Introduction
Polymer mikroarrayer är miniatyriserade hög genomströmning plattformar där upp till 7.000 polymerer 1 är tryckta på objektglas för parallell analys med prokaryota eller eukaryota celler 2. Den metod som presenteras här bygger på det som vi först beskrivs i 2010 3. Denna screeningsystem använts för många celltyper inklusive humana hepatocyter 4, stamceller 5, tubulära epitelceller 2, bakterier 3,6 och protozoiska patogener 7. I varje fall har polymerer som främjar eller motstå bindning av cellerna under studie identifierat åtta. Komplex av DNA med syntetiska polykatjoniska polymerer har också använts i microarray format för high-throughput screening av gen transfektion kandidater 9. Liksom screening för cellsubstratinteraktioner, har polymer mikroarrayer också använts för att utvärdera materialegenskaper 10.
"> Förmågan hos syntetiska polymerer för att modulera bindning av bakterier till en yta är väl etablerad 3,6,11. Talrika faktorer, inklusive laddning, hydrofobicitet och ytgrovhet på polymerytan är kända för att påverka bakteriella bindande. De konventionella metoder att upptäcka biomaterial som motstår bindningen av bakterier genom sekventiellt eller empiriskt utforma och testa ett material i taget är arbetsintensiv, kostsam och tidskrävande processer. Polymer mikroarrayer erbjuda ett attraktivt alternativ för att kringgå sådana begränsningar.Surface-associerade bakterier växa som en komplex population kallas en biofilm - sådana biofilmer är mycket motståndskraftig mot många miljöpåfrestningar och antibiotika. Detta beror delvis på grund av deras täta extracellulära matrix (bestående av proteiner, polysackarider och nukleinsyror) 12 och delvis på grund av den ökade förekomsten av robusta "persistor" celler i biofilmer 13. although de exakta mekanismerna för ytan förening och efterföljande biofilmsbildning är svåra att karakterisera, är det allmänt att det finns tre olika stadier av ytan tillväxt 14-16. Initial, reversibel bindning följs av starkare vidhäftning av celler, inrättandet av en biofilm genom produktion av ett extracellulärt protein och polysackarid matris och celltillväxt. Slutligen, de mogna biofilm släpper fritt levande planktonceller, som kan initiera nya infektioner på annat håll. Bakterier avvisande polymerer som förhindrar den ursprungliga fastsättning av bakterier, och därmed förhindra tidiga stadier av biofilm bildning, eventuellt utgör en utmärkt lösning för att minimera infektioner. Med tanke på ökningen av antibiotikaresistens (och även den egen större motstånd av yt- associerade bakterier 12), antibiotikafritt anordningar för att reducera infektioner är av särskilt intresse. I sjukhusmiljö, bakterier avvisande polymerbeläggningar kan ha en direkt medicinsk användning i en minskning av sjukhusinfektioner, som ofta bildar runt implantat 17.
Här är en hög genomströmning metod för screening av 381 polymerer för avvisande aktivitet mot en rad patogena bakterier i samband med sjukhusinfektioner, följt av validering hit och efterföljande beläggning och analys av central venkateter material, som beskrivs (figur 1). I korthet var polymer fläckar på agaros belagda objektglas av kontaktkopiering och efter torkning och sterilisering, var de miniatyriserade arrayer inkuberades med kliniskt viktiga bakteriekulturer. Efter inkubering microarrays tvättas försiktigt och vidhäftande bakteriella celler färgades och visualiserades genom fluorescens. Därefter har polymerer som inhiberade bakterie bindning undersöktes i större skala genom beläggning på täckglas och visualiseras genom elektronmikroskopi. valda stöter bortutlånade polymerer belades sedan på kommersiella katetrar och visat sig minska fastsättning av bakterier med nästan 100 gånger.
Protocol
1. Framställning av agarosbelagda Slides
OBS: Innan tillverka polymer microarrays är aminoalkylsilan belagda objektglas belagda med agaros IB för att minimera ospecifik bakgrundsbindning och tillåta utvärdering av polymerer som binder eller stöta bort bakterier 6. Silanbeläggningen underlättar bindningen av agarosen till objektglasen.
- Gör upp en 2% (vikt / volym) lösning av agaros IB i destillerat vatten i en 250 ml flaska.
- Efter begränsning flaskan löst, värm suspensionen i en mikrovågsugn i 30 sek perioder tills upplöst. Se till att locket inte är ordentligt stängd för att undvika eventuella tryckuppbyggnad. Ta bort flaskan regelbundet och snurra försiktigt.
- Säkerställa att den fasta substansen har löst sig och lösningen är klar. Häll agaroslösningen i en 100 ml bägare, och plats i en 65 ° C vattenbad för att upprätthålla en vätskelösning.
- Doppa silanbelagda glider in agaroslösningen, säkerställa en enhetlig beläggning, och wipe baksidan av objektglaset med en silkespapper.
- Torka glasen, med den belagda sidan upp, i en dammfri miljö (t.ex. inne i ett skåp eller dragskåp) under ett minimum av 24 tim.
- Bekräfta en jämn beläggning genom visuell inspektion. Beläggning kan lätt bedömas genom att andas på bilden - kondens bildas på obelagda regioner. Endast diabilder belagda helt och jämnt bör användas för microarray utskrift.
2. Framställning av polymerlösningar för utskrift
- Bereda lösningar (1% vikt / volym) av ett urval av förformade polymerer bestående av polyakrylater, polyakrylamider och polyuretaner i N-metylpyrrolidon (NMP) i glasampuller. (Förbereda 1 ml av varje polymer). Virvel tills polymeren löst sig fullständigt. Syntes av polymerer beskrivs på annat håll 6.
- Med användning av en mikro-pipett, fylla varje brunn i en 384 mikrobrunnsplatta med 25 | il polymerlösning, vilket säkerställer att det inte finns någon tvär contaminering och varje brunn innehåller en unik polymer. Använda NMP som en negativ kontroll i åtminstone 2 brunnar. Registrera identiteten på polymerlösning i varje brunn på en brunnar mall eller kalkylblad.
3. Skriva Polymer Microarrays Använda en kontakt skrivare
OBS: Tryckning av microarrays utfördes med hjälp av en kontakt skrivare. Specifika instruktioner om polymermicroarray utskrift anges nedan. För allmänna riktlinjer om hur du använder rekommendationer skrivare och säkerhet, följa instruktionsboken från tillverkaren. Även om vi använder en kontaktskrivare, kunde en lämplig manuell stansanordningen också användas.
- Enligt anvisningarna i skrivarens användarmanual, skapa en rutin (se steg 3,3) som möjliggör utskrift av 384 vätskor (polymerlösningar eller NMP) i kvadruplikat, med hjälp av en 32-polig microarraying huvud (arrangerad som 8 rader och 4 kolumner).
- Skriva ut 1,536 fläckar arrangerade som 48 rader och 32 kolumner. Programmera rutin att skriva ut i 12 avsnitts, dvs., 32 lösningar i taget, så att skrivaren kan stoppas efter tryckning varje avsnitt för att möjliggöra rengöring av stift.
- För att skapa en utskrift rutin:
- Öppna mjukvaran och från de tillgängliga alternativen välj "Skapa en ny rutin". Välj "Beskrivning" fliken för att mata in information om försöket. Välj fliken "Head" och välj '32 stifts microarraying huvudet ".
- Välj fliken "Source" och välj hållare (källa hållare (1x5)), plattvärmeväxlare (platta 384 x 6000), totalt plattor (1) och käll ordning (genom kolumner).
- På fliken "Slide Design", välj "3x1 '' slide" och välj grupperings med "Fältnummer". Välj sedan "ordnande mönster". Input "Spot view" som "layout" och "Mönster dimensioner" som "Row count" (6), 'Antalet kolumner "(8)," Row planen "(750) och" Kolumn stigning "(560). Välj ett avsnitt för att skriva ut granart.
- I "Slide layout fliken ange antalet objektglas som används för utskrift. Välj "Skriv ut" fliken för att mata in utskriftsparametrar (antal frimärken per infärgning: 1, antal frimärken per plats: 5, stämpling tid: 200 ms, stämpel tid: 100 ms).
OBS: En rutin nu skapas för utskrift 384 vätskor (polymerlösningar eller NMP) i kvadruplikat, med hjälp av en 32-polig microarraying huvud (arrangerad som 8 rader och 4 kolumner). Totalt rutinen ska skrivas ut 1.536 punkter arrangerade som 48 rader och 32 kolumner med en rad stigning av 750 um och kolumn tonhöjd 560 pm.
- Placera agarosen belagda glider på plattformen och säkerställa en god vakuumtätning för att hålla bilderna på plats.
- Justera skrivhuvud så att alla stiften är på samma höjd. Kontrollera detta genom att manuellt sänka huvudet på en glasskiva och bekräftar att stiften flytta upp samtidigt. Om det finns några avvikelser med höjden, justera med hjälp av sleeve på tappen uppåt eller nedåt.
- Placera brunnar på plåthållaren i rätt riktning, det vill säga., Väl A1 är att det övre högra hörnet av hållaren och se till att brunnar är fast ordentligt.
- Med höjdjusterare, att höjden av plåthållaren är sådan att när plocka polymerlösningar, inte stiften inte röra botten av brunnarna.
OBS: Detta är viktigt för enhetlig polymer observation och för att undvika att spilla av polymerlösningar i angränsande brunnar, varigenom korskontaminering. - Välj fliken "Start" och välj "Kör typ" som "Normal". Klicka på "Kör", och bekräftar att glida, brunnar, etc., är på plats när det efterfrågas.
- Skriv en sektion i taget (32 lösningar åt gången, 12 sektioner), vilket möjliggör rengöring av stiften mellan sektionerna. Rengör stiften noggrant med pappershandduk doppad i aceton, följt av torrt tissuepapper att säkerställa stiften är helt torr.
- Efter avslutad tryckning av de microarrays, placera dem i en hållare för objekt och torka dem över natt i en vakuumugn inställd vid 45 ° C för att avlägsna NMP i polymer fläckar. Efter sterilisering med UV-ljus under 30 min, de mikromatriser är redo för inokulering av bakterier.
- Innan ympa diabilder med bakterier, ta en mätning av bakgrundsfluorescens (som beskrivs i avsnitt 5). Använda denna mätning med i beräkningen av bakteriell bindning.
4. Inokulering av Polymer Microarrays med bakterier
OBS: Se till god aseptisk teknik. All hantering av kulturer bör utföras i en steril miljö: antingen med användning av en Bunsenbrännare eller i ett flöde huva. Kulturer bör odlas med syre tillgänglighet, odlingsmedium, och temperaturen justerades till kraven i varje art.
- Förbereda övernattskulturer genom ympning av 5 ml Luria-Bertani-buljong (LB: 10 g L -1 baktotrypton, 5 g L -1 NaCl och 10 g L <sup> -1 jästextrakt) med en koloni från en platta. Inkubera över natten vid 37 ° C, skakning vid 200 rpm.
- Förbereda fryslager av övernattskulturer genom tillsats av glycerol (10% koncentration totalt) och lagra lager vid -80 ° C.
- För att bestämma cellantalet från prover av de tinade bakteriella lager, utföra seriespädningar av varje lager och växa bakterierna natten på fasta medier. Noggrann bestämning av cellantal i lager säkerställer lämplig ympning av varje art 6.
- Ympning microarray. Enstaka kulturer arter odlas enligt ovan och appliceras direkt på mikromatriser. BacMix-1 är en bakterie blandning av Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus), och Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 är en bakterieblandning bestående av Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus K. pneumoniae och Enterococcus faecalis (E. faecalis).
- För att framställa antingen blandad kultur, blanda övernattningar i lika volymer (vardera 3 ml) och utspädd fyra gånger med färsk LB (till omkring 50 ml slutlig volym).
- Placera UV-steriliserad polymer mikroarrayer i rektangulära 4-brunnars plattor och inkubera dem med 6 ml av blandade bakteriekulturer vid 37 ° C med försiktig omröring (30 rpm) under 5 dagar.
- Efter inkubation försiktigt skölja de microarrays två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4) och inkubera med en lösning av 1 | j, g ml -1 av 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) fläck i PBS under 30 min.
- Tvätta färgade microarray glider i en färsk brunnar genom att täcka med PBS och virvlande försiktigt ändra PBS en gång. Torka under ett flöde av luft. Applicera en glaskupa slip till microarray bild och tätningen på plats med lim. När dry, sterilisera den yttre ytan med 70% (volym / volym) etanol.
- Kassera kulturer enligt deras skyddsnivå.
5. microarray Imaging och analys
- Fånga enstaka bilder för varje polymer plats i bright och DAPI (Ex / Em = 358 nm / 361 nm) kanaler. Utför detta manuellt med ett fluorescerande mikroskop eller med hjälp av en automatiserad fluorescensmikroskop (med en XYZ stadium styrs av en bild förvärv programvara) utrustad med en 20x objektiv.
OBS: Se till handboken 18 för att driva programvaran och justera mikroskop för att få bilder med hjälp av ljusfält och DAPI kanaler. Säkerställa att förstärkningen och exponeringstid för bildfångst för alla mikromatriser är desamma. - Få den genomsnittliga fluorescensintensiteten av varje fläck i DAPI-kanalen genom att välja fläckytan och kvantifiering av fluorescens med en bildbehandlingsprogramvaran.
- För bakgrunden fluorescens av varje fläck, obtai bilder av polymer fläckar på en kopia microarray inkuberas endast med media utan bakterier. Dra av bakgrundsfluorescens från intensiteten av fläcken för att erhålla fluorescens från bakterier.
- Beräkna genomsnittliga normaliserade värdet från de fyra platser, representerar varje polymer, som används för att jämföra bakterier bindning av olika polymerer 6.
- Identifiera polymerer som uppvisar minst bakteriell bindning (lägsta fluorescens) som träff polymerer 6.
6. Beläggning av täckglas för "Hit" Validering
- Att belägga Täckglas med Polymerer:
- Bereda lösningar av "träff" polymerer (~ 2% vikt / volym) i tetrahydrofuran (THF), eller annat lämpligt lösningsmedel.
- Spin coat cirkulära täckglas av lämplig storlek med polymerlösningarna med användning av en spinnbeläggningsanordning vid 2000 rpm under 10 sek.
OBS: I avsaknad av en spinnbeläggare, kan täck eller andra material vara doppbeläggas, även spinbeläggning ger en jämnare yta. - Torka de belagda täckglas i en konvektionsugn vid 40 ° C över natten och sterilisera med användning av UV-ljus under 30 min före vaccinering av bakterier.
- Att belägga Täck med agaros för negativa kontroller:
- Rena täckglas antingen genom plasmabehandling för 10 min eller nedsänkning i 1 M NaOH under 4 h.
- Doppa täckglasen i acetonitril innehållande 1% (3-aminopropyl) trietoxisilan över natten. Rengör täckglas med aceton 3 gånger och placerades i en ugn (100 ° C) under 1 timme.
- Dip belägga de torkade täckglas med 1% agaros vattenhaltig lösning som hålls i ett vattenbad vid 60 ° C. Placera agarosen belagda täckglas på plan yta i dammfria omgivningsförhållanden under 24 h och sterilisera med användning av UV-ljus under 30 min före vaccinering av bakterier.
7. Montering och analys av locket glida med svepelektronmikroskop (SEM)
- Eftersterilisering med UV-ljus under 30 min, placera täckglas (polymer / agaros belagd eller obelagd glas) i en standard 12-brunnar eller 24-brunnar (beroende på storleken av de täckglas) och inkubera med bakterier såsom beskrivits i avsnitt 4.
- Efter inkubering med bakterier, tvätta de obelagda och belagda täckglas två gånger med 0,1 M kakodylatbuffert (pH 7,4) och därefter fastställa med 2,5% (vikt / vol) glutaraldehyd i 0,1 M kakodylatbuffert (pH 7,4) under 2 h.
- Post-fix prover med 1% (vikt / volym) osmiumtetroxid under 1 h vid rumstemperatur och dehydrera med sekventiella etanoltvättningar vid 50, 70, 90 och 100% (volym / volym) under 30 min vardera.
- Torra prov i CO 2 enligt standardprotokoll 19. Torktiden beror på beskaffenheten av provet.
- Coat prover i en guld / palladium-legering (60/40%) med en sputter beläggaren med ström vid 30 mA och vakuum vid 0,75 Torr. Undersök under ett elektronmikroskop enligt standardprotokoll 20.
OBS: Ensure tillräckliga säkerhetsåtgärder för att hantera risker till följd av lagring, hantering och bortskaffande osmiumtetroxid, eftersom det är mycket giftigt. - Visuellt jämföra bilder av de obelagda täck och de belagda med agaros eller träff polymerer för att bekräfta bakteriella bindande / repellerande förmåga polymererna.
OBS: Motstånd för fastsättning skall vara väl synliga som en minskning av celler närvarande. - Välj de mest lovande "träff" icke-bindande polymerer för beläggning studier med medicintekniska produkter (t.ex. centrala venkatetrar) 6.
8. Val av ett lösningsmedel för Coating katetrar
- Utvärdera olika lösningsmedel för deras kompatibilitet med den inneboende del av katetern, samt deras förmåga att upplösa "träff" polymer. Skär delar av cath-1 och i cylindriska stycken 5 mm i längd, och mäta med en digital skjutmått.
- Värdera olika lösningsmedel, såsom ACETic acid, ammoniak, aceton, acetonitril, dietyleter, tetrahydrofuran (THF), dimetylformamid (DMF), N-metyl-2-pyrrolidon (NMP), etanol, metanol, etylenglykol, toluen och xylen. Doppa kateter bitar i lösningsmedlen i 12 timmar och utvärdera visuellt för integritet kateter och tydlighet av lösningsmedel.
OBS: Välj ett lösningsmedel som inte orsakar katetrarna att svälla eller upplösas eller resultera i en grumlig lösningsmedel. Lösningsmedlet måste upplösa träff polymerer.
9. Analys av bakteriell vidhäftning på katetrar av konfokalmikroskopi
- Förbered 2,5% (w / v) polymerlösningar i aceton eller annat lämpligt lösningsmedel som fastställs i avsnitt 8. Placera 5 mm kateter bitar i en liten glasflaskor (5 ml) och fördjupa dem i 1 ml av polymerlösningen under 2 minuter . Avlägsna överskottet av polymerlösningen och torka kateterstyckena över natten i en vakuumugn vid 40 ° C.
- Bered inokulatet genom att blanda tinade bakterier stocks att ge ca 10 6 celler av varje art i 50 ml LB 6.
- Sterilisera belagda och obelagda kateter bitar med UV-ljus under 30 min och inkubera med 1 ml inokulerade LB i en 24-brunnars platta, vid 37 ° C under 3 dagar, under försiktig omrörning 6.
- Efter inkubation, tvätta katetrarna med PBS (2x, 2 ml), fixera bakterierna med 10% paraformaldehyd i PBS under 30 min, och tvätta med PBS (1 ml). Färga bakterierna på kateter bitar med DAPI (1 | j, g ml - 1) under 20 minuter och tvätta med PBS (1 ml).
- Skaffa konfokala bilder av katetern bitar med hjälp av följande inställningar: 405nm blå diodlaser, detektor avstånds 414-502 nm, stift hål - Airy1, Bildstorlek - 1,024 x 1024 pixlar, voxel bredd - 105,2 nm, Z-stackar avstånds 0.5μ m , förstoring - 40X 1,25.
- Slutföra konfokal avbildning av Z-stapling 50 bilder över 100 um längd av katetern.
- Analysera bilder med hjälp av suitable analysprogram: platta Z-staplade bilder i Z-planet, med hjälp av funktionen för att förlänga skärpedjup, för att skapa en enda bild av en kateter bit.
NOTERA: Detta avbildar bör sedan analyseras för att erhålla det område av katetem som täcks av bakterier, efter bakgrund-korrigering med hjälp av den "platta till bakgrund" funktion.
10. Analys av bakteriell vidhäftning på katetrar av SEM
- Förbered 10% polymerlösning (vikt / volym) i aceton.
- Trycker på en pipettspets (för 200 pl mikropipett) i mittpartiet av den skurna bit av katetern för att hålla och doppa stycket i polymerlösningen under ca 30 sek. Torka den belagda biten i omgivningsbetingelser under 30 min. Applicera en andra beläggning genom nedsänkning igen in i polymerlösningen och torka över natten i omgivningsförhållandena.
- Efter UV-behandlingen och inkubering med bakterier tvätta bitarna (n = 3) med PBS (2x, 1 ml) och överföra dem till 48-brunnars plattor innehållande ett0% formaldehyd i PBS under 30 min. Efter fixering, tvätta bitarna med PBS (1 ml), torka över natten vid rumstemperatur, montera på stubbar med ledande kol-skivor, och guld päls med användning av en sputter beläggaren (se steg 7.5).
- Erhålla bilder med hjälp av ett svepelektronmikroskop 6.
Representative Results
Figur 2 visar bakteriell vidhäftning (normaliserad fluorescensintensitet) till ett antal polymerer som bestäms av microarray analys. Ställen tryckta utan polymer (NMP endast) är den negativa kontrollen, som agaros motstår starkt bakterie bindande 6 - inspelad fluorescens är mycket låg. Polymererna som visas är alla låga bindande men i de flesta fall, de repellerande egenskaperna hos en polymer varierar betydligt mellan bakteriearter som testades. Detta återspeglar de stora skillnaderna mellan fästmekanismer mellan olika arter. Valet av en lämplig polymer är därför beroende av tillämpningen, men den låga bindande polymerer är lätt identifieras genom jämförelse med agaros. Höga-bindande polymerer är sannolikt att identifieras i en matris, och kan användas som positiva kontroller för efterföljande experiment. För polymerer som inte visar auto-fluorescens i DAPI kanalen, kvalitativ comparison av fläckbilder kan göras visuellt (som visas i figur 3, belyser en företrädare på hög bindande polymer och tre exempel låg bindande polymerer). En sådan jämförelse, samtidigt som mindre information än den statistiska analysen, kan vara en användbar visuell validering av intensitetsvärdena beräknas.
Med 22 lämpliga polymerer identifieras med hjälp av microarray, är skala upp experiment utförs för att bekräfta deras bakterieavvisande egenskap när den används för beläggning av större ytor. Här visas de bästa resultaten exempel, som används för att belägga täckglas (analyseras av SEM (figurer 4 och 5)) och kateter skivor (analyseras av konfokalmikroskopi (figur 6) och SEM (Figur 7)). Båda mikroskopiska metoder har fördelen att tillåta direkt celltal på ytan, vilket ger entydiga data; reduktion i cellvidhäftning är lätt visible. De beläggningar som bäst behållit sina avvisande egenskaper på uppskalning, samt vara mottaglig för storskaliga beläggningsteknik, undersöktes vidare. De visade resultaten visar de mest effektiva polymerer från varje steg.
Figur 1:. Stegen i identifieringen av bakterier avstötande polymerer genom polymer microarrays för biomedicinska tillämpningar SEM = svepelektronmikroskopi.
Figur 2:. Bakteriell bindande för en serie av polymerer, bestämd genom microarray analys Låg bakteriell bindning ses på ett antal polyakrylater / akrylamider (PA) och polyuretaner (PU). Resultat från polymer microarrays sonde med flera bakterie s pecies (C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans, och två konsortier; BacMix-1 och BacMix-2) visas. Bakteriell bindning uttryckt som bakgrundskorrigerade medelvärdet DAPI fluorescensintensitet (normaliserad). Felstaplar representerar standardavvikelsen. Anpassad från referens 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Exempel bilder av polymer fläckar Fluorescence (DAPI) och bright mikroskopi bilder av BacMix-2 visar bakteriell vidhäftning på representativa polymerer. Starkt bindande polymeren ingår för jämförelse med flera icke-bindande polymerer (PU-20, PA-336 och PU-179). Skalstreck = 100 | j, m. Anpassad från referens 6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: skala upp experiment med täckglas SEM-bilder visar bakteriell vidhäftning på obestruket glas och belagd med träff polymerer (exempel valda från tabell 1).. Skalstrecken = 20 | im.
Figur 5:. Bakteriell bindning kvantifieras genom celltal från SEM-bilder Jämförelse av celler fästa per ytenhet av ytor belagda med de bästa träff polymerer. Agaros användes som en kontroll "icke-bindande" yta, med glas som en kontroll bindande yta. Felstaplar representerarstandardavvikelse.
Figur 6: Jämförelse av bakteriell bindning på belagda och obelagda kateter skivor konfokala bilder som jämför obehandlad kateter (cath-1) (A) och kateter belagd med PA13 (B) efter inkubering med BacMix-2.. Bilder som tagits med en 40X objektiv (Skala bar = 20 pm). Anpassad från referens 6.
Figur 7:. Jämförelse av bakteriell bindning på bestruket och obestruket kateter skivor SEM-bilder visar jämförelse av obehandlad kateter (cath-1) (A) och kateter belagd med PA13 (B) efter inkubation med ett bakteriellt cocktail bestående av BacMix-2 Skala. barer = 101, m. Anpassad från referens 6.
| Polymer | monomer 1 | monomer 2 | monomer 3 | Förhållande av monomerer | ||
| PA465 | MEMA | DEAEMA | HEA | 8 | 1 | 1 |
| PA475 | MEMA | DEAEA | HEMA | 6 | 1 | 3 |
| PA513 | MEMA | DEAEMA | MMA | 8 | 1 | 1 |
| PA515 | MEMA | DEAEA | MMA | 6 | 1 | 3 |
| PA13 | DMAA | - | 9 | 1 | - | |
| PU1 | PEG2000 | HDI | - | 4,9 | 5,2 | - |
| PU16 | PEG2000 | MDI | - | 4,9 | 5,2 | - |
| PU161 | PEG2000 | MDI | BD | 2,5 | 5,2 | 2,3 |
| PU7 | PEG900 | Bich | - | 4,9 | 5,2 | - |
| PU83 | PEG900 | HMDI | BD | 2,5 | 5,2 | 2,3 |
| PU227 | PPG-PEG-1900 | HDI | - | 4,9 | 5,2 | - |
| PU129 | PPG425 | Bich | DMAPD | 2,5 | 5,2 | 2,3 |
| PU10 | PTMG2000 | Bich | - | 4,9 | 5,2 | - |
| PU179 | PTMG2000 | HDI | NMAPD | 2,5 | 5,2 | 2,3 |
| PU20 | PTMG2000 | MDI | - | 4,9 | 5,2 | - |
| PU5 | PTMG2000 | HDI | - | 4,9 | 5,2 | - |
Tabell 1: Sammansättning av bakterierna icke-bindande "träff" polymerer i figur 2.
Discussion
Fastsättning av bakterier till en yta är en komplicerad process bestäms av en rad olika faktorer, beroende av de bakteriearter, egenskaperna hos ytan, det omgivande mediet och den fysiska miljön. Även om vissa kemiska grupper är kända för att påverka bakteriella bindande (polyglykoler, till exempel, typiskt motstå fäst 11), korrelera de biologiska effekterna av polymerer med sina kemiska strukturer är svårt, rationell utformning av polymerer för specifika funktioner utmanande. I avsaknad av detaljerade fästmekanismer, har andra studier försökt att efterlikna naturligt förekommande avvisande ytor, med långa och omfattande optimering processer 21. Den miniatyriserade hög genomströmning metod som presenteras här övervinner dessa utmaningar genom att underlätta parallell screening av hundratals polymerer för att identifiera potentiella kunder för vidare studier.
Resultat från microarray metod huvudsakligen tjänar till IDEntify sannolikt leda kandidater. Figur 2 visar 22 kandidater med låg bindning av åtminstone en art, medan figur 3 visar den tydliga minskningen av bindningskapacitet. Alla 22 låg bindande polymerer som visas i i figur 2 togs fram i skala upp experiment, under vilken den bästa (i form av bortstötning och beläggningsegenskaper) bestämdes att vara PU83, PA13, och PA515 (figurerna 4 och 5). Polyakrylater ger större flexibilitet när det gäller polymerisationsmetoder och så lägsta bindande polyakrylat, PA13, valdes för kateterbeläggningsstudier (figur 6 och 7). Mer detaljerad arbeta vidare med andra kandidater genomfördes och har rapporterats på annat håll 6.
Genom ett antal experimentella iterationer fann vi ett antal mindre steg var nyckeln till framgång och reproducerbarhet. Samt att underlätta vidhäftningen avpolymerer till de glasskivor, med användning av en agaros under-beläggningen ger en ren bakgrund, såsom agaros är mycket resistent mot bakteriell kolonisering. Likaså konsekvens i polymeren fläckarna själva, både inom samma matris och mellan matriser, är viktig och därför tryckningen av matriser måste kontrolleras noggrant. Noggrann justering av stiften i skrivhuvud och också jämn fyllning av 384-brunnar krävs för att säkerställa en enhetlig spotting. Som en del av polymererna vi använde uppvisade en grad av autofluorescens, med bakgrund fluorescensdata för varje bild innan inkubation med bakterier var avgörande. Att ta hänsyn till variationer och för att erhålla robusta uppgifts replikat av mikroarrayer rekommenderas.
Fläcken användes här (DAPI) har ingen selektivitet för bakteriearter, bindande ospecifikt till DNA. Därför är viktigt god aseptisk teknik när bakteriekulturer införs som föroreningar kan gå obemärkt förbi, förvirrande tolkförandet av resultaten. Detsamma gäller för senare experiment med hjälp av svepelektronmikroskop, där det endast är möjligt att skilja stavar och kocker men inte släkten eller arter.
Efter microarray screening bör lovande polymerer väljas för ytterligare validering. I exemplet som presenteras här, har sju polymerer av intresse identifieras genom deras tydlig minskning i fluorescens på mikromatrisen och deras inhibering av fäst bekräftades genom beläggning av dem på större ytor. Figurerna 4 och 5 visar reduktionen i bindningen uppnås på täckglas av glas, en praktiskt sätt att testa beteendet hos de polymerer som bulkbeläggningar snarare än som microarray fläckar. Därefter har dessa polymerer belades på medicintekniska produkter till fullo kvantifiera minskning av bakteriell vidhäftning. Det är viktigt att lösningsmedlet valts (se protokoll avsnitt 8) för dessa beläggningsstudier är godartad till det önskade substratet (här, katetern) medan kvarhållaing förmåga att lösa polymeren av intresse, för att tillåta beläggning. Här har vi använt aceton som, liksom de egenskaper som nämnts, har en låg kokpunkt och förångas snabbt för att lämna en enhetlig beläggning.
Medlen för validering väljs kommer att bero på den specifika tillämpningen som studeras. Som observation av celler genom elektronmikroskopi och fluorescensmikroskopi möjliggör direkt kvantifiering av enskilda cellbindning, valde vi dessa tekniker som ett komplement till bulk färgning microarray analys. Resultaten visas i figurerna 6 och 7, som visar betydelsen av kostnadsvalideringsmetoder. De konfokala bilder i figur 6 ger mycket tydliga bilder av enskilda celler, under det att SEM har den ytterligare fördelen av att tillåta en utvärdering av ytan av polymeren, som är här jämn och enhetlig. Dessa metoder är begränsade av synfältet av mikroskop som används, och därför är det important att vidta en rad bilder för att ha förtroende för resultaten. Den ovan beskrivna metoden kan inte kvantifiera bakteriell vidhäftning över hela ytan, endast sluta sig till täckning från ett antal små regioner. Vi tror att detta är tillräckligt för att ansökan beskrivs. Minskning av bakterie bindning kan bedömas genom att räkna ytan vidhäftade bakterier på hela bestruket och obestruket kateter bitar med hjälp av metoder som beskrivs på annan plats 22. Men sådana metoder kräver biomaterialet ytor screenas för att ha en enhetlig yta, vilket är svårt att upprätthålla när analyser utförs med medicintekniska produkter, som ofta har komplex geometri.
Uppenbarligen måste varje produkt avsedd för klinisk användning gå igenom betydande ytterligare tester för att säkerställa säkerhet och effekt hos människa. Den metod som presenteras här representerar början av denna process och det fortsatta arbetet måste innehålla en bekräftelse på aktivitet in vivo. I det här fallet, studera venös catheters, inledande arbetet kunde undersöka bindningen av blodkomponenter och hela celler till polymeren. Effekten av blodkomponenter på bakteriell bindning bör också övervägas, möjligen genom att upprepa bindningsanalyser i närvaro av inaktiverat serum eller de-fibrinated blod 23. Det definitiva testet av tekniken kommer att vara i en in vivo-modell, såsom ett subkutant implantat infektionsmodell 24.
Vi visa potentialen för polymeren microarray metod för screening av ytan förändrande polymerer. Sådana polymerer (både motstår och främja bakteriell bindning) har ett stort antal tillämpningar inom medicin, livsmedelsindustrin och bioteknik, vilket innebär den här metoden kan vara användbar i många forskningsområden. Även om arbetet använder här bakterier, kan metoden anpassas till andra celltyper och likaså andra kemiska microarrays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | 05066 | |
| Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
| Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
| NMP | Sigma | 494496 | |
| LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
| Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
| Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
| Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
| Equipment | |||
| Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
| Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
| Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
| Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
| Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |
References
- Hansen, A., Mjoseng, H. K., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv. Healthc. Mat. 3 (6), 848-853 (2014).
- Tourniaire, G., Collins, J., et al. Polymer microarrays for cellular adhesion. Chem. Commun. (20), 2118-2120 (2006).
- Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers. J. Mat. Chem. 21 (1), 96-101 (2010).
- Hay, D. C., Pernagallo, S., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functionala hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Res. 6 (2), 92-102 (2011).
- Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
- Venkateswaran, S., Wu, M., et al. Bacteria repelling poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide) coatings for biomedical devices. J. Mat. Chem. B. 2 (39), 6723-6729 (2014).
- Pickering, H., Wu, M., Bradley, M., Bridle, H. Analysis of Giardia lamblia Interactions with Polymer Surfaces Using a Microarray Approach. Environ.l Sci. Technol. 46 (4), 2179-2186 (2012).
- Mizomoto, H. The Synthesis and Screening of Polymer Libraries using a High Throughput Approach. , (2004).
- How, S. E., Yingyongnarongkul, B., Fara, M. A., Díaz-Mochón, J. J., Mittoo, S., Bradley, M. Polyplexes and lipoplexes for mammalian gene delivery: from traditional to microarray screening. Comb. Chem. High Throughput Screen. 7 (5), 423-430 (2004).
- Thaburet, J. -F., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromol. Rapid Commun. 25 (1), 366-370 (2004).
- Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nat. Biotechnol. 30 (9), 868-875 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Evolving concepts in biofilm infections. Cell. Microbiol. 11 (7), 1034-1043 (2009).
- Lewis, K. Persister Cells. Ann. Rev. Microbiol. 64 (1), 357-372 (2010).
- Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G. Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during Development as a Biofilm. J. Bacteriol. 184 (4), 1140-1154 (2002).
- Reisner, A., Haagensen, J. A. J., Schembri, M. A., Zechner, E. L., Molin, S. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms. Mol. Microbiol. 48 (4), 933-946 (2003).
- Watnick, P. I., Kolter, R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm. Mol. Microbiol. 34 (3), 586-595 (1999).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8533-8554 (2013).
- Imstar. Pathfinder Technology for High Content Cellular Screening in Cell Biology and Genetoxicity Software version: 6.04I. , (2012).
- Williams, J. R., Clifford, A. A. Supercritical Fluid Methods and Protocols. 13, Humana Press. New Jersey. (2000).
- Kuo, J. Electron microscopy methods and protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Leslie, D. C., Waterhouse, A., et al. A bioinspired omniphobic surface coating on medical devices prevents thrombosis and biofouling. Nat. Biotechnol. 32 (11), 1134-1140 (2014).
- Bechert, T., Steinrücke, P., Guggenbichler, J. P. A new method for screening anti-infective biomaterials. Nat. Med. 6 (9), 1053-1056 (2000).
- May, R. M., Magin, C. M., et al. An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters. Clin. Transl. Med. 4, (2015).
- Chen, R., Willcox, M. D. P., Ho, K. K. K., Smyth, D., Kumar, N. Antimicrobial peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent subcutaneous infection models. Biomaterials. 85, 142-151 (2016).
