Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Forbedret polymerasekædereaktion-restriktionsfragmentlængde-polymorfisme Genotypebestemmelse af toksiske Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54402
Automatic Translation
1
1National Research Institute of Police Science

Summary

En forbedret polymerasekædereaktion-restriktionsfragmentlængde-polymorfisme metode til genotypebestemmelse pufferfish arter ved væskekromatografi / massespektrometri beskrives. En omvendt fase silica monolit kolonne anvendes til separation fordøjede ampliconer. Denne metode kan belyse de monoisotopisk masser af oligonukleotider, som er nyttige til identifikation af basesammensætning.

Abstract

En forbedret version af en polymerasekædereaktion (PCR) -Indskrænkning polymorfisme (RFLP) metode til genotypebestemmelse toksiske pufferfish arter ved væskekromatografi / elektrospray ionisering massespektrometri (LC / ESI-MS) er beskrevet. DNA-ekstraktion udføres under anvendelse af en silica-membran-baserede DNA-ekstraktion kit. Efter PCR-amplifikation under anvendelse af et detergent-fri PCR-buffer, der restriktionsenzymer tilsættes til opløsningen uden oprensning af reaktionsopløsningen. En omvendt fase silica monolit-søjle og en Fouriertransformation høj opløsning massespektrometer med en modificeret Kingdon fælde analysator anvendes til separation og detektion hhv. Den mobile fase, bestående af 400 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol, 15 mM triethylamin (pH 7,9) og methanol, afgives ved en strømningshastighed på 0,4 ml / min. Cyklustiden for LC / ESI-MS-analyse er 8 min herunder ækvilibrering af søjlen. Udfoldning software med en isotop distributionsmodel of oligonukleotidet anvendes til at beregne en tilsvarende monoisotopisk masse fra massespektret. Til analyse af oligonukleotider (interval 26-79 nukleotider), masse nøjagtighed var 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) og fremragende nøjagtighed og præcision blev opretholdt i 180 timer uden brug af en lås masse standard.

Introduction

Massespektrometri (MS) er en accepteret teknologi til hurtig og pålidelig identifikation af nukleinsyrer, matrix-assisteret laser desorption / ionisering (MALDI) og elektrospray ionisering (ESI) anvendes til ionisering 1,2. MALDI teknik er typisk kombineret med et time-of-flight (TOF) analysator; imidlertid er anvendelsen af MALDI-TOF MS begrænset til korte oligonukleotider (~ 25 nukleotider (nt)) på grund af efterfølgende opsplitning, adduktdannelse og lav ionisering effektivitet 1,2. I modsætning hertil ESI er anvendelig til længere oligonukleotider (> 100 nt), men mange opladningstilstand af multiple ladede ioner ([M-nH] n-) fremstilles samtidigt fra biomakromolekyler og dermed massen af analysanden kan overstige den øvre grænse for m / z spektrometrets. Dette kræver en fortolkning af den komplicerede spektre, dvs. omdannelse af en afgift tilstand serie i den tilsvarende massevia udfoldning.

I tilfælde af massen måling af et lille molekyle, toppen af monoisotopisk masse, dvs. massen af molekylet, som kun indeholder de mest almindelige isotop af hvert element er den mest rigelige og observerede naturligt 3. Da de molekylære vægt stiger, bliver de isotopiske distributions- skifter til højere m / z og monoisotopisk peak skjult af baseline støj 3-5. Når monoisotopisk top er ikke længere påviselig for masserne på mere end 10 kDa 3, er den gennemsnitlige molekylmasse anvendes til måling i stedet for den monoisotopiske masse 5. I sådanne tilfælde kan kun observeres den isotopiske distribution i hvilken hver af de enkelte toppe adskilt af 1 Da når en høj opløsning masseanalysator, såsom en TOF, en Fourier transformation, modificeret Kingdon fælde analysatoren 6, eller en Fourier-transformation-cyklotron-resonans analysator anvendes til analyse. Men den mest udbredte top er sometimes ikke i overensstemmelse med den gennemsnitlige molekylmasse 5. Disse problemer kan føre til problemer for nøjagtig bestemmelse analytter.

I betragtning af den variation i den naturlige overflod af stabile isotoper og vanskelighederne i de bestemmende den gennemsnitlige molekylmasse, måling af monoisotopisk masse er ideel til masse karakterisering af biomolekyler 3,4. I praksis om en monoisotopiske top kan observeres eller ej, monoisotopisk masse kan estimeres ved sammenligning af mønsteret af den observerede isotopiske distribution til den teoretisk beregnet ud fra en model analyt 4,7-10. Beslaget algoritme 8 er nu indarbejdet i proprietær software.

I forbindelse med ESI-MS, der dissociation af et DNA-duplex, oprensning og afsaltning kræves til direkte måling for at undgå svigt af ionisering grund ion suppression og adduktdannelse 2,10-14. Disse procedurer er troublesome imidlertid fuldautomatiske analytiske systemer er blevet udviklet kommercielt involverer polymerasekædereaktion (PCR), prøveforberedelse og ESI-MS til påvisning af patogener 15-20. En anden fremgangsmåde er at indføre væskekromatografi (LC) til adskillelse. LC giver en on-line adskillelse af analytter fra sameksisterende stoffer og kræver ikke en møjsommelig prøvefremstilling forud for ionisering 21,22. Imidlertid adskillelse af nucleinsyrer ved anvendelse af en MS-kompatibel mobile fase er sværere end for de fleste andre forbindelser såsom lægemidler, peptider og proteiner på grund af den polyanioniske karakter af nukleotiderne. De mest succesfulde eksempler på LC / ESI-MS involverer anvendelse af ion-pair omvendt fase LC. En mobil fase af 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -methanol blev oprindeligt foreslået af Apffel et al. Til separering og detektering korte oligonukleotider 23. Anvendelse af LC / ESI-MS genotypebestemmelse for differentiation af patogene arter, single-nukleotid polymorfier og korte tandemgentagelser er blevet rapporteret ved hjælp af en kapillær polymer-monolit kolonne, der kan adskille længere oligonukleotider 1,21,24-33.

I Japan og USA, har alvorlig madforgiftning opstået på grund af fejlagtig identifikation og uhensigtsmæssig forberedelse af kuglefisk, og det er på trods af, at fordelingen og forberedelse af pufferfish strengt kontrolleret af fødevaresikkerhed 34,35. I øvrigt har en forsætlig drab hjælp pufferfish ekstrakt forekomme i Japan 36. Derfor er differentiering af pufferfish arter kræves af både folkesundheden og retsmedicinske efterforskningsmæssige standpunkter. Desuden, fordi japansk kuglefisk rubripes er langt dyrere end andre former for pufferfish, er der også behov en differentiering kapacitet i forbindelse med undersøgelser af svig mad.

Her en detaljeret metode til bestemmelse af monoisotopic massen af ​​et PCR-produkt ved LC / ESI-MS ved anvendelse af en omvendt fase silica monolit-søjle og en høj opløsning massespektrometer er beskrevet. Specifikt har den fremgangsmåde blevet udviklet til at tillade differentiering af toksiske pufferfish arter baseret på anvendelsen af PCR restriktionsfragmentlængde-polymorfisme den (RFLP) -metoden 37, som er det første eksempel på arter differentiering af dyr under anvendelse af MS.

Protocol

1. DNA ekstraktion

Bemærk: Brug et separat rum til DNA-ekstraktion og post-PCR undersøgelser såsom gelelektroforese og LC / ESI-MS. Tilføj ethanol til at vaske buffer 1 (indeholdende guanidinhydrochlorid) og vaskepuffer 2 (ikke indeholdende guanidinhydrochlorid) ifølge den DNA-ekstraktion kit protokol. Fish prøver blev opnået af fiskerogn grossister og detailmarkeder i Japan.

  1. Placer 30-50 mg fiskevæv i en 0,5 ml eller 1,5 ml mikrocentrifugerør. Squash vævet under anvendelse af en mikro-spatel (undtagen for fin og hud).
    Bemærk: I tilfælde af fin, bruge et 0,5 ml rør til iblødsætning.
  2. Tilføj 180 pi af lyseringsbuffer og 40 pi proteinase K og vortex kortvarigt. Inkuber ved 56 ° C på en blok varmelegeme i 2 timer eller natten over. Bland ved kortvarigt hvirvelbehandling hver 15 min under inkubationen.
    Bemærk: fuldstændig lyse er ikke nødvendig.
  3. Centrifuger i 5 minutter ved 13.000 x g. Efter centrifugering hvis en lille amoUNT olie eksisterer på overfladen i tilfælde af en fed prøve, såsom lever, kassere det. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  4. Tilsæt 200 pi af det chaotrope puffer indeholdende guanidinhydrochlorid og vortexes. Tilsæt 200 pi ethanol (99,5%) og vortexes igen.
  5. Overfør blandingen i spin-søjle anbragt i et 2 ml opsamlingsrør. Centrifuge i 1 minut ved 13.000 x g. Kassér gennemløbet.
    Forsigtig: Må ikke tilføje blegemiddel til affald, fordi guanidin kan danne meget reaktive forbindelser med blegemiddel.
  6. Der tilsættes 500 pi af vaskepuffer 1 (indeholdende guanidinhydrochlorid) og centrifugeres i 1 minut ved 13.000 x g. Kassér flowet gennem og opsamlingsrøret.
  7. Placer spinkolonne i et nyt 2 ml opsamlingsrør tilvejebragt med kittet. Der tilsættes 500 pi af vaskepufferen 2 og centrifugeres i 3 minutter ved 20.000 x g. Kassér gennemløbet og opsamlingsrøret. Overfør spin kolonne til en ny1,5 ml mikrocentrifugeglas.
  8. Pipetter 200 pi af elueringspufferen til midten af ​​spin kolonne membran. Efter 1 min, centrifugeres i 1 min ved 6000 x g.
  9. Pipetter 50 pi af eluatet til en engangs UV cuvette og måle UV-spektret af eluatet ved 220-300 nm, og absorbansen ved 260 nm ved anvendelse af et spektrofotometer.
  10. Kontrollere UV-spektret af DNA med toppen ved 260 nm. Beregn den omtrentlige DNA-koncentration ved hjælp af simpel ligning "DNA-koncentration (ng / pl) = absorbans ved 260 nm x 50".
    Bemærk: Typisk DNA-koncentration ekstraheret fra finner af pufferfish er 63 ± 30 ng / pl (n = 20).
  11. Hvis DNA-koncentrationen er højere end 10 ng / pl, fortyndes DNA-prøverne med Tris-EDTA (TE) puffer (pH 8) til 5 ng / pl.
  12. Opbevar prøven ved -20 ° C eller fortsæt til PCR-amplifikation (afsnit 2).

2. PCR

  1. Opsæt 25 pi PCR for hver Udvindinghandlede DNA-prøve, positiv kontrol (0,2 uM syntetiserede oligonukleotid med målsekvensen i TE-buffer pH 8,0) og negativ kontrol (ultrapurified vand i stedet for DNA-prøve) på is som pr tabel 1 og 2 på en ren bænk til at undgå forurening.
    Bemærk: For let betjening, lave tilstrækkelig mængde cocktail indeholder alle reagenser uden template-DNA og dispensere det. Bruge DNA polymerase, som har korrekturlæsningsaktivitet at undgå tilsætning af 3 »A udhæng til PCR-produktet.
  2. Udføre PCR-amplifikation på en thermal cycler under anvendelse af cyklusprogram vist i tabel 3.

3. Enzymatisk fordøjelse

  1. Tilsæt 2 pi af opløsningen indeholdende 100 mM Tris-HCI (pH 7,5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol og 500 mM NaCl til PCR-opløsning.
  2. Tilsæt 1 pi af hvert restriktionsenzym (Dra I og Msp I) og blandes forsigtigt. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C på thErmal cycler.
  3. Der inkuberes i 5 minutter ved 72 ° C for at aktivere den resterende DNA-polymerase, som fylder klæbrige ende genereret af Msp I.
  4. Valgfrit: Analyser hver 2,5 pi af reaktionsopløsningen ved polyacrylamidgelelektroforese under anvendelse af et indlæg link ratio (% C, procentdel af bisacrylamid) af 3,33 (vægt%) og en polyacrylamidgel fusion (% T) af 15 (% vægt / volumen) 38. Farv gelen under anvendelse af fluorescerende DNA-farve og iagttage dobbeltstrenget DNA på en blåt lys transilluminator ved hjælp af en ravgul skærm.
  5. Filtreres reaktionsopløsningen med en 0,2-0,5 um centrifugal filter anordning til at forhindre tilstopning, hvilket ville beskadige den analytiske kolonne.
  6. Overfør filtratet til en tilspidset polypropylenhætteglas og opbevares ved -20 ° C indtil analyse.

4. LC / ESI-MS Analyse

  1. Afvejes 67,2 g (ca. 42 ml) af HFIP og 1,52 g (ca. 2,0 ml) af TEA i en 1 L flaske. Tilsættes 955 ml ultrapurified vand (LC / MS grade) og omrør med en magnetomrører, indtil reagenserne er fuldstændigt opløst. Udtag en aliquot af opløsningen, og pH kontrolleres (mellem 7,85 og 7,95; ideelt pH = 7,9) ved anvendelse af et pH-meter.
    Bemærk: Du må ikke vende tilbage portionen til flasken for at undgå forurening med metalioner. Hvis pH er ikke 7,9, tilsættes en lille mængde af enten HFIP eller TEA at justere pH og pH måles igen.
  2. Tilslut flasken til linje A i væskekromatografen med afkøling af flasken ved hjælp af en direkte køling bærbar køleskab (til husholdningsbrug) for at forhindre fordampning. Tilslut en anden flaske fyldt med methanol til linje B.
  3. Forbind guard søjle og den analytiske søjle (2,0 x 50 mm, mesopore size = 30 nm) til væskekromatografen. Begynde at flyde den indledende mobile fase (95% A og 5% B) til ækvilibrering af kolonnerne.
  4. Forbered 0,5 mg / ml natrium-trifluoracetat (pH 3,5) som en kalibrant 39.
    1. Afvej 50 mg (ca. 34 ul) af trifluoreddikesyre acid i et bægerglas.
    2. 30 ml af ultrapurified vand og titreres til pH 3,5 med 10 mM natriumhydroxid ved hjælp af et pH-meter.
    3. Fyld op til 50 ml med ultrapurified vand. Der tilsættes 50 ml acetonitril (LC / MS grad) og blandes.
    4. Tag en portion af arbejdsopløsningen og opbevare det ved stuetemperatur. Opbevar resten af ​​opløsningen ved 4 ° C.
  5. Reducer nitrogentryk af C-fælde som følger.
    Bemærk: Nyt Fouriertransformation massespektrometre, som er egnede til intakt protein analyse, har kontrol software til styring af tryk.
    1. Fjern det venstre topdæksel af massespektrometer. C-trap ventilen er på hjørnet af den venstre forgrunden.
    2. Check højt vakuum værdi i instrumentet status vinduet i kontrol software.
      Bemærk: Værdien er typisk, 3 x 10 -8 bar.
    3. Træk knappen for at låse op og dreje knappen mod uret meget langsomt for at mindske den høje vakuum pressenure til 1/3 (typisk 1 x 10 -8 bar). Den angivne tryk bør ændre gradvist på en forsinket måde. Ignorer advarslen om lavt tryk. Skub knappen for at låse.
    4. Gendan topdækslet for sikkerhed.
  6. Kalibrere massespektrometer under anvendelse natriumtrifluoracetat 39.
    Bemærk: Daglig massekalibrering kan erstattes af denne protokol, men den anbefalede kalibrering foreslået af producenten skulle have været afsluttet før denne kalibrering.
    1. Indstil scan parametre og opvarmede ESI kilde parametre i instrumentet kontrolboks med tuning software som følger: scanningstype fuld MS; scan rækkevidde m / z 500-4,000; fragmentering (i-kilde kollision induceret dissociation (CID) spænding 60 eV, polaritet negativ, automatisk styrkekontrol (AGC) målrette 1 x 10 6, maksimal injicere tid 50 ms; kappe gasstrømmen 5, aux gasstrømmen 0; sweep gas strømningshastighed 0; spray spænding 3 kV; kapillær temperatur 320 ° C; S-linse radiofrekvens (RF) niveau 100; varmelegeme temperatur 30 ° C.
      1. Input listen af negative ioner, der skal overvåges som m / z 792,85908, 1064,80870, 1336,75832, 1608,70794, 1880,65755, 2152,60717, 2424,55679, 2696,50640, 2968,45602, 3376,38045.
    2. Flyt opvarmede ESI sonden tættest på grænsefladen af ​​massespektrometer (position B). Forbind proben og en sprøjte med et rør.
    3. Tilføre kalibrant konstant ved en strømningshastighed på 10 pl / min under anvendelse af den integrerede sprøjtepumpe. Tjek kun de 6 nederste masse ioner (m / z 792,85908-2152,60717) i den tilpassede kalibreringstabellen.
      1. Fortsæt med kalibrering efter intensiteten af ​​signalerne stabiliseres. Efter kalibrering, check kun de seks højere masse ioner (m / z 1880,65755 til 3376,38045) og fortsætte med kalibrering. Undgå kalibrering ved hjælp af alle ioner på én gang for at undgå fiasko.
  7. Flyt proben til Appropriate position til en strømningshastighed på 0,4 ml / min (position D) og forbindelse til væskekromatograf med en inert metalrør.
  8. Indstil de opvarmede ESI kilde parametre i instrumentet kontrolboks med tuning software som følger: kappe gasstrømmen 50; aux gasstrømningshastighed 15; feje gasstrømningshastighed 1; spray spænding 2,5 kV; kapillær temperatur 350 ° C; S-linse RF plan 100; varmer temperatur 350 ° C.
  9. Indstil parametre erhvervelse af massespektrometer i vinduet instrumentale opsætning som følger: metode varighed 8 min; aflede ventil, 3,5-6 min til massespektrometer, 0-3,5 og 6-8 min til spilde; runtime 3.5 til 6 min; polaritet negativt; i kilden CID spænding 15,0 eV; microscans 3; nominel opløsning effekt (ved m / z 200) 140.000; AGC target 1 x 10 6; maksimal ion tid 50 ms; antal scanninger 1; scan rækkevidde m / z 700-3,500; spektrum datatype profil.
  10. Indstil parametrene for væskekromatograf som følger: kolonne ovn temperatur 20 ° C; Sample bakke temperatur 10 ° C; gradientprogram 0-0,5 min 5% B, 0,5-1 min 5-30% B, 1-3,5 min 30-40% B, 3,5-5 min 40-98% B, 5-6 min 98% B, 6- 6,05 min 98-5% B, 6,05-8 min 5% B; strømningshastighed 0,4 ml / min.
  11. Purge bobler ved at trykke bunden af ​​hætteglassene. Set prøvehætteglas på prøven rack og injicere 1,0 pi af en prøve under anvendelse autosampleren at starte analysen.
  12. Åbn rå datafiler med browseren software og bekræft, at alle erhvervelser succes er færdig, herunder positive og negative kontroller.
    Bemærk: Typisk vil to eller tre toppe observeres i den samlede ionstrøm kromatogram ved en retentionstid på 4-5,5 min når pufferfish DNA med held amplificeret og fordøjet.

5. Dekonvolution og Tolkning

  1. Start dekonvolution software. Vælg eksperiment type "auto-ekstrakt (isotopisk løst)".
  2. Rediger en metode ved hjælp af følgende parametre: output masse M; S / N threshold3, relativ forekomst tærskel 0; negativ ladning ja; beregne udvundet ion nuværende kromatogram (XIC) ja, m / z rækkevidde 700-3,500; ladningsbærer H +; mindste antal detekteret gebyr på 3; isotopforhold nukleotid; fit faktor 80%; Resten tærskel 0%; overveje overlapninger ja; opkræve interval 3-50; minimum intensitet 1; forventede intensitet fejl 3.
    1. Gem som en ny metode, og vælg den.
  3. Vælg den mappe, hvor der findes de rå datafiler. Vælg de rå datafiler, der skal analyseres, og klik på 'Tilføj til kø "knappen.
  4. Klik på knappen 'Kør' på fanen 'Run kø "for at starte udfoldning.
  5. Efter køen er fuldført, skal du vælge en række og klik på 'Åbn Result "i øverste billedtekst for at opnå resultaterne af udfoldning.
  6. Fortolke resultaterne fra monoisotopisk masserne afledt af toppe ved en retentionstid på 4-5,5 min ved anvendelse tabel 4.

Representative Results

Tre kommercielt tilgængelige søjler blev bedømt for adskillelsen af ​​lange oligonukleotider ved strømningshastigheder på 100-400 pi / min. En bredporet octadecyl carbonkæde (C18) søjle -bundne partikelformet silica (a), en kommercielt tilgængelig poly (styren-divinylbenzen) (PS-DVB) monolit kolonne (b) og en C 18 -bundne silica monolit-søjle ( c) blev sammenlignet (figur 1). Tre par af de DNA-duplekser (26, 37 og 53 bp) blev adskilt under anvendelse af alle kolonner, og C18 -bundne silica monolit søjle blev anvendt i efterfølgende studier.

Repræsentative resultater af analyse af en DNA-prøve ekstraheret fra musklen af T. rubripes er vist i figur 2. Isotop opløste toppe, som vist i figur 2a, er nødvendige for en vellykket beregning af monoisotopisk masse. Den teoretiske og measmåles monoisotopisk masse af T. rubripes er vist i figur 2b. Fordi fordøjelsen med endonukleaser udføres lige efter PCR amplifikation uden oprensning, er 3'-klæbrig ende genereret af Mspl endonuclease fyldt op med det resterende DNA-polymerase. Ifølge analysen af ampliconer afledt af de syntetiske DNA-templates, masse nøjagtighed varierede fra -2,48 til 2,40 ppm (0,62 ± 0,74 ppm i gennemsnit, n = 280). Således blev en masse tolerance på 3 ppm anvendes til at differentiere arter (tabel 4). Ved hjælp af tabellen, blev alle de pufferfish prøver fra markeder og butikker korrekt differentieret som specifikke arter 37.

Ifølge den regelmæssige analyser af prøven opnået fra det syntetiske DNA-template af T. Chrysops, alle monoisotopisk masser af analytter lykkedes bestemmes inden for ± 3 ppm i least 180 timer uden nogen massekalibrering (figur 3). Det betyder, at massekalibrering ville være nødvendigt på en ugentlig basis.

figur 1
Figur 1: Samlet ionstrøm kromatogrammer af PCR-RFLP produkt afledt af det syntetiserede DNA-template af T. pardalis anvendelse af en C 18 -bundne partikelformigt silicasøjle (a, 3 × 250 mm, partikelstørrelse 3 um), en poly (styren-divinylbenzen) (PS-DVB) monolit kolonne (b, 1,0 x 250 mm) og en C18 -bundne monolit silicasøjle (c, foreliggende fremgangsmåde) betingelser for (a):. strømningshastighed 0,2 ml / min; Forholdet mellem methanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-20 min 25% -40%, 20-35 min 40% -98%, 35-50 min 98%, 50- 51 min 98% -5%, 51-65 min 5%. Betingelser for (B):strømningshastighed 0,1 ml / min; Forholdet mellem methanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-35 min 25% -40%, 35-40 min 40% -98%, 40-55 min 98%, 55- 56 min 98% -5%, 56-70 min 5%. Temperaturen for begge kolonner var 20 ° C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Repræsentative resultater til analyse rå muskel i T. rubripes. (a) Typiske total ion nuværende kromatogrammer og massespektrum. (B) Teoretisk og målte monoisotopisk masserne af PCR-RFLP biprodukter fra syntetiserede DNA template af T. rubripes. Klik her for at se et stortr version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Stabilitetstest som resumé ampliconer afledt af det syntetiske DNA af T. Chrysops blev analyseret hver 10 timer. Masse kalibrering blev ikke udført under testen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Navn sekvens
lago86F 5'-CCATGTGGAATGAAAACACC-3'
taki114F 5'-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA-3'
fugu86-114R 5'-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3'

Tabel 1: PCR primere.

PCR-reagens anvendte volumen Endelig koncentration
Ultrapurified vand 15,75 pi
Detergent-fri 5x Buffer 5,0 pi 1x
dNTP-blanding (10 mM hver) 0,5 pi 0,2 mM
Primer mix (10 pM hver af lago86F, taki114F og fugu86-114R i TE-buffer pH 8,0) 1,0 pi 0,4 uM hver
DNA-polymerase (2,5 enhed / pl) 0,25 pi 0,1 enhed / ul
Template-DNA i TE-buffer pH 8,0 (5,0-10 ng / pl for ekstraherede prøve, 0,2 uM for syntetisk DNA som positiv kontrol) 2,5 pi 0,5-1,0 ng / pl for ekstraherede DNA og 20 nM for syntetisk DNA
Total: 25 pi

Tabel 2: Komponenter i en 25 pi skala PCR.

Cyklus Tilstand Fungere
1 2 minutter ved 95 ° C indledende denaturering
2 30 s ved 95 ° C denaturering
3 30 s ved 56 ° C annealing
4 30 s ved 72 ° C forlængelse
5 Gentag 2-4 (alt 30 cykler)
6 7 minutter ved 72 ° C Final Forlængelse
7 Fastholdelse ved 12 ° C indtil fjernelse af prøven

Tabel 3: PCR program.

Peak nummer ved retentionstid på 4,0-5,5 min Monoisotopisk masse af tredje top i området (Da) Monoisotopisk masse af den anden top i området (Da) pufferfish arter
mindre streng større streng mindre streng større streng
2 → → 15890,707 til 15890,803 16177,531 til 16177,629 L. inermis
15921,702 til 15921,797 16146,537 til 16146,634 L. gloveri
15930,713 til 15930,809 16137,525 til 16137,622 L. Lunaris
15937,697 til 15937,792 16131,537 til 16131,634 L. wheeleri
24173,034 til 24173,179 24566,905 til 24567,053 T. Chrysops
3 16295,706 til 16295,804 16467,610 til 16467,709 11341,851 til 11341,919 11466,875 til 11466,944 T. pardalis
T. snyderi
T. ocellatus
T. xanthopterus
T. stictonotus
11654,908 til 11654,978 11770,920 til 11770,991 T. niphobles
16296,701 til 16296,799 16468,605 til 16468,704 → → T. rubripes
16311,701 til 16311,799 16452,610 til 16452,709 → → T. poecilonotus
T. exascurus
16320,713 til 16320,811 16443,599 til 16443,697 → → T. porphyreus
T. obscurus
16599,751 til 16599,851 16780,667 til 16780,767 → → T. vermicularis

Tabel 4: Differentiering af pufferfish fra monoisotopisk masser afledt af LC / ESI-MS.

tabel 5
Tabel 5: amplificeret DNA-sekvens (a) Sekvensen er identisk med.de andre pufferfish arter som beskrevet i tabel 4. Klik her for at se en større version af denne tabel.

Discussion

For at udvinde DNA, er et kommercielt kit til ekstraktion af DNA fra blod og væv anvendes i overensstemmelse med protokollen af ​​fabrikanten mindre modifikation (mængde proteinase K og centrifugering af lysis opløsning). Imidlertid kan enhver ekstraktion kit anvendes, så længe som cellulært DNA kan ekstraheres med passende genvinding og renhed til PCR. Denne metode er blevet testet under anvendelse af muskler, fin, lever, ovarie, og huden 37. Fin er specielt velegnet på grund af det store areal, der muliggør hurtig lysis med proteinase K. Frisk, frosne, tørrede, kogt og bagt pufferfish prøver blev testet med succes 37.

PCR-primersættet (tabel 1) er designet til pufferfish og forstærker det mitokondrielle 16S ribosomale RNA gen af pufferfish. Mål-DNA til amplifikation er 114-115 bp (slægt japansk kuglefisk) og 86 bp (slægt Lagocephalus) (tabel 5). For at lette metode development, blev syntetiseret oligonukleotider med målsekvenserne anvendes til henvisningen i stedet for at indsamle autentiske pufferfish prøver. Primersættet kan erstattes af en anden primersæt som reaktion på formålet bør imidlertid endelige DNA længde efter enzymatisk fordøjelse være mindre end 100 nt med hensyn til at opretholde kvaliteten af ​​massespektret kræves for en vellykket udfoldning. Derudover bør nitrogentryk i C-fælden blive reduceret, når mål-oligonukleotidet er længere end omkring 75 nt og kvaliteten af ​​massespektret er utilstrækkelig til vellykket udfoldning. Sådanne begrænsninger kan styres gennem den seneste udvikling i instrument software, ellers skal være indstillet ventilen for C-fælden inde chassiset som beskrevet i protokollen sektion. Som for prøveforberedelse, brug af detergent-fri reagenser er kritisk for den efterfølgende LC i form af passende topform, tilstrækkelig topintensitet og stabil retentionstid 31.

21,24-33, en C18 omvendt fase partikelformet silicakolonne 23,40,41 og en hydrofob interaktions-kromatografi (HILIC) søjle 42 er blevet anvendt til LC / ESI-MS-analyse af oligonukleotider. Blandt dem, den kapillære monolit kolonne er overlegen i forhold til de andre i form af adskillelse kapacitet imidlertid den kapillære monolit anvendte søjle i tidligere undersøgelser blev foretaget internt og drives ved en lav strømningshastighed (2 pl / min), hvilket kræver instrumentering dedikeret til mikro LC. For at lette nem betjening, blev kommercielt tilgængelige søjler evalueret for separation af lange oligonukleotider ved højere strømningshastigheder (100-400 pi / min). Tre par DNA-duplekser (26, 37 og 53 bp) blev adskilt under anvendelse af de ovenfor nævnte søjler imidlertid cyklustiderne af C 18 -bundne partikelformet silicasøjle og PS-DVB monolit kolonnen var 65 og 70 min, henholdsvis , mens den for C (figur 1). Idet hurtig analyse i betragtning, blev silica monolit kolonnen C18 -bundne valgt til vores formål Trods den begrænsede adskillelse kapacitet; imidlertid de resterende to kolonner kan anvendes, når forbedret adskillelse er påkrævet. Teoretisk er tale om en monolit kolonne, er der ingen mellemliggende volumen og den mobile fase ville blive tvunget til at strømme gennem porerne den faste fase og samtidig opretholde en konsistent vejlængde, hvilket muliggør en effektiv adskillelse 27. Sådanne fremgangsmåder ville være manifesteret, især i analysen af ​​biomakromolekyler såsom et oligonukleotid, som den langsomme diffusion af store molekyler. En af de praktiske fordele ved en monolit kolonne er at modtrykket er lavere end for et partikelformet silicasøjle 27. Trods den høje strømningshastighed (400 pl / min) og lav søjletemperatur (20 ° C), maksimalt modtryksystemet var 12,5 MPa 37. Dette er den første demonstration af fordelen ved en C18 -bundne silica monolit kolonnen for hurtig analyse af en lang oligonucleotid. På grund af den høje strømningshastighed, er en særligt instrument til micro LC og præcis justering ved grænsefladen ikke påkrævet. I stedet er en opvarmet ESI sonde der kræves for at adskille DNA duplex og hjælpe ionisering af DNA som beskrevet senere.

Ionpar chromatografi anvendes almindeligvis til MS-kompatibel adskillelse af oligonukleotider. Men en ion-pair reagens generelt interfererer med ESI-processen og reducerer følsomheden af ​​ESI-MS. Derfor HFIP ofte anvendes til den mobile fase for at forbedre følsomheden af ​​oligonukleotidet. Imidlertid HFIP (kogepunkt 59 ° C) fordamper hurtigt ved grænsefladen før methanol (kogepunkt 65 ° C), og derfor dette tab af opløsningsmiddel forøger pH og fremmer dissociation af ion-pair-reagens (dvs. TEA)fra oligonukleotidet. Fordi den foreliggende fremgangsmåde anvender en opvarmet ESI sonde, som nebulizes eluatet med varm nitrogengas ved 350 ° C, kan denne effekt overvurderes. I stedet for HFIP-TEA buffer, Erb og Oberacher anbefalede cyclohexyldimethylammonium acetat (CycHDMAA; pH 8,4) til genotypning analyse på grund af en reduktion i adduktdannelse med spormetalioner 33. Forfatterne udledes, at CycHDMAA selv undertrykte dannelsen af ​​metallet adduktet. Trods litteraturen, har signifikant adduktdannelse ikke observeret i den foreliggende fremgangsmåde. Derudover bemærkelsesværdigt fordel for HFIP-TEA-methanol-system er, at toparealet opnås med HFIP-TEA-methanol-system var 17 gange større end det, der opnås fra CycHDMAA-acetonitril-system, når man analyserer en 86 bp amplikon af T. poecilonotus (data ikke vist). En ulempe ved den HFIP-TEA-methanol-system, er imidlertid de øgede omkostninger i forhold til CycHDMAA-acetonitril-system.

Beregning af monoisotopisk masse kræver adskillelse af isotopiske toppe af multipelt ladede ioner. Derfor opløsning er kritisk for den foreliggende analyse. Selvom fornødne opløsningsevne er afhængig af basepar længde af analysanden, konventionelle TOF-analysatorer, som har en opløsningsevne på flere titusinder, kan begrænses til analyse af korte oligonukleotider.

De teoretiske monoisotopisk masserne vist i tabel 4 blev beregnet ud fra den tilsvarende base sammensætninger af analytter. Alternativt Muddiman et al. Udviklet et program til at beregne basen sammensætning fra præcise masse 43. Et lignende program blev integreret i den automatiske ESI-MS systemet 16-18. Brugen af ​​disse algoritmer kan forbedre robustheden af ​​den nuværende metode, fordi en målt monoisotopisk masse ikke altid svarer til en unik bund sammensætning ofløj til massen tolerance på 3 ppm som følge af den uundgåelige målefejl. Desværre kunne vi ikke få disse software produkter til denne undersøgelse.

Den foreliggende monoisotopisk massebaserede artsbestemmelse kan være egnet ikke kun for differentieringen af ​​pufferfish men også til påvisning af andre DNA-polymorfismer, fordi den foreliggende fremgangsmåde er baseret på analyse af basesammensætning og ikke indebærer en procedure særligt udformet til pufferfish. Som til påvisningen af DNA-polymorfisme, den dedikerede ESI-MS systemet er fuldt automatiseret og let at betjene, hvilket kan være egnet til diagnostisk anvendelse, såsom detektion af patogener 15,17,18,20,30. Omvendt er den nuværende metode er muligt med fælles forsknings- instrumenter og apparater og derfor, velegnet til forskning anvendelser. ESI-MS er allerede blevet anvendt til humant DNA polymorfi såsom enkelt nukleotid polymorfisme 13,28,32, kort tandem gentagelse 26Og mitokondrie-DNA analsis 16,19. Micro RNA blev også analyseret via kapillær LC / ESI-MS 44. Disse offentliggjorte ansøgninger kan også realiseres ved den foreliggende fremgangsmåde. Desuden kan denne fremgangsmåde være egnet til overvågning af samspillet mellem oligonucleotid og lav molekylvægt forbindelser, såsom interaktionen af antibiotika og ribosomalt RNA 45 på grund af lav temperatur separation. I sådanne tilfælde, oligonukleotider og lav molekylvægt forbindelser bør detekteres samtidigt, hvilket er en fordel ved anvendelse af LC / ESI-MS.

Der er en begrænsning, at instrumentering er ikke egnet til at udføre parallel analyse som i traditionelle teknikker, såsom Sanger sekventering og real-time PCR. Desuden er den nuværende metode kun identificerer basesammensætning og enhver base, ombytning efter samme molekyle kan ikke skelnes. Dog kan MS-baserede DNA-analyse beskrevet her stadig har værdi i sigts af nøjagtighed i forhold til det DNA-bindende farvestof-baserede teknikker, såsom gelelektroforese og real-time PCR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) Qiagen 69504 DNA extraction kit
Proteinase K Qiagen 19131
Ethanol (99.5+ vol%) Wako 054-07225 For dilution of wash buffers
TE buffer (pH 8.0) Wako 310-90023 For dilution of DNA sample
PCR primer Fasmac NA Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier
Template DNA Eurofins Genomics NA Purified by HPLC by the supplier
Ultrapurified water NA NA Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation
Detergent Free 5x Phusion HF Buffer Thermo Fisher F-520L Use instead of the provided buffer of DNA polymerase
Pfu-X DNA polymerase Jena Bioscience PCR-207S
dNTP mix (20 mM each) Jena Bioscience NA Supplied with the DNA polymerase
10× Universal buffer M Takara Bio NA Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl
Dra I Thermo Fisher FD0224 Restriction enzyme
Msp I Thermo Fisher FD0544 Restriction enzyme
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) Fluka 42060-50ML Eluent additive for LC-MS grade.
Triethylamine (TEA) Fluka 65897-50ML Eluent additive for LC-MS grade.
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508 For preparation of calibrant.
Sodium hydroxide (1.0 M) Fluka 72082 Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid.
Acetonitrile Fluka 34967 For preparation of calibrant, LC/MS grade.
Methanol Kanto 25185-76 For mobile phase, LC/MS grade.
Water Thermo Fisher W6-1 For mobile phase, LC/MS grade.
Microcentrifuge tube (0.5 ml) Eppendorf 0030123301 PCR clean grade
Microcentrifuge tube (1.5 ml) Eppendorf 0030123328 PCR clean grade
UVette Eppendorf 0030106300 Disposable UV cuvette.
Gel Green Biotium 41004 Fluorescent DNA stain
Cosmospin filter G (0.2 μm) Nakalai Tesque 06549-44 Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable.
300 μl PP screw vial American Chromatography Supplies V0309P-1232
Preassembled screw cap and septa Finneran 5395-09R
Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) Kyoto Monotech 2050H30ODS Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/)
Monobis C18 guard column Kyoto Monotech GCSET-ODS3210 Holder included.
Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) Imtakt CW036 C18-bonded particulate silica column
ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) Thermo Fisher 066640 Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column
Themo Mixer C Eppendorf 5382 000.023 For digestion of fish tissues.
Spectrophotometer Shimadzu UV-3150 Quantification of DNA concentration.
Thermal cycler Bio-Rad T100
Portable refrigerator Twinbird D-CUBE For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box.
Ultimate 3000 liquid chromatograph Thermo Fisher NA
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher NA Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer.
Protein deconvolution 3.0 Thermo Fisher NA Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oberacher, H. On the use of different mass spectrometric techniques for characterization of sequence variability in genomic DNA. Anal. Bioanal. Chem. 391, 135-149 (2008).
  2. Banoub, J. H., Miller-Banoub, J., Jahouh, F., Joly, N., Martin, P. Chapter 1, Overview of recent developments in the mass spectrometry of nucleic acid and constituents. Mass spectrometry of nucleosides and nucleic acids. Banoub, J. H., Limbach, P. A. 1, CRC Press. 1-90 (2010).
  3. Yergey, J., Heller, D., Hansen, G., Cotter, R. J., Fenselau, C. Isotopic distributions in mass spectra of large molecules. Anal. Chem. 55, 353-356 (1983).
  4. Zubarev, R. A., Demirev, P. A. Isotope depletion of large biomolecules: Implications for molecular mass measurements. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 149-156 (1998).
  5. Null, A. P., Muddiman, D. C. Determination of a correction to improve mass measurement accuracy of isotopically unresolved polymerase chain reaction amplicons by electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 1714-1722 (2003).
  6. Hu, Q., Noll, R. J., Li, H., Makarov, A., Hardman, M., Cooks, R. G. The Orbitrap: a new mass spectrometer. J Mass Spectrom. 40, 430-443 (2005).
  7. Senko, M. W., Beu, S. C., McLaffertycor, F. W. Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 6, 229-233 (1995).
  8. Horn, D. M., Zubarev, R. A., McLafferty, F. W. Automated reduction and interpretation of high resolution electrospray mass spectra of large molecules. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, 320-332 (2000).
  9. Frahm, J. L., Mason, C. J., Muddiman, D. C. Utility of accurate monoisotopic mass measurements to confidently identify lambda exonuclease generated single-stranded amplicons containing 7-deaza analogs by electrospray ionization FT-ICR mass spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 234, 79-87 (2004).
  10. Frahm, J. L., Muddiman, D. C. Nucleic Acid analysis by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry at the beginning of the twenty-first century. Curr. Pharm. Des. 11, 2593-2613 (2005).
  11. Null, A. P., George, L. T., Muddiman, D. C. Evaluation of sample preparation techniques for mass measurements of PCR products using ESI-FT-ICR mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13, 338-344 (2002).
  12. Null, A. P., Benson, L. M., Muddiman, D. C. Enzymatic strategies for the characterization of nucleic acids by electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 2699-2706 (2003).
  13. Manduzio, H., Ezan, E., Fenaille, F. Evaluation of the LTQ-Orbitrap mass spectrometer for the analysis of polymerase chain reaction products. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 3501-3509 (2010).
  14. Manduzio, H., Martelet, A., Ezan, E., Fenaille, F. Comparison of approaches for purifying and desalting polymerase chain reaction products prior to electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Biochem. 398, 272-274 (2010).
  15. Hofstadler, S. A., et al. TIGER: the universal biosensor. Int. J. Mass Spectrom. 242, 23-41 (2005).
  16. Eduardoff, M., et al. Mass spectrometric base composition profiling: Implications for forensic mtDNA databasing. Forensic Sci. Int. Genet. 7, 587-592 (2013).
  17. Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J. Clin. Microbiol. 51, 40-45 (2013).
  18. Legoff, J., et al. Broad-range PCR-electrospray ionization mass spectrometry for detection and typing of adenovirus and other opportunistic viruses in stem cell transplant patients. J. Clin. Microbiol. 51, 4186-4192 (2013).
  19. Kiesler, K. M., Coble, M. D., Hall, T. A., Vallone, P. M. Comparison of base composition analysis and Sanger sequencing of mitochondrial DNA for four U.S. population groups. Forensic Sci. Int. Genet. 8, 226-232 (2014).
  20. Bacconi, A., et al. Improved sensitivity for molecular detection of bacterial and Candida infections in blood. J. Clin. Microbiol. 52, 3164-3174 (2014).
  21. Huber, C. G., Oberacher, H. Analysis of nucleic acids by on-line liquid chromatography-mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 20, 310-343 (2001).
  22. Pourshahian, S., McCarthy, S. M. Chapter 4, Analysis of oligonucleotides by liquid chromatography and mass spectrometry. Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products. Bonilla, J. V., Srivatsa, G. S. , CRC Press, Chapter. 137-166 (2011).
  23. Apffel, A., Chakel, J. A., Fischer, S., Lichtenwalter, K., Hancock, W. S. Analysis of Oligonucleotides by HPLC-Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 69, 1320-1325 (1997).
  24. Premstaller, A., Oberacher, H., Huber, C. G. High-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry of single- and double-stranded nucleic acids using monolithic capillary columns. Anal. Chem. 72, 4386-4393 (2000).
  25. Oberacher, H., Oefner, P. J., Parson, W., Huber, C. G. On-Line Liquid Chromatography Mass Spectrometry: A Useful Tool for the Detection of DNA Sequence Variation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 3828-3830 (2001).
  26. Oberacher, H., Parson, W., Muhlmann, R., Huber, C. G. Analysis of polymerase chain reaction products by on-line liquid chromatography-mass spectrometry for genotyping of polymorphic short tandem repeat loci. Anal. Chem. 73, 5109-5115 (2001).
  27. Oberacher, H., Huber, C. G. Capillary monoliths for the analysis of nucleic acids by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Trends Anal. Chem. 21, 166-174 (2002).
  28. Oberacher, H., et al. Re-sequencing of multiple single nucleotide polymorphisms by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 30, e67 (2002).
  29. Oberacher, H., Parson, W., Holzl, G., Oefner, P. J., Huber, C. G. Optimized suppression of adducts in polymerase chain reaction products for semi-quantitative SNP genotyping by liquid chromatography-mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 1897-1906 (2004).
  30. Mayr, B. M., et al. Identification of bacteria by polymerase chain reaction followed by liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 4563-4570 (2005).
  31. Oberacher, H., Niederstatter, H., Casetta, B., Parson, W. Some guidelines for the analysis of genomic DNA by PCR-LC-ESI-MS. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 124-129 (2006).
  32. Beer, B., et al. CYP2D6 genotyping by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 400, 2361-2370 (2011).
  33. Erb, R., Oberacher, H. Comparison of mobile-phase systems commonly applied in liquid chromatography-mass spectrometry of nucleic acids. Electrophoresis. 35, 1226-1235 (2014).
  34. Cohen, N. J., et al. Public health response to puffer fish (Tetrodotoxin) poisoning from mislabeled product. J. Food Prot. 72, 810-817 (2009).
  35. Cole, J. B., et al. Tetrodotoxin poisoning outbreak from imported dried puffer fish--Minneapolis, Minnesota 2014. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 63, 1222-1225 (2015).
  36. Ohno, Y., et al. The influence of tetrodotoxin on the toxic effects of aconitine in vivo. Tohoku J. Exp. Med. 167, 155-158 (1992).
  37. Miyaguchi, H., Yamamuro, T., Ohta, H., Nakahara, H., Suzuki, S. Genotyping of Toxic Pufferfish Based on Specific PCR-RFLP Products As Determined by Liquid Chromatography/Quadrupole-Orbitrap Hybrid Mass Spectrometry. J. Agric. Food Chem. 63, 9363-9371 (2015).
  38. Sambrook, J. F., Russell, D. W. Neutral polyacrylamide gel electrophoresis. in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 40-46 (2001).
  39. Moini, M., Jones, B. L., Rogers, R. M., Jiang, L. Sodium trifluoroacetate as a tune/calibration compound for positive- and negative-ion electrospray ionization mass spectrometry in the mass range of 100-4000 Da. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 977-980 (1998).
  40. Fountain, K. J., Gilar, M., Gebler, J. C. Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 646-653 (2003).
  41. Chen, B., Bartlett, M. G. Evaluation of mobile phase composition for enhancing sensitivity of targeted quantification of oligonucleotides using ultra-high performance liquid chromatography and mass spectrometry: application to phosphorothioate deoxyribonucleic acid. J. Chromatogr. A. 1288, 73-81 (2013).
  42. Gong, L., McCullagh, J. S. Analysis of oligonucleotides by hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to negative ion electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1218, 5480-5486 (2011).
  43. Muddiman, D. C., Anderson, G. A., Hofstadler, S. A., Smith, R. D. Length and base composition of PCR-amplified nucleic acids using mass measurements from electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 69, 1543-1549 (1997).
  44. Kullolli, M., Knorf, E., Arampatzidou, M., Tewari, M., Pitteri, S. J. Intact MicroRNA analysis using high resolution mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 80-87 (2013).
  45. Cummins, L. L., Chen, S., Blyn, L. B., Sannes-Lowery, K. A., Drader, J. J., Griffey, R. H., Hofstadler, S. A. Multitarget affinity/specificity screening of natural products: finding and characterizing high-affinity ligands from complex mixtures by using high-performance mass spectrometry. J. Nat. Prod. 66, 1186-1190 (2003).

Tags

Genetik Biokemi DNA oligonucleotid monoisotopisk masse Fugu basesammensætning elektrospray
Forbedret polymerasekædereaktion-restriktionsfragmentlængde-polymorfisme Genotypebestemmelse af toksiske Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miyaguchi, H. Improved Polymerase… More

Miyaguchi, H. Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (115), e54402, doi:10.3791/54402 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter