepast aan de behoeften van iedere soort.
- Bereid overnachtkweken door het enten 5 ml Luria-Bertani bouillon (LB: 10 g L -1 bacto-trypton, 5 g L -1 NaCl en 10 g L <sup> -1 gistextract) met een kolonie van een plaat. Incubeer overnacht bij 37 ° C, onder schudden bij 200 rpm.
- Bereid vriezer voorraden 's nachts culturen door toevoeging van glycerol (10% concentratie in totaal) en opslaan van de voorraad bij -80 ° C.
- Om het aantal cellen bepaald uit monsters van de ontdooide bacteriële voorraden Voer seriële verdunningen van elk bestand en groeien de bacteriën overnacht op vaste media. Nauwkeurige bepaling van het aantal cellen in aandelen zorgt voor een passende enting van elke soort 6.
- Bereid inocula voor microarray. Enkele soort kweken worden gekweekt zoals hierboven en rechtstreeks op de microarrays. BacMix-1 is een bacterieel mengsel van Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) en Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 is een bacterieel mengsel bestaande uit Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus K. pneumoniae en Enterococcus faecalis (E. faecalis).
- Ofwel mengcultuur produceren, meng overnachtingen in gelijke volumes (3 ml per stuk) en verdun vier keer met verse LB (tot ongeveer 50 ml uiteindelijk volume).
- Plaats-UV gesteriliseerd polymeer microarrays in rechthoekige 4 putjes en incubeer ze met 6 ml gemengde bacteriële kweken bij 37 ° C onder zacht schudden (30 rpm) gedurende 5 dagen.
- Na incubatie voorzichtig spoel de microarrays tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4) en incubeer met een oplossing van 1 pg ml-1 van 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring in PBS gedurende 30 min.
- Was de gebrandschilderde microarray dia's in een frisse goed plaat door het bedekken met PBS en voorzichtig te zwenken, het veranderen van de PBS een keer. Droog onder een luchtstroom. Breng een glazen afdekplaat slip aan de microarray glijbaan en afdichting op zijn plaats met lijm. eenmaal dry, steriliseren het buitenoppervlak met 70% (v / v) ethanol.
- Veilig te verwijderen culturen op basis van hun inperkingsniveau.
5. Microarray Imaging and Analysis
- Leg enkele beelden voor elke polymeer plek in helderveld en DAPI (Ex / Em = 358 nm / 361 nm) kanalen. Voer handmatig met een fluorescentiemicroscoop of middels een geautomatiseerde fluorescentie microscoop (met een XYZ stadium bestuurd door een beeldacquisitie software) uitgerust met een 20X objectief.
OPMERKING: Raadpleeg de handleiding 18 voor het bedienen van de software en het aanpassen van de microscoop om beelden met behulp van helderveld en DAPI kanalen te verkrijgen. Controleer of de versterking en belichtingstijd voor het vastleggen van alle microarrays zijn hetzelfde. - Het verkrijgen van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elke plek in de DAPI kanaal door te kiezen voor de spot gebied en kwantificeren van de fluorescentie met een beeld processing software.
- Voor de achtergrondfluorescentie van elke vlek, OBTAin beelden van het polymeer vlekken op overgenomen microarray geïncubeerd met alleen medium zonder bacteriën. Aftrekken van de achtergrond fluorescentie van de intensiteit van de spot op fluorescentie verkregen uit bacteriën.
- Bereken gemiddelde genormaliseerde waarde van de vier plaatsen, die elk polymeer, bij vergelijking bacteriën binden van verschillende polymeren 6.
- Identificeer de polymeren die het minst bacteriële binding (laagste fluorescentie) als 'hit' polymeren 6 vertonen.
6. Coating van Cover Slips voor 'Hit' Validation
- Om Coat Coverslips met Polymers:
- Bereid oplossingen treffer polymeren (~ 2% w / v) in tetrahydrofuran (THF), of ander geschikt oplosmiddel.
- Spin coat ronde glazen dekglaasjes van geschikte grootte met de polymeeroplossingen met een spinbekleder bij 2000 tpm gedurende 10 sec.
LET OP: Bij afwezigheid van een spin coater, dekglaasjes of andere materialen kan dip gecoat zijn, hoewel rotatiecoating produceert een uniform oppervlak. - Droog de beklede dekglaasjes in een convectieoven bij 40 ° C overnacht en gesteriliseerd met UV licht gedurende 30 minuten voorafgaand aan het inoculeren bacteriën.
- Om Coat Coverslips met Agarose voor negatieve controles:
- Schone dekglaasjes hetzij door plasmabehandeling gedurende 10 minuten of onder te dompelen in 1 M NaOH gedurende 4 uur.
- Dompel de dekglaasjes in acetonitril overnacht bevattende 1% (3-aminopropyl) triethoxysilaan. Reinig de dekglaasjes met aceton 3 keer en in een oven (100 ° C) gedurende 1 uur.
- Dip coat het gedroogde dekglaasjes met 1% agarose oplossing gehandhaafd in een waterbad van 60 ° C. Plaats de agarose gecoate dekglaasjes op vlakke oppervlak stofvrij omgevingsomstandigheden gedurende 24 h en gesteriliseerd met UV licht gedurende 30 minuten voorafgaand aan het inoculeren bacteriën.
7. Bevestiging en analyse van Cover Slip Met behulp van Scanning Electron Microscope (SEM)
- Nasterilisatie met UV licht gedurende 30 minuten, plaats de dekglaasjes (polymeer / agarose bekleed of onbekleed glas) in een standaard 12-well plaat of 24-well plaat (afhankelijk van de grootte van de dekglaasjes) en incubeer met bacteriën zoals beschreven in sectie 4.
- Na incuberen met bacteriën, was de onbeklede en beklede dekglaasjes tweemaal met 0,1 M cacodylaatbuffer (pH 7,4) en bevestig met 2,5% (w / v) glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaatbuffer (pH 7,4) gedurende 2 uur.
- Post-fix monsters met 1% (w / v) osmiumtetroxide gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en drogen met ethanol sequentiële wasbeurten bij 50, 70, 90 en 100% (v / v) gedurende 30 minuten elk.
- Droge monsters CO 2 volgens standaardprotocollen 19. De droogtijd hangt af van de aard van het monster.
- Coat monsters in een goud / palladium legering (60/40%) met een sputter coater met stroom op 30 mA en vacuüm bij 0,75 Torr. Onderzoek onder een elektronenmicroscoop volgens standaardprotocollen 20.
LET OP: Ensure adequate veiligheidsmaatregelen om de risico's als gevolg van de opslag, verwerking en afvoer van osmiumtetroxide te beheren, want het is zeer giftig. - Visueel vergelijken beelden van de niet-gecoate dekglaasjes en die bekleed met agarose of 'hit' polymeren bacteriële binding / afstotende vermogen van de polymeren te bevestigen.
LET OP: Weerstand van gehechtheid moet goed zichtbaar als een vermindering van de cellen aanwezig zijn. - Kies de meest veelbelovende 'hit' niet-bindende polymeren voor de coating studies met medische apparaten (bijv centraal veneuze katheters) 6.
8. Selectie van een oplosmiddel voor Coating katheters
- Evalueer verschillende oplosmiddelen op hun verenigbaarheid met de inwonende deel van de katheter, evenals hun vermogen om de "hit" polymeer op te lossen. Gesneden delen cath-1 en tot cilindrische stukken 5 mm lang, en meet met een digitale schuifmaat.
- Evalueer diverse oplosmiddelen zoals acetic acid, ammonia, aceton, acetonitril, diethylether, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide (DMF), N-methyl-2-pyrrolidon (NMP), ethanol, methanol, ethyleenglycol, tolueen en xyleen. Dompel katheter stukken in de oplosmiddelen voor 12 uur en beoordelen visueel integriteit van de katheter en duidelijkheid oplosmiddel.
OPMERKING: Kies een oplosmiddel dat niet leidt tot de katheters opzwellen en desintegreren of tot een troebele oplosmiddel. Het oplosmiddel moet de 'hit' polymeren ontbinden.
9. Analyse van de bacteriële Attachment op katheters door confocale microscopie
- Bereid 2,5% (w / v) polymeeroplossingen in aceton of een ander geschikt oplosmiddel zoals bepaald punt 8. Plaats 5 mm katheter stukjes in een kleine glazen flesjes (5 ml) en dompel hen in 1 ml van de polymeeroplossing gedurende 2 min . Verwijder het polymeeroplossing en droog de katheter stukjes overnacht in een vacuümoven bij 40 ° C.
- Bereid entstof door het mengen van ontdooide bacteriële stocks tot ongeveer 10 6 cellen van elke soort te geven in 50 ml LB 6.
- Steriliseren zonder deklaag katheter stukken met UV licht gedurende 30 minuten en geïncubeerd met 1 ml LB geïnoculeerd in een 24-puts plaat bij 37 ° C gedurende 3 dagen onder zacht schudden 6.
- Na incubatie was de catheters met PBS (2x 2 ml), bevestig de bacteriën met 10% paraformaldehyde in PBS gedurende 30 minuten en wassen met PBS (1 ml). Vlek de bacteriën op katheter stukken met DAPI (1 pg ml - 1) gedurende 20 minuten en wassen met PBS (1 ml).
- Verkrijgen confocale beelden van de katheter stukken met de volgende instellingen: 405nm blauwe laser diode, detector range 414-502 nm, pin hole - Airy1, beeldformaat - 1024 × 1024 pixels, voxel breedte - 105,2 nm, Z-stacks spacing 0.5μ m , vergroting - 40X 1,25.
- Voltooi de confocale beeldvorming door-Z stapelen 50 beelden over 100 pm lengte van de katheter.
- Analyseren van de beelden met behulp van suitable analyse software: plat de-Z gestapelde beelden in de Z-vlak, met behulp van de functie om de scherptediepte te verlengen, tot een enkel beeld van een katheter stuk te maken.
Opmerking: Dit beeld moet vervolgens worden geanalyseerd om het gebied van de katheter waarop bacteriën verkrijgen na achtergrond correctie met de functie 'plat achtergrond.
10. Analyse van de bacteriële Attachment op katheters met SEM
- Bereid 10% polymeeroplossing (w / v) in aceton.
- Druk op een pipet tip (voor 200 ul micropipet) in het midden gedeelte van de snede stuk van de katheter om het te houden en dompel het stuk in het polymeer oplossing voor ongeveer 30 sec. Droog de beklede stuk in omgevingsomstandigheden gedurende 30 min. Breng een tweede coating door opnieuw onder te dompelen in de polymeer-oplossing en droge overnachting in omgevingscondities.
- Na UV behandeling en incubatie met bacterieën stukken (n = 3) met PBS (2 x 1 ml) en overbrengen naar 48-well platen bevattende 10% formaldehyde in PBS gedurende 30 min. Na vaststelling, was de stukken met PBS (1 ml), droog gedurende de nacht bij kamertemperatuur monteren op stomp met geleidende carbon schijven en goud laag met een sputter coater (zie stap 7,5).
- Verkrijgen van beelden met behulp van een scanning elektronenmicroscoop 6.
Representative Results
Figuur 2 toont de aanhechting van bacteriën (genormaliseerde fluorescentie-intensiteit) een aantal polymeren zoals bepaald door microarray analyse. Locaties afgedrukt zonder polymeer (NMP) met de negatieve controle, agarose sterk bestand tegen bacteriële binding 6 - opgenomen fluorescentie is zeer laag. De weergegeven polymeren zijn lage bindingsaffiniteit hoewel in de meeste gevallen, de afstotende eigenschappen van een polymeer aanzienlijk verschilt bacteriesoorten getest. Dit weerspiegelt de grote verschillen tussen hechtmechanieken in verschillende soorten. De selectie van een geschikte polymeer is dus afhankelijk van de toepassing, maar de lage-bindende polymeren zijn gemakkelijk te herkennen in vergelijking met agarose. High-bindende polymeren waarschijnlijk worden op een matrix, en kan worden gebruikt als positieve controles voor volgende experimenten. Voor polymeren die geen auto-fluorescentie vertonen in de DAPI kanaal, kwalitatieve comparison van de contante foto kan visueel worden gemaakt (zie figuur 3, benadrukt een vertegenwoordiger hoogbindende polymeer en drie bijvoorbeeld lage bindingsaffiniteit polymeren). Deze vergelijking, terwijl minder informatie dan de statistische analyse, kan een bruikbare visuele validering van de intensiteitswaarden berekend worden.
Met 22 geschikte polymeren geïdentificeerd met behulp van de microarray worden scale-up experimenten uitgevoerd om hun bacteriën-afstotende eigenschap te bevestigen wanneer het wordt gebruikt voor het coaten van grotere oppervlakken. Worden de best presterende voorbeelden gebruikt voor het bekleden glazen dekglaasjes (met SEM analyse (figuren 4 en 5)) en catheter segmenten (geanalyseerd met confocale microscopie (figuur 6) en SEM (Figuur 7)). Beide microscopische werkwijzen hebben het voordeel dat directe celtellingen op het oppervlak, het verschaffen van ondubbelzinnige gegevens; vermindering van celhechting gemakkelijk visible. Deze bekledingen die hun beste afstotende eigenschappen vastgehouden op opschaling, evenals ontvankelijk voor grootschalige coating technieken, werden verder onderzocht. De getoonde resultaten illustreren de best presterende polymeren uit elke fase.
Figuur 1:. Stappen betrokken bij de identificatie van bacteriën afstotende polymeren met microarrays polymeer voor biomedische toepassingen SEM = scanning elektronenmicroscopie.
Figuur 2:. Bacteriële bindt een reeks polymeren, bepaald door microarray analyse lage bacteriële binding wordt gezien op een aantal polyacrylaten / acrylamide (PA) en polyurethanen (PU). Resultaten van polymeer microarray gehybridiseerd met verscheidene bacteriële s pecies (C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans, en twee consortia, BacMix-1 en BacMix-2) getoond. Bacteriële binding uitgedrukt als achtergrond gecorrigeerde gemiddelde DAPI fluorescentie-intensiteit (genormaliseerd). Fout balken geven standaarddeviatie. Aangepast van referentie-6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Voorbeeld afbeeldingen van polymeer plekken Fluorescence (DAPI) en helderveld microscopie beelden van BacMix-2 toont bacteriële beslag op representatieve polymeren. Sterk bindende polymeer is opgenomen ter vergelijking met verscheidene niet-bindende polymeren (PU-20, PA-336 en PU-179). Schaal bar = 100 micrometer. Aangepast van referentie-6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Schaal-up experimenten met glazen dekglaasjes SEM beelden die bacteriële hechting op ongecoat glas en glas bekleed met 'hit' polymeren (voorbeelden gekozen uit Tabel 1).. Schaalbalken = 20 urn.
Figuur 5:. Bacteriële binding gekwantificeerd door cel-tellingen van SEM beelden Vergelijking van cellen bevestigd per oppervlakte-eenheid van oppervlakken bekleed met het beste 'hit' polymeren. Agarose werd gebruikt als controle "niet-bindende" oppervlak, met glas als controle bindingsoppervlak. Error bars vertegenwoordigtstandaardafwijking.
Figuur 6: Vergelijking van bacteriële binding op gecoat en ongecoat catheter segmenten Confocale beelden vergelijken onbehandeld katheter (cath-1) (A) en katheter gecoat met PA13 (B) na incubatie met BacMix-2.. Beelden die met een 40x objectief (schaal bar = 20 pm). Aangepast van referentie-6.
Figuur 7:. Vergelijking van bacteriële binding op gecoate en ongecoate catheter segmenten SEM beelden tonen vergelijking van onbehandelde katheter (cath-1) (A) en katheter gecoat met PA13 (B) na incubatie met een bacterieel cocktail bestaande uit BacMix-2 Scale. bars = 101; m. Aangepast van referentie-6.
| Polymeer | monomeer 1 | monomeer 2 | monomeer 3 | Verhouding Monomeren | ||
| PA465 | MEMA | DEAEMA | HEA | 8 | 1 | 1 |
| PA475 | MEMA | DEAEA | HEMA | 6 | 1 | 3 |
| PA513 | MEMA | DEAEMA | MMA | 8 | 1 | 1 |
| PA515 | MEMA | DEAEA | MMA | 6 | 1 | 3 |
| PA13 | DMAA | - | 9 | 1 | - | |
| PU1 | PEG2000 | HDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU16 | PEG2000 | MDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU161 | PEG2000 | MDI | BD | 2.5 | 5.2 | 2.3 |
| PU7 | PEG900 | BICH | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU83 | PEG900 | HMDI | BD | 2.5 | 5.2 | 2.3 |
| PU227 | PPG-PEG-1900 | HDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU129 | PPG425 | BICH | DMAPD | 2.5 | 5.2 | 2.3 |
| PU10 | PTMG2000 | BICH | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU179 | PTMG2000 | HDI | NMAPD | 2.5 | 5.2 | 2.3 |
| PU20 | PTMG2000 | MDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
| PU5 | PTMG2000 | HDI | - | 4.9 | 5.2 | - |
Tabel 1: Samenstelling van de bacteriën niet-bindende 'hit' polymeren in figuur 2.
Discussion
Aanhechting van bacteriën aan een oppervlak een complex proces bepaald door een groot aantal factoren afhankelijk van de bacteriën, de eigenschappen van het oppervlak, het omringende medium en de fysieke omgeving. Hoewel bepaalde chemische groepen is bekend dat bacteriële binding beïnvloeden (polyglycolen, bijvoorbeeld kenmerkend resist attachment 11), het correleren van de biologische gevolgen van polymeren met hun chemische structuren moeilijk, rationeel ontwerp van polymeren voor specifieke functies uitdagend. Bij gebrek aan gedetailleerde hechtmechanieken, hebben andere studies geprobeerd om natuurlijk voorkomende afstotende oppervlakken met langdurige en uitgebreide optimalisatieprocessen 21 nabootsen. De geminiaturiseerde high-throughput hier gepresenteerde methode overwint deze problemen door het vergemakkelijken van parallel screenen van honderden polymeren leads identificeren voor verdere studie.
De resultaten van de microarray methode voornamelijk dienen om identify waarschijnlijk leiden kandidaten. Figuur 2 toont 22 kandidaten met lage bindingsaffiniteit van ten minste één soort, terwijl figuur 3 toont de duidelijke vermindering bindingscapaciteit. Alle 22 low-bindende polymeren in figuur 2 getoond werden voorwaarts gemaakt in scale-up experimenten, waarin de beste (in termen van afstoting en coating eigenschappen) waren vastbesloten om PU83, PA13 en PA515 zijn (figuren 4 en 5). Polyacrylaten bieden meer flexibiliteit in polymerisatiewerkwijzen en dus de laagste bindende polyacrylaat, PA13, werd gekozen katheter coating studies (figuren 6 en 7). Meer gedetailleerde verdere werkzaamheden op andere kandidaten werd uitgevoerd en is elders 6 gemeld.
Door middel van een aantal experimentele iteraties vonden we een aantal kleine stappen waren sleutel tot succes en reproduceerbaarheid. Alsook om de hechting van depolymeren de glasplaatjes, met gebruik van agarose onder-coating zorgt voor een schone achtergrond, agarose is goed bestand tegen bacteriële kolonisatie. Ook consistentie in het polymeer vlekken zelf, binnen dezelfde array en tussen arrays essentieel en derhalve het drukken van de matrices moeten zorgvuldig worden gecontroleerd. Zorgvuldige aanpassing van de pennen in de printkop en ook uniform vullen van de 384-wells plaat nodig zijn om een uniforme spotten garanderen. Zoals sommige van de polymeren we gebruikten vertoonden een zekere mate van autofluorescentie, waarbij achtergrond fluorescentie gegevens voor elke dia vóór incubatie met bacteriën was van vitaal belang. Om rekening te houden met variaties en voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens replica van microarrays worden geadviseerd.
De vlek hier toegepaste (DAPI) geen selectiviteit voor bacteriën, binden niet specifiek aan DNA. Daarom is een goede aseptische techniek is essentieel eenmaal bacterieculturen worden geïntroduceerd als verontreinigingen kunnen onopgemerkt blijven, verwarrende de uitleggingtatie van de resultaten. Hetzelfde geldt voor latere experimenten met scanning elektronenmicroscopie, waarbij het alleen mogelijk om staven en cocci onderscheiden maar niet genus of soort.
Na microarray screening moet veelbelovende polymeren worden gekozen voor verdere validatie. In het hier gepresenteerde voorbeeld werden zeven polymeren van belang die in de duidelijke afname in fluorescentie op de microarray en de remming van aanhechting werd bevestigd door ze te bekleden op grotere oppervlakken. Figuren 4 en 5 tonen de verlaging van binding gerealiseerd op glazen dekglaasjes, een praktische middelen om het gedrag van de polymeren als coatings bulk plaats van microarray spots testen. Vervolgens werden deze polymeren gecoat op medische hulpmiddelen aan vermindering van de bacteriële aanhechting volledig te kwantificeren. Het is belangrijk dat het oplosmiddel gekozen (zie protocol rubriek 8) voor deze coating studies goedaardig het gewenste substraat (hier de katheter) tijdens bewarening vermogen om het polymeer plaats lossen, om coating mogelijk. Hier gebruikten we aceton die, evenals de genoemde eigenschappen een laag kookpunt en verdampt snel om een gelijkmatige bekleding te verlaten.
De wijze van validering gekozen zal afhangen van de specifieke toepassing die wordt onderzocht. Als waarneming van cellen door elektron en fluorescentiemicroscopie maakt directe kwantificering van gehechtheid individuele cel, kozen we deze technieken als een aanvulling op de bulk vlekken microarray test. Resultaten worden in figuren 6 en 7, waarin het belang van gratis validatiemethoden tonen. De confocale beelden in figuur 6 geven duidelijk beelden van individuele cellen, terwijl de SEM heeft het extra voordeel dat een beoordeling van het oppervlak van het polymeer, die hier glad en gelijkmatig. Deze methoden zijn beperkt door het beeldveld van de gebruikte microscoop, en daarom is important om een reeks foto's te nemen om het vertrouwen in de resultaten. De hierboven beschreven werkwijze kan niet kwantificeren bacteriële hechting over het gehele oppervlak, alleen verzekerd afleiden uit een aantal kleine gebieden. Wij geloven dat dit voldoende is voor de beschreven toepassing. Vermindering van bacteriële binding kan worden bepaald door het opsommen oppervlak gehecht bacteriën op de gehele gecoate en ongecoate katheter stukken met werkwijzen zoals elders 22 beschreven. Maar dergelijke werkwijzen vereisen biomateriaaloppervlakken gezeefd om een uniform oppervlak, dat moeilijk te handhaven wanneer assays worden uitgevoerd met medische hulpmiddelen, die vaak complexe geometrie.
Het is duidelijk dat elk apparaat bestemd voor klinisch gebruik gaan door aanzienlijke verdere tests om de veiligheid en werkzaamheid bij de mens te waarborgen. De hier gepresenteerde methode staat voor het begin van dit proces en de verdere werkzaamheden moet een bevestiging van de in vivo activiteit bevatten. In dit geval bestuderen veneuze catheters, eerste werkzaamheden kon onderzoeken de binding van bloedcomponenten en hele cellen aan het polymeer. Het effect van bloedcomponenten op bacteriële binding moet ook worden overwogen, eventueel door herhaaldelijk bindingstesten in de aanwezigheid van geïnactiveerde serum of de-fibrinated bloed 23. De definitieve test van de technologie in een in vivo model zoals onderhuidse implantaat infectiemodel 24.
We demonstreren het potentieel van het polymeer microarray werkwijze voor het screenen van oppervlakte veranderende polymeren. Dergelijke polymeren (zowel bestendig bevorderen bacteriële binding) hebben een groot aantal toepassingen in de geneeskunde, de voedingsindustrie en biotechnologie, betekent deze werkwijze kan nuttig zijn in veel gebieden van onderzoek. Hoewel het werk hier gebruikt bacteriën, kan de werkwijze worden aangepast om andere celtypen en eveneens andere chemische microarrays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | 05066 | |
| Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
| Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
| NMP | Sigma | 494496 | |
| LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
| Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
| Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
| Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
| Equipment | |||
| Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
| Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
| Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
| Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
| Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |
References
- Hansen, A., Mjoseng, H. K., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv. Healthc. Mat. 3 (6), 848-853 (2014).
- Tourniaire, G., Collins, J., et al. Polymer microarrays for cellular adhesion. Chem. Commun. (20), 2118-2120 (2006).
- Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers. J. Mat. Chem. 21 (1), 96-101 (2010).
- Hay, D. C., Pernagallo, S., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functionala hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Res. 6 (2), 92-102 (2011).
- Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
- Venkateswaran, S., Wu, M., et al. Bacteria repelling poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide) coatings for biomedical devices. J. Mat. Chem. B. 2 (39), 6723-6729 (2014).
- Pickering, H., Wu, M., Bradley, M., Bridle, H. Analysis of Giardia lamblia Interactions with Polymer Surfaces Using a Microarray Approach. Environ.l Sci. Technol. 46 (4), 2179-2186 (2012).
- Mizomoto, H. The Synthesis and Screening of Polymer Libraries using a High Throughput Approach. , (2004).
- How, S. E., Yingyongnarongkul, B., Fara, M. A., Díaz-Mochón, J. J., Mittoo, S., Bradley, M. Polyplexes and lipoplexes for mammalian gene delivery: from traditional to microarray screening. Comb. Chem. High Throughput Screen. 7 (5), 423-430 (2004).
- Thaburet, J. -F., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromol. Rapid Commun. 25 (1), 366-370 (2004).
- Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nat. Biotechnol. 30 (9), 868-875 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Evolving concepts in biofilm infections. Cell. Microbiol. 11 (7), 1034-1043 (2009).
- Lewis, K. Persister Cells. Ann. Rev. Microbiol. 64 (1), 357-372 (2010).
- Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G. Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during Development as a Biofilm. J. Bacteriol. 184 (4), 1140-1154 (2002).
- Reisner, A., Haagensen, J. A. J., Schembri, M. A., Zechner, E. L., Molin, S. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms. Mol. Microbiol. 48 (4), 933-946 (2003).
- Watnick, P. I., Kolter, R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm. Mol. Microbiol. 34 (3), 586-595 (1999).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8533-8554 (2013).
- Imstar. Pathfinder Technology for High Content Cellular Screening in Cell Biology and Genetoxicity Software version: 6.04I. , (2012).
- Williams, J. R., Clifford, A. A. Supercritical Fluid Methods and Protocols. 13, Humana Press. New Jersey. (2000).
- Kuo, J. Electron microscopy methods and protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Leslie, D. C., Waterhouse, A., et al. A bioinspired omniphobic surface coating on medical devices prevents thrombosis and biofouling. Nat. Biotechnol. 32 (11), 1134-1140 (2014).
- Bechert, T., Steinrücke, P., Guggenbichler, J. P. A new method for screening anti-infective biomaterials. Nat. Med. 6 (9), 1053-1056 (2000).
- May, R. M., Magin, C. M., et al. An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters. Clin. Transl. Med. 4, (2015).
- Chen, R., Willcox, M. D. P., Ho, K. K. K., Smyth, D., Kumar, N. Antimicrobial peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent subcutaneous infection models. Biomaterials. 85, 142-151 (2016).
