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Bioengineering

High-throughput identificação de bactérias Polymers Repelente para dispositivos médicos

doi: 10.3791/54382 Published: November 5, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

Microarrays de polímero são miniaturizados plataformas de alto rendimento em que até 7.000 polímeros 1 são impressos em lâminas de vidro para análise paralela com células procarióticas ou eucarióticas 2. O método aqui apresentado baseia-se no que foi descrito pela primeira vez em 2010 3. Este sistema de rastreio tenha sido aplicada a numerosos tipos de células incluindo hepatócitos humanos 4, as células-tronco 5, células epiteliais tubulares renais 2, bactérias e patogénicos protozoários 3,6 7. Em cada caso, os polímeros que promovem ou resistir ligação das células em estudo foram identificados 8. Os complexos de ADN com polímeros policatiónicos sintéticos também têm sido utilizados no formato de microarray para o rastreio de alto rendimento de transfecção de genes candidatos 9. Bem como a triagem para as interacções célula-substrato, microarrays de polímero também têm sido usados para avaliar as propriedades do material 10.

"> A capacidade dos polímeros sintéticos para modular a ligação de bactérias a uma superfície está bem estabelecida 3,6,11. Numerosos factores, incluindo a carga, a hidrofobicidade e a rugosidade da superfície da superfície do polímero são conhecidos por afectarem. As abordagens convencionais de ligação bacterianas de biomateriais descobrindo que resistem a ligação de bactérias através sequencialmente ou empiricamente projetar e testar um único material de cada vez são, caro e processos demorados de trabalho intensivo. microarrays Polymer oferecer uma alternativa atraente para contornar essas limitações.

bactérias associadas à superfície crescem como uma população complexa denominada um biofilme - tais biopelículas são altamente resistentes a muitos stresses ambientais e antibióticos. Isto é em parte devido à sua matriz extracelular densa (composto por proteínas, polissacáridos e ácidos nucleicos) 12 e em parte devido ao aumento da presença de "células" persistor robustos em biofilmes 13. althourg os mecanismos precisos da associação de superfície e a subsequente formação do biofilme são difíceis de caracterizar, geralmente acredita-se que existem três estágios diferentes de crescimento de superfície 14 - 16. Inicial anexo, reversível é seguido por mais forte adesão de células, o estabelecimento de um biofilme pela produção de uma proteína extracelular e matriz de polissacárido e proliferação celular. Finalmente, os lançamentos biofilme maduro células planctônicas, que podem iniciar novas infecções em outros lugares de vida livre. polímeros que impedem a fixação inicial de bactérias e, portanto, impedem estágios iniciais de formação de biofilmes de bactérias repelente, potencialmente representam uma excelente solução para minimizar infecções. Dado o aumento da resistência aos antibióticos (e também a intrinsecamente maior resistência de bactérias associadas a superfície 12), meios livre de antibióticos de reduzir infecções são de particular interesse. Num ambiente hospitalar, bactérias polímero que repelerevestimentos podem ter uma aplicação médica direta na redução de infecções nosocomiais, que geralmente formam dispositivos torno implantados 17.

Aqui, um método de alto rendimento para o rastreio de 381 de polímeros para a actividade repelente contra uma gama de bactérias patogénicas associadas com as infecções nosocomiais, seguido de validação batida e revestimento subsequente e ensaio de materiais de cateteres venosos centrais, é descrito (Figura 1). Resumidamente, os polímeros foram depositados em lâminas de vidro revestidas com agarose por impressão por contacto e, após a secagem e esterilização, as matrizes miniaturizados foram incubadas com culturas bacterianas clinicamente importantes. Após a incubação, as micromatrizes foram suavemente lavadas e as células bacterianas aderentes foram coradas e visualizados por fluorescência. Subsequentemente, os polímeros que inibiram a ligação bacteriana foram investigadas em maior escala por revestimento sobre lamelas de vidro e visualizadas por microscopia de electrões. repelem selecionadaspolímeros emprestados foram então revestidas sobre cateteres comerciais e mostrado para reduzir a ligação de bactérias por quase 100 vezes.

Protocol

1. Preparação de slides de agarose revestidas

NOTA: Antes de fabricar micromatrizes de polímero, lâminas de vidro revestidas com aminoalkylsilane são revestidas com agarose IB fundo para minimizar a ligação não específica e permitem a avaliação de polímeros que se ligam ou repelir bactérias 6. revestimento de silano facilita a ligação de agarose para as lâminas.

  1. Adicione-se uma solução de 2% de agarose IB em água destilada em um frasco de 250 ml (v / w).
  2. Depois de nivelar a garrafa frouxamente, aquecer a suspensão em um forno de microondas em períodos de 30 seg até se dissolver. Certifique-se de que a tampa não está bem fechado para evitar qualquer potencial acumulação de pressão para cima. Remova o frasco regularmente e homogeneizar suavemente.
  3. Assegure-se que o sólido se tenha dissolvido e a solução é clara. Coloque esta solução de agarose para um copo de 100 ml, e colocar num banho de água a 65 ° C para manter uma solução líquida.
  4. Mergulhar as lâminas com revestimento de silano na solução de agarose, assegurar um revestimento uniforme, e Wipe a parte de trás da lâmina com um papel de seda.
  5. Secam-se as lâminas, com o lado revestido para cima, em um ambiente livre de poeira (por exemplo, dentro de um armário ou exaustor de fumos) para um mínimo de 24 hr.
  6. Confirmar um revestimento uniforme por inspeção visual. Revestimento pode ser facilmente avaliada pela respiração para o slide - se formar condensação em regiões não revestidos. Somente lâminas revestidas inteiramente e uniformemente deve ser usado para a impressão de micro-arranjo.

2. Preparação de soluções de polímeros para impressão

  1. Preparar soluções (1% w / v) de uma variedade de polímeros pré-formados que consistem em poliacrilatos, poliacrilamidas e poliuretanos em N-metilpirrolidona (NMP) em frascos de vidro. (Preparar 1 mL de cada polímero). Vortex até o polímero estar completamente dissolvido. Síntese de polímeros é descrito em outra parte 6.
  2. Usando uma micro-pipeta, encher cada poço de uma placa de micropoços com 384 solução de polímero de 25 ul, garantindo que não há Conta transversalminação e cada poço contém um polímero único. Use NMP como um controlo negativo em pelo menos 2 poços. Grave a identidade de solução de polímero em cada poço em um arquivo de modelo de placa ou folha de cálculo também.

3. Imprimir Polymer Microarrays Usando um contato Printer

Nota: A impressão de microarrays foi realizada utilizando uma impressora de contacto. instruções específicas sobre a impressão microarray polímero são dadas abaixo. Para obter orientações gerais sobre como utilizar as recomendações da impressora e de segurança, siga o manual do usuário do fabricante. Apesar de usarmos uma impressora de contacto, um dispositivo de estampagem manual capaz também poderia ser utilizado.

  1. Como recomendado no manual do usuário da impressora, criar uma rotina (veja o passo 3.3) que permite a impressão de 384 líquidos (as soluções de polímeros ou NMP) em quadruplicado, usando uma cabeça microarraying 32 pinos (organizados como 8 linhas e 4 colunas).
  2. Imprimir 1.536 pontos arranjados como 48 linhas e 32 colunas. Programar a rotina para imprimir em 12 de secçãos, ou seja., 32 soluções de cada vez, de modo a que a impressora pode ser parado após a impressão de cada secção para permitir a limpeza dos pinos.
  3. Para criar uma rotina de impressão:
    1. Abra o software e entre as opções disponíveis escolha 'Criar uma nova rotina'. Selecione a guia 'Descrição' para detalhes de entrada do experimento. Selecione a guia 'Head' e escolha '32 cabeça microarraying pinos '.
    2. Selecione a guia 'Fonte' e escolha suporte da placa (suporte da placa de origem (1x5)), tipo placa (placa de 384 x 6.000), placas totais (1) e ordem de origem (por colunas).
    3. Na aba "design Slide ', escolha' 3x1 '' slides 'e escolha arraying por' Número de campo '. Em seguida, selecione "padrão arraying '. Input "visão do ponto" como "disposição" e "dimensões padrão" como "contagem Row '(6),' contagem coluna '(8),' pitch Row '(750) e' pitch coluna '(560). Escolha uma seção para imprimir abetost.
    4. Na entrada do guia "Layout Slide 'o número de lâminas usadas para impressão. Selecione a guia 'Print' para inserir os parâmetros de impressão (número de selos por tintagem: 1, número de selos por local: 5, tempo de estampagem: 200 ms, tempo de tintagem: 100 ms).
      NOTA: A rotina agora é criado para a impressão de 384 líquidos (as soluções de polímeros ou NMP) em quadruplicado, usando uma cabeça microarraying 32 pinos (organizados como 8 linhas e 4 colunas). No total, a rotina deve imprimir 1.536 pontos arranjados como 48 linhas e 32 colunas com um arremesso de linha de 750 mm e altura de 560 mm coluna.
  4. Colocar as lâminas revestidas de agarose na plataforma e garantir uma boa vedação de vácuo para segurar as lâminas em posição.
  5. Ajustar a cabeça de impressão de modo a que todos os pinos estão à mesma altura. Assinale esta baixando a cabeça manualmente para uma lâmina de vidro, e confirmando que os pinos movem-se ao mesmo tempo. Se houver alguma discrepância com a altura, ajuste usando a sleeve sobre o pino para cima ou para baixo.
  6. Coloque a placa bem no suporte da placa na orientação correta, ie., O poço A1 está no topo direito do titular e garantir a placa poço está fixado firmemente.
  7. Usando o ajustador de altura, assegurar que a altura do suporte da placa é de tal modo que ao escolher as soluções de polímero, os pinos de não tocar no fundo dos poços.
    NOTA: Isto é importante para a mancha polímero uniforme e também para evitar o derramamento de soluções de polímeros em poços adjacentes, causando a contaminação cruzada.
  8. Selecione a guia "Iniciar" e selecione o "Tipo de funcionar" como 'Normal'. Clique em "Executar" e confirmar que slide, bem placa, etc., estão na posição quando solicitado.
  9. Imprimir uma seção de cada vez (32 soluções de cada vez; 12 seções), permitindo a limpeza de pinos entre seções. Limpe os pinos cuidadosamente com toalha de papel embebido em acetona, seguido pelo papel de tecido seco, para garantir os pinos são totalmente seco.
  10. Na conclusão da impressão das micromatrizes, colocá-los no porta-lâminas e secá-las durante a noite num forno de vácuo regulado a 45 ° C para remover o NMP nos pontos de polímero. Após esterilização com luz UV durante 30 min, as micromatrizes estão prontos para inoculação de bactérias.
  11. Antes de inocular lâminas com bactérias, fazer uma medição da fluorescência de fundo (como descrito no capítulo 5). Use esta medida no cálculo da ligação bacteriana.

4. Inoculação de polímero Microarrays com bactérias

NOTA: Assegurar uma boa técnica asséptica. Toda a manipulação de culturas devem ser realizadas num ambiente estéril: ou usando um bico de Bunsen ou numa câmara de fluxo. As culturas deverão ser cultivadas com disponibilidade de oxigénio, meio de crescimento, e a temperatura ajustada para os requisitos de cada espécie.

  1. Prepare a culturas de uma noite inoculando 5 ml de meio Luria-Bertani (LB: 10 g L-1 de Bacto-triptona, 5 g L-1 de NaCl, e 10 g de L <sup> -1 de extrato de levedura), com uma colônia de uma placa. Incubar durante a noite a 37 ° C, agitação a 200 rpm.
  2. Prepare existências congeladores de culturas durante a noite pela adição de glicerol (10% de concentração global) e armazenar o material a -80 ° C.
  3. A fim de determinar os números de células a partir de amostras das existências bacterianas descongeladas, realizar diluições em série de cada unidade e fazer crescer as bactérias durante a noite em meios sólidos. A determinação precisa do número de células em ações garante a inoculação adequado de cada espécie 6.
  4. Preparar inóculos para microarray. culturas única espécie são cultivadas como acima e aplicado diretamente sobre os microarrays. BacMix-1 é uma mistura de bactérias de Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus), e Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 é uma mistura que consiste bacteriana de Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus K. pneumoniae e Enterococcus faecalis (E. faecalis).
  5. Para produzir qualquer cultura mista, misture overnights em volumes iguais (3 ml cada) e diluir quatro vezes com LB fresco (para cerca de 50 ml de volume final).
  6. Coloque microarrays de polímeros esterilizados por radiação UV em placas de 4 poços rectangulares e incube-as com 6 ml de culturas de bactérias misturadas a 37 ° C com agitação suave (30 rpm) durante 5 dias.
  7. Após a incubação, lave as micromatrizes duas vezes com salino tamponado com fosfato (PBS: 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4) e incuba-se com uma solução de 1? G ml -1 de quatro ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) mancha em PBS durante 30 min.
  8. Lavar as lâminas coradas microarray numa placa de fresco através da cobertura com PBS e agitando suavemente, mudando o PBS uma vez. Seca-se sob um fluxo de ar. Aplicar uma lamela de vidro para o slide microarray eo selo no lugar com cola. Uma vez que dry, esterilizar a superfície exterior com 70% (v / v) de etanol.
  9. Eliminar de forma segura culturas de acordo com seu nível de confinamento.

5. Microarray Imaging and Analysis

  1. Capturar imagens individuais para cada ponto de polímero em claro e DAPI canais (EX / Em = 358 nm / 361 nm). Executar esta manualmente com um microscópio de fluorescência ou através de um microscópio de fluorescência automatizada (com uma fase XYZ controlado por um software de aquisição de imagem) equipado com uma objectiva de 20x.
    NOTA: Consulte o manual de 18 para operar o software e ajustando o microscópio para obter imagens usando canais claro e DAPI. Certifique-se de que o tempo de exposição e ganho para captação de imagem para todas as micromatrizes são os mesmos.
  2. Obter a intensidade de fluorescência média de cada ponto no canal DAPI escolhendo área do local e quantificando a fluorescência com um software de processamento de imagem.
  3. Para a fluorescência de fundo de cada local, obtaem imagens das manchas de polímero sobre um micro-arranjo idêntico incubadas apenas com meios de comunicação sem bactérias. Deduzir a fluorescência de fundo a partir da intensidade da mancha para obter a fluorescência a partir de bactérias.
  4. Calcular o valor normalizado média dos quatro pontos, representando cada polímero, usado para comparar as bactérias de ligação de vários polímeros 6.
  5. Identificar os polímeros que exibem a bacteriana de ligação (menor de fluorescência) menos como polímeros 'hit' 6.

6. Revestimento de lamínulas de Validação 'Hit'

  1. Para Lamelas revestimento com polímeros:
    1. Preparar soluções de polímeros "hit" (~ 2% w / v) em tetra-hidrofurano (THF), ou outro solvente apropriado.
    2. revestimento rotação lamelas de vidro circular com o tamanho apropriado com as soluções de polímero, utilizando um revestidor de centrifugação a 2.000 rpm durante 10 s.
      NOTA: Na ausência de um revestidor de rotação, lamelas ou outros materiais podem ser revestidos por imersão, centrifugação, emborarevestimento produz uma superfície mais uniforme.
    3. Secam-se as lamelas revestidas num forno de convecção a 40 ° C durante a noite e esterilizar com luz UV durante 30 min antes de as bactérias de inoculação.
  2. Para Lamelas revestimento com Agarose dos controlos negativos:
    1. lamelas limpos ou por tratamento com plasma durante 10 min ou imergindo em NaOH 1 M durante 4 h.
    2. Mergulhar as lamelas em acetonitrilo contendo 1% de silano (3-aminopropil) durante a noite. Limpar as lamelas 3 vezes com acetona e colocado num forno (100 ° C) durante 1 h.
    3. Dip revestir as lamelas secas com solução aquosa de agarose a 1% mantidos num banho de água a 60 ° C. Coloque as lamelas revestidas de agarose sobre uma superfície plana em condições de ambiente livre de poeira durante 24 horas e esterilizar com luz UV durante 30 min antes de as bactérias de inoculação.

7. Anexo e Análise de deslizamento de tampa usando Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)

  1. Depois deesterilização com luz UV durante 30 minutos, colocar as peças de cobertura (polímero / vidro de agarose revestidos ou não revestidos) numa placa de 12 poços padrão ou uma placa de 24 poços (dependendo do tamanho das lamelas) e incuba-se com bactérias tal como descrito na secção 4.
  2. Após incubação com bactérias, lavar as lamelas revestidas e não revestidas duas vezes com tampão de cacodilato 0,1 M (pH 7,4) e, em seguida, fixar com 2,5% (w / v) de glutaraldeído em tampão de cacodilato 0,1 M (pH 7,4) durante 2 h.
  3. amostras pós-fix com 1% (w / v) de tetróxido de ósmio durante 1 hora à temperatura ambiente e desidratar com lavagens de etanol sequenciais em 50, 70, 90 e 100% (v / v) durante 30 min cada.
  4. As amostras secas em CO 2 de acordo com protocolos padrão de 19. O tempo de secagem vai depender da natureza da amostra.
  5. amostras de revestimento em uma liga de ouro / paládio (60/40%), utilizando um revestidor por crepitação com corrente de 30 mA e vácuo, a 0,75 torr. Examine sob um microscópio eletrônico de acordo com protocolos padrão 20.
    NOTA: EnsUre precauções de segurança adequadas para gerir os riscos resultantes de armazenamento, manuseio e descarte de tetróxido de ósmio, uma vez que é altamente tóxico.
  6. comparar visualmente imagens de as lamelas não revestidos e aqueles revestida com agarose ou os polímeros 'hit' para confirmar / repelindo capacidades de ligação bacterianas dos polímeros.
    Nota: A resistência de fixação devem ser facilmente visíveis como uma redução de células presentes.
  7. Escolha o mais promissor 'hit' polímeros não vinculativas para os estudos de revestimento com dispositivos médicos (por exemplo, cateteres venosos centrais) 6.

8. Selecção de um solvente para o revestimento de cateteres

  1. Avaliar vários solventes para a sua compatibilidade com a parte de habitação do cateter, bem como a sua capacidade de dissolver o polímero "hit". Corte partes de cath-1 e em pedaços cilíndricos 5 mm de comprimento, e medir com uma pinça Vernier digital.
  2. Avaliar vários solventes, tais como acetoácido CI, amónia, acetona, acetonitrilo, éter dietílico, tetra-hidrofurano (THF), dimetilformamida (DMF), N-metil-2-pirrolidona (NMP), etanol, metanol, etileno glicol, tolueno e xileno. Imergir peças cateter na solventes durante 12 horas e avaliar visualmente para a integridade do cateter e a clareza do solvente.
    NOTA: Escolha um solvente que não cause os cateteres para inchar ou desintegrar-se ou resultar em um solvente turva. O solvente deve dissolver os polímeros 'hit'.

9. Análise do Anexo bacteriana nos cateteres por Microscopia Confocal

  1. Prepare a 2,5% (w / v) de soluções de polímero em acetona, ou outro solvente adequado, tal como determinado na secção 8. Colocar 5 mm peças cateter numa pequenos frascos de vidro (5 ml) e mergulha-as em 1 ml da solução de polímero durante 2 min . Remover o excesso de solução de polímero e secar as peças de cateter durante a noite num forno de vácuo a 40 ° C.
  2. Prepare inóculo misturando descongelado st bacterianaocks para dar aproximadamente 10 6 células de cada espécie em 50 ml de LB 6.
  3. Esterilizar peças cateteres revestidos e não revestidos com luz UV durante 30 min e incubar com 1 mL de LB inoculados numa placa de 24 poços, a 37 ° C durante 3 dias, com agitação suave 6.
  4. Após a incubação, lavar os cateteres com PBS (2x, 2 ml), fixar as bactérias com 10% de paraformaldeído em PBS, durante 30 minutos, e lava-se com PBS (1 ml). Corar as bactérias em pedaços de cateter com DAPI (1 ug mL - 1) durante 20 min e lava-se com PBS (1 ml).
  5. Obter imagens confocal das peças cateter usando as seguintes configurações: 405nm diodo laser azul, faixa de detector 414-502 nm, pin hole - Airy1, imagem Size - 1.024 × 1.024 pixels, a largura voxel - 105,2 nm, z-pilhas espaçamento 0.5μ m , ampliação - 40X 1,25.
  6. Conclua a imagem confocal por empilhamento Z-50 imagens em todo o comprimento de 100 uM do cateter.
  7. Analisar as imagens usando suitabsoftware de análise le: achatar as imagens empilhados-Z no plano z, utilizando a função de alargar a profundidade de campo, para criar uma única imagem de uma parte do cateter.
    NOTA: esta imagem deve então ser analisados ​​para obter a área do cateter coberto por bactérias, após o fundo-de correcção utilizando a função 'achatar fundo'.

10. Análise do Anexo bacteriana nos cateteres por SEM

  1. Preparar 10% de solução de polímero (w / v) em acetona.
  2. Pressionar uma ponta de pipeta (em 200 ul micropipeta) num meio a porção da peça de corte do cateter para segurá-la e mergulhar a peça na solução de polímero durante cerca de 30 seg. Seca-se o pedaço revestido em condições de ambiente durante 30 min. Aplicar um segundo revestimento por imersão de novo na solução de polímero e secar durante a noite nas condições ambientes.
  3. Após tratamento com UV e incubação com bactérias lavar as peças (n = 3) com PBS (2x, 1 ml) e transferi-los para placas de 48 poços contendo 10% de formaldeído em PBS durante 30 min. Após a fixação, lavar as peças com PBS (1 ml), secar durante a noite à temperatura ambiente, montar em tocos com discos de carbono condutores e revestimento de ouro usando um revestidor por crepitação (veja o passo 7.5).
  4. Obter imagens usando um microscópio eletrônico de varredura 6.

Representative Results

A Figura 2 mostra fixação bacteriana (normalizada intensidade de fluorescência) para uma série de polímeros, tal como determinado por análise de microarray. Manchas impressas sem polímero (NMP apenas) são o controlo negativo, como agarose resiste fortemente ligação 6 bacteriana - fluorescência gravado é muito baixa. Os polímeros indicadas são todos baixo de ligação, embora na maioria dos casos, as propriedades repelentes de um polímero varia significativamente entre as espécies bacterianas testadas. Isto reflecte as grandes diferenças entre os mecanismos de fixação entre espécies diferentes. A selecção de um polímero apropriado é, por conseguinte, dependente da aplicação, mas os polímeros de ligação baixas são facilmente identificados por comparação com agarose. polímeros elevados de ligação são susceptíveis de ser identificados em uma matriz, e podem ser utilizados como controlos positivos para as experiências subsequentes. Para polímeros que não mostram auto-fluorescência no canal DAPI, co qualitativamparison das imagens de ponto podem ser feitas visualmente (como mostrado na Figura 3, evidenciando um polímero de ligação de alta-representativo e três exemplo polímeros de baixa ligação). Essa comparação, enquanto fornece menos informação do que a análise estatística, pode ser uma validação visual útil dos valores de intensidade calculados.

Com 22 polímeros apropriados identificados usando o microarray, os experimentos scale-up são realizados para confirmar sua propriedade bactérias repelente quando utilizado para o revestimento de superfícies maiores. São mostrados exemplos de melhor desempenho, usados para lamelas de revestimento de vidro (analisados por SEM (Figuras 4 e 5)) e fatias de cateter (analisados por microscopia confocal (Figura 6) e SEM (Figura 7)). Ambos os métodos microscópicos têm a vantagem de permitir a contagem de células diretos sobre a superfície, fornecendo dados não ambíguos; redução na fixação das células é facilmente visible. Esses revestimentos que melhor retidos suas propriedades repelentes de aumento de escala, bem como sendo passível de técnicas de revestimento em larga escala, foram ainda mais investigados. Os resultados apresentados ilustram os polímeros com melhor desempenho de cada etapa.

figura 1
Figura 1: SEM = microscopia electrónica de varrimento Passos envolvidos na identificação de bactérias repelentes polímeros através de microarranjos de polímeros para aplicações biomédicas..

Figura 2
Figura 2:. Bacteriana de ligação relativa a uma série de polímeros, determinada por análise de microarray Baixa bacteriana de ligação é visto de uma série de poliacrilatos / acrilamidas (PA) e poliuretanos (PU). Os resultados de microarranjos de polímero sondadas com vários s bacterianas pecies (C. jejuni, C. difficile, Clostridium perfringens, S. mutans, e dois consórcios; BacMix-1 e BacMix-2) são mostrados. A ligação bacteriana expressa como média corrigida para o fundo DAPI intensidade de fluorescência (normalizada). As barras de erro representam o desvio padrão. Adaptado da referência 6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Imagens Exemplo de pontos de polímero de fluorescência (DAPI) e microscopia de campo claro imagens de BacMix-2 que mostram fixação bacteriana de polímeros representativos. Um polímero fortemente de ligação está incluído para comparação a vários polímeros não vinculativos (UP-20, PA-336 e Pu-179). Barra de escala = 100 pm. Adaptado da referência 6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: experimentos scale-up com lamelas de vidro imagens SEM mostram fixação bacteriana no vidro não revestido e vidro revestido com polímeros 'hit' (exemplos escolhidos a partir da Tabela 1).. Barras de escala = 20 uM.

Figura 5
Figura 5:. A ligação bacteriana quantificada por contagem de células a partir das imagens de SEM Comparação de células fixadas por unidade de área de superfícies revestidas com os melhores polímeros "hit". A agarose foi utilizada como "não ligação" superfície de um controlo, com o vidro como uma superfície de ligação de controlo. As barras de erro representamdesvio padrão.

Figura 6
Figura 6: Comparação da ligação bacteriana em fatias de cateteres revestidos e não revestidos imagens confocais comparando o cateter não tratada (Cath-1) (A) e do cateter revestido com PA13 (B), após incubação com 2-BacMix.. Imagens tiradas com uma objectiva de 40x (Barra de escala = 20 mm). Adaptado da referência 6.

Figura 7
Figura 7:. Comparação da ligação bacteriana em fatias de cateteres revestidos e não revestidos imagens SEM mostram a comparação de cateter não tratada (Cath-1) (A) e do cateter revestido com PA13 (B), após incubação com um cocktail bacteriana que consiste em BacMix-2 Escala. barras = 101; m. Adaptado da referência 6.

Polímero monômero 1 monômero 2 monômero 3 Rácio de monómeros
PA465 MEMA DEAEMA ELE UM 8 1 1
PA475 MEMA DEAEA HEMA 6 1 3
PA513 MEMA DEAEMA MMA 8 1 1
PA515 MEMA DEAEA MMA 6 1 3
PA13 DMAA - 9 1 -
PU1 PEG2000 HDI - 4.9 5.2 -
PU16 PEG2000 MDI - 4.9 5.2 -
PU161 PEG2000 MDI BD 2.5 5.2 2.3
PU7 PEG900 BICH - 4.9 5.2 -
PU83 PEG900 HMDI BD 2.5 5.2 2.3
PU227 PPG-PEG-1900 HDI - 4.9 5.2 -
PU129 PPG425 BICH DMAPD 2.5 5.2 2.3
PU10 PTMG2000 BICH - 4.9 5.2 -
PU179 PTMG2000 HDI NMAPD 2.5 5.2 2.3
PU20 PTMG2000 MDI - 4.9 5.2 -
PU5 PTMG2000 HDI - 4.9 5.2 -

Tabela 1: Composição das bactérias não-ligação "hit" polímeros na Figura 2.

Discussion

Anexo de bactérias a uma superfície é um processo complexo determinado por uma vasta gama de factores dependentes das espécies de bactérias, as propriedades da superfície, o meio envolvente e para o ambiente físico. Embora certos grupos químicos são conhecidos para afectar a ligação de bactérias (poliglicóis, por exemplo, normalmente resistir a ligação 11), correlacionando o impacto biológica de polímeros com as suas estruturas químicas é difícil, tornando o desenho racional de polímeros para funções específicas desafiantes. Na ausência de mecanismos de fixação detalhados, outros estudos têm tentado imitar superfícies repelentes de ocorrência natural, com longa e otimização extensa processa 21. O método de alto rendimento miniaturizado aqui apresentado supera estes desafios, facilitando o rastreio paralelo de centenas de polímeros para identificar leads para um estudo mais aprofundado.

Os resultados do método de microarray servir principalmente para identify candidatos prováveis de chumbo. A Figura 2 ilustra com 22 candidatos baixo de ligação de pelo menos uma espécie, enquanto a Figura 3 demonstra a redução clara da capacidade de ligação. Todos os 22 polímeros de ligação baixos apresentados na na Figura 2 foram levados para a frente em experimentos em escala-up, durante o qual o melhor (em termos de repelência e revestimento propriedades) foram determinados como PU83, PA13 e PA515 (Figuras 4 e 5). Poliacrilatos oferecer uma maior flexibilidade em termos de métodos de polimerização e de modo que o poliacrilato de ligação menor, PA13, foi escolhido para os estudos de revestimento do cateter (figuras 6 e 7). A continuação dos trabalhos mais pormenorizadas sobre outros candidatos foi realizado e foi reportado em outros lugares 6.

Através de uma série de iterações experimentais encontramos uma série de passos menores foram chave para o sucesso e reprodutibilidade. Para além de facilitar a aderência dopolímeros para as lâminas de vidro, utilizando uma agarose de sub-revestimento proporciona um fundo limpo, como agarose é altamente resistente à colonização bacteriana. Da mesma forma consistência no polímero acaba-se, tanto no interior da mesma matriz e entre matrizes, é vital e, portanto, a impressão das matrizes deve ser cuidadosamente controlada. são necessários ajuste cuidadoso dos pinos na cabeça de impressão e preenchimento também uniforme da placa de 384 poços para garantir a mancha uniforme. Como alguns dos polímeros que usamos exibiu um grau de autofluorescência, tendo os dados de fundo de fluorescência para cada slide antes da incubação com bactérias era vital. Para considerar as variações e obter repetições de microarrays de dados robustos são aconselhados.

A mancha empregue aqui (DAPI) não tem selectividade para as espécies bacterianas, de ligação não específica de ADN. Portanto, uma boa técnica asséptica é essencial, uma vez culturas de bactérias são introduzidas como contaminantes podem passar despercebidas, confundindo o interpreção dos resultados. O mesmo é verdade para experiências posteriores por meio de microscopia eletrônica de varredura, onde só é possível distinguir as hastes e cocos mas não géneros ou espécies.

Depois de rastreio de microarray, polímeros promissores deve ser escolhido para posterior validação. No exemplo aqui apresentado, sete polímeros de interesse foram identificados pela sua clara redução na fluorescência sobre o micro-arranjo e a sua inibição da ligação foi confirmada por revestimento sobre as superfícies maiores. As Figuras 4 e 5 mostram a redução na ligação conseguida em lamelas de vidro, uma meios práticos para testar o comportamento dos polímeros como revestimentos a granel, em vez de como manchas de microarray. Subsequentemente, estes polímeros foram usados ​​para revestir os dispositivos médicos para quantificar completamente redução em anexo bacteriana. É importante que o solvente escolhido (ver secção protocolo 8) para estes estudos de revestimento é benigna para o substrato desejado (neste caso, o cateter), conservandoing capacidade de dissolver o polímero de interesse, de modo a permitir o revestimento. Aqui, utilizou-se a acetona, que, assim como as propriedades mencionadas, tem um baixo ponto de ebulição e evapora-se rapidamente para deixar um revestimento uniforme.

Os meios de validação escolhido dependerá da aplicação específica a ser estudada. Como observação de células por microscopia electrónica e fluorescência permite a quantificação direta de ligação de células individuais, escolhemos estas técnicas como um complemento para o ensaio de coloração microarray granel. Os resultados são mostrados nas Figuras 6 e 7, que demonstram a importância dos métodos de validação de cortesia. As imagens confocais na Figura 6 fornecem imagens muito nítidas de células individuais, enquanto o SEM tem a vantagem adicional de permitir uma avaliação da superfície do polímero, a qual é aqui lisa e uniforme. Estes métodos são limitados pelo campo de visão dos microscópios usados, e, portanto, é important a tomar uma série de instantâneos que ter confiança nos resultados. O método acima descrito não pode quantificar a aderência bacteriana ao longo de toda a superfície, apenas a cobertura inferir a partir de uma série de pequenas regiões. Acreditamos que esta é suficiente para a aplicação descrita. Redução na ligação bacteriana pode ser avaliado através da enumeração de bactérias aderidas de superfície em peças inteiras os cateteres revestidos e não revestidos, utilizando métodos como descrito noutro local 22. No entanto, tais métodos exigem as superfícies de biomateriais rastreados para ter uma área de superfície uniforme, o que é difícil de manter quando os ensaios são realizados com dispositivos médicos, que são muitas vezes de geometria complexa.

Claramente, qualquer dispositivo destinado para uso clínico deve passar por mais testes substancial para garantir a segurança e eficácia em humanos. O método aqui apresentado representa o início deste processo e mais trabalho deve incluir a confirmação da actividade in vivo. Neste caso, o estudo c venosaatheters, o trabalho inicial poderia investigar a ligação de componentes do sangue e células inteiras para o polímero. O efeito dos componentes do sangue, na ligação de bactérias, também deve ser considerado, possivelmente através da repetição dos ensaios de ligação na presença de soro inactivado ou sangue de-fibrinated 23. O teste definitivo da tecnologia será feita de um modelo in vivo, tais como um modelo de infecção implante subcutâneo 24.

Nós demonstrar o potencial do método de microarray de polímero para a seleção de polímeros de superfície de alteração. Tais polímeros (tanto resistindo e promovendo bacteriana de ligação) tem um grande número de aplicações na medicina, indústria de alimentos e biotecnologia, o que significa que este método pode ser útil em muitas áreas de pesquisa. Embora o trabalho aqui usa bactérias, o método poderia ser adaptado a outros tipos de células e da mesma forma outros químicos microarrays.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma 05066 
Silane-prep slides Sigma S4651
Polymers Synthesised in-house Not applicable
NMP Sigma 494496
LB Broth Oxoid CM1018
DAPI Thermo Fisher D1306
Tetrahydrofuran Sigma 401757
(3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides Sigma Silane-prep
Cacodylate buffer Sigma 97068
Catheter 1 Arrow International CS12123E
Catheter 2 Baxter Healthcare ECS1320
Osmium tetroxide Sigma 201030
Equipment
Contact printer Genetix Qarraymini
Microarray microscope IMSTAR Pathfinder
Spin Coater Speedline Technologies 6708D
Confocal microscope Leica SP5
Image analysis software Media Cybernetics Image-Pro Plus
Scanning electron microscope Philips XL30CP
Sputter coater Bal-Tec SCD050

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References

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High-throughput identificação de bactérias Polymers Repelente para dispositivos médicos
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Venkateswaran, S., Gwynne, P. J., Wu, M., Hardman, A., Lilienkampf, A., Pernagallo, S., Blakely, G., Swann, D. G., Bradley, M., Gallagher, M. P. High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices. J. Vis. Exp. (117), e54382, doi:10.3791/54382 (2016).More

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