Summary
En forbedret polymerasekjedereaksjon-rflp Fremgangsmåte for genotyping Pufferfish art ved væskekromatografi / massespektrometri er beskrevet. En omvendt-fase silika-kolonne monolitten anvendes for separering av fordøyd amplikoner. Denne metoden kan belyse monoisotopic massene av oligonukleotider, noe som er nyttig for å identifisere basesammensetning.
Abstract
En forbedret versjon av en polymerase kjedereaksjon (PCR) -restriction fragmentlengde-polymorfisme (RFLP) Fremgangsmåte for genotyping giftige Pufferfish art ved væskekromatografi / elektrospray ionisering-massespektrometri (LC / ESI-MS) er beskrevet. DNA-ekstraksjon blir utført ved anvendelse av en silika-membran-baserte DNA ekstraksjon kit. Etter at PCR-amplifikasjon ved bruk av en detergent-fri PCR-buffer, blir restriksjonsenzymer tilsatt til den løsning uten rensing av reaksjonsløsningen. En omvendt-fase silika-kolonne og monolitt en Fourier-transform med høy oppløsning massespektrometer med en modifisert Kingdon felle analysator anvendes for separasjon og deteksjon, respektivt. Den mobile fasen, bestående av 400 mM 1,1,1,3,3,3-heksafluor-2-propanol, 15 mM trietylamin (pH 7,9) og metanol blir levert ved en strømningshastighet på 0,4 ml / min. Syklustiden for LC / ESI-MS-analyse er 8 min inklusive ekvilibrering av kolonnen. Deconvolution programvare har en isotop distribusjonsmodell of oligonukleotidet blir brukt til å beregne den tilsvarende monoisotopic masse fra massespektrum. For analyse av oligonukleotider (spredning 26-79 nukleotider), masse nøyaktighet var 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) og utmerket nøyaktighet og presisjon ble opprettholdt i 180 timer uten bruk av en lås masse standard.
Introduction
Massespektrometri (MS) er en akseptert teknologi for rask og pålitelig identifikasjon av nukleinsyrer, matriks-assistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) og elektrospray ionisering (ESI) som brukes for ionisering 1,2. Den MALDI teknikken er vanligvis kombinert med en time-of-flight (TOF) analysator; imidlertid er anvendelsen av MALDI-TOF-MS begrenset til korte oligonukleotider (~ 25 nukleotider (nt)) på grunn av det påfølgende fragmentering, adduktdannelse og lav ionisering effektivitet 1,2. I motsetning til dette er ESI gjelder for lengre oligonukleotider (> 100 nt), men mange ladetilstander på multippel ladede ioner ([M-nH] n-) fremstilles samtidig fra biomacromolecules og dermed massen av analytten kan overstige den øvre grensen for m / z spekter av spektrometeret. Dette krever tolkning av korrugert spektra, dvs. omdanning av en ladetilstand serie til den tilsvarende massevia deconvolution.
I tilfelle av massen måling av et lite molekyl, toppen av monoisotopic masse, det vil si, er massen av molekylet inneholdende bare den vanligste isotop av hvert element den mest tallrike og observert naturlig tre. Som de molekylære øker vekten, blir isotoper distribusjons skifter til høyere m / z og monoisotopic topp skjult av baseline støy 3-5. Når monoisotopic toppen lenger kan påvises for masser som er større enn 10 kDa 3, er den gjennomsnittlige molekylvekt som brukes for måling i stedet for monoisotopic massen 5. I slike tilfeller kan det isotop-fordeling hvor hver av de individuelle topper blir atskilt med en Da bare observeres når en høy oppløsningsmasse analysator slik som et TOF, en Fourier-transform modifisert Kingdon felle analysator 6, eller en Fourier-transformasjon ion syklotron resonans analysator er brukt for analyse. Imidlertid er den mest tallrike topp sometimes ikke forenlig med gjennomsnittlig molekylvekt 5. Disse problemene kan føre til problemer for nøyaktig bestemmelse av analytter.
På grunn av variasjonen i den naturlige overflod av stabile isotoper og vanskelighetene i den bestemmer den midlere molekylvekt, er måling av monoisotopic massen ideell for masse karakterisering av biomolekyler 3,4. I praksis om en monoisotopic topp kan observeres eller ikke, den monoisotopic massen kan bli estimert ved å sammenligne mønsteret av den observerte isotopiske distribusjon til den teoretiske en beregnet fra en modell analytt 4,7-10. Beslaget algoritmen 8 er nå innlemmet i proprietær programvare.
I sammenheng med ESI-MS, er dissosiasjon av en DNA-dupleks, rensing og avsalting som kreves for direkte måling for å unngå svikt i ionisering grunnet ion undertrykkelse og adduktdannelse 2,10-14. Disse prosedyrene er troublesome imidlertid helautomatisk analysesystemer er blitt utviklet kommersielt som omfatter polymerase kjedereaksjon (PCR), prøvepreparering og ESI-MS for påvisning av patogener 15-20. En annen tilnærming er å innføre væskekromatografi (LC) for separasjon. LC gir en on-line separasjon av analytter i kjøl stoffer og krever ikke en arbeidskrevende prøvepreparering før ioniseringshodet 21,22. Imidlertid er separasjonen av nukleinsyrer ved hjelp av en MS-kompatibel mobil fase vanskeligere enn for de fleste andre forbindelser, så som medikamenter, peptider og proteiner på grunn av den polyanioniske art av nukleotidene. De mest vellykkede eksemplene på LC / ESI-MS involverer bruk av ione-par omvendt-fase LC. En mobil fase av 1,1,1,3,3,3-heksafluor-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -metanol ble opprinnelig foreslått av Apffel et al. For separering og detektering av korte oligonukleotider 23. Bruk av LC / ESI-MS genotyping for differentiation av patogene arter, enkelt-nukleotid polymorfismer og korte tandemrepetisjoner er rapportert ved bruk av en kapillær polymer-monolitt kolonne som kan skille lengre oligonukleotider 1,21,24-33.
I Japan og USA, har alvorlig matforgiftning oppstått på grunn av feilidentifisering og upassende utarbeidelse av pufferfish, og dette er til tross for at fordelingen og utarbeidelse av pufferfish er strengt kontrollert av mat sikkerhetslovgivningen 34,35. Videre en tilsiktet mord ved hjelp pufferfish ekstrakt skjedde i Japan 36. Derfor er differensiering av Pufferfish arter kreves fra både folkehelsen og rettsmedisinske etterforsknings standpunkter. I tillegg, fordi Takifugu rubripes er langt dyrere enn andre typer pufferfish, en differensiering kapasitet er også nødvendig i sammenheng med mat svindel undersøkelser.
Her er en detaljert fremgangsmåte for å bestemme monoisotopic masse av et PCR-produkt ved LC / ESI-MS ved anvendelse av en revers-fase silika-kolonne og monolitt en høy oppløsning massespektrometer beskrives. Nærmere bestemt, har tilnærmingen er utviklet for å muliggjøre differensiering av toksiske Pufferfish arter basert på bruk av PCR rflp (RFLP) metode 37, som er det første eksempel på arter differensiering av dyr ved hjelp av MS.
Protocol
1. DNA Extraction
Merk: Bruk et eget rom for DNA-ekstraksjon og post-PCR undersøkelser som gel elektroforese og LC / ESI-MS. Legg etanol til vaskebuffer 1 (inneholdende guanidin-hydroklorid) og vaskebuffer 2 (ikke inneholdende guanidin-hydroklorid) i henhold til DNA-ekstraksjon settprotokollen. Fiskeprøver ble tatt fra fisk grossister og personkundemarkedet i Japan.
- Plasser 30-50 mg av fisk vev i et 0,5 ml eller 1,5 ml mikrosentrifugerør. Squash vev ved hjelp av en mikro-spatel (unntatt for fin og hud).
Merk: I tilfelle av fin, bruker en 0,5 ml tube for soaking. - Legg 180 pl av lyseringsbuffer og 40 ul proteinase K og vortex kort. Inkuber ved 56 ° C på et blokkvarmer i 2 timer eller over natten. Bland ved kort å virvle hvert 15. minutt i løpet av inkuberingen.
Merk: Komplett lyse er ikke nødvendig. - Sentrifuger i 5 min ved 13000 x g. Etter sentrifugering, hvis en liten amount av olje som finnes på overflaten i tilfelle av en fettprøve, slik som leveren, kast den. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Tilsett 200 ul av den kaotropiske buffer inneholdende guanidin-hydroklorid, og bland ved virvling. Tilsett 200 ul etanol (99,5%) og blanding ved å virvle igjen.
- Overfør blandingen i spinnkolonne plassert i en 2 ml oppsamlingsrør. Sentrifuger i 1 min ved 13 000 x g. Kast gjennomstrømnings.
Forsiktig: Ikke legg blekemiddel til avfall fordi guanidin kan danne svært reaktive forbindelser med blekemiddel. - Legg 500 ul av vaskebuffer 1 (inneholdende guanidin-hydroklorid) og sentrifuger i 1 min ved 13 000 x g. Kast strømmen gjennom og oppsamlingsrøret.
- Plasser spinnkolonne i en ny 2 ml oppsamlingsrør levert med kittet. Legg 500 ul av vaskebuffer 2 og sentrifuger i 3 minutter ved 20 000 x g. Kast gjennomstrømnings og oppsamlingsrøret. Overfør spinnkolonne til en ny1,5 ml mikro tube.
- Pipetter 200 pl elueringsbuffer til midten av spinnkolonne membranen. Etter 1 min, sentrifuger i 1 min ved 6000 x g.
- Pipetter 50 ul av eluatet til en engangs UV-kyvette og måle UV-spektrum av eluatet ved 220-300 nm og absorbansen ved 260 nm ved anvendelse av et spektrofotometer.
- Verifisere UV-spektrum av DNA med toppen ved 260 nm. Beregn den omtrentlige DNA-konsentrasjon ved hjelp av den enkle ligning "DNA-konsentrasjon (ng / mL) = absorbans ved 260 nm x 50".
Merk: konsentrasjon Typisk DNA ekstrahert fra finnene pufferfish er 63 ± 30 ng / mL (n = 20). - Dersom DNA-konsentrasjonen er høyere enn 10 ng / mL, fortynnet DNA-prøvene med Tris-EDTA (TE) buffer (pH 8) til 5 ng / mL.
- Oppbevar prøven ved -20 ° C eller fortsett til PCR-amplifikasjon (seksjon 2).
2. PCR
- Sett opp 25 mL PCR for hver extrhandlet DNA-prøve, positiv kontroll (0,2 uM syntetiserte oligonukleotid med target-sekvensen i TE-buffer pH 8,0) og negativ kontroll (ultrapurified vann i stedet for DNA-prøve) på is i henhold til tabell 1 og 2 på en ren benk for å unngå forurensning.
Merk: For enkel betjening, gjør tilstrekkelig mengde cocktail som inneholder alle reagenser uten templat-DNA og dispensere det. Bruke DNA-polymerase som har korrektur aktivitet for å unngå tilsetning av 3 'A-overheng for å PCR-produktet. - Utføre PCR-amplifikasjon på en termosykler ved hjelp av syklusprogrammet vist i tabell 3.
3. Enzymatisk Fordøyelse
- Tilsett 2 ul av løsningen inneholdende 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 500 mM NaCl til PCR-løsning.
- Tilsett 1 pl av hvert restriksjonsenzym (Dral og MSP I) og bland forsiktig. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C på thermal cycler.
- Inkuber i 5 min ved 72 ° C for å aktivere gjenværende DNA-polymerase, som fyller klebrig ende som genereres av MSP I.
- Valgfritt: Analyser hver 2.5 ul av reaksjonsløsningen ved polyakrylamidgelelektroforese ved anvendelse av en kryss kobling forhold (% C, andel av bisakrylamid) på 3,33 (vekt%) og en polyakrylamid-gel-konsentrasjon (% T) 15 (% w / v) 38. Stain gelen ved hjelp av fluorescerende DNA flekken og observere dobbel tråd DNA på et blått lys transilluminator ved hjelp av et gult skjermen.
- Filtrer reaksjonsoppløsningen med en 0,2-0,5 um sentrifugal-filteranordning for å hindre tilstopping, noe som ville skade den analytiske kolonnen.
- Overfør filtratet til en konisk polypropylen-hetteglass og oppbevar ved -20 ° C inntil analyse.
4. LC / ESI-MS analyse
- Veie 67,2 g (ca. 42 ml) av HFIP og 1,52 g (ca. 2,0 ml) av TEA i en 1-liters flaske. Legg 955 ml ultrapurified vann (LC / MS grade) og rør ved hjelp av en magnetrører inntil reagensene er fullstendig oppløst. Ta en alikvot av løsningen, og kontroller pH (mellom 7,85 og 7,95, ideelt pH = 7,9) ved anvendelse av et pH-meter.
Merk: Ikke returner delmengde til flasken for å unngå forurensning av metallioner. Dersom pH ikke er 7,9, tilsette en liten mengde av enten HFIP eller TEA for å justere pH og måling av pH-verdien på nytt. - Koble flasken til linje A på væskekromatograf med avkjøling av flasken ved hjelp av en bærbar direkte kjøling kjøleskap (for husholdningsbruk) for å forhindre fordampning. Koble en annen flaske fylt med metanol til linje B.
- Koble beskyttelseskolonne og analytisk kolonne (2,0 x 50 mm, mesoporøs size = 30 nm) til den væskekromatograf. Strømme det første mobile fase (95% A, 5% B) for å ekvilibrere kolonnene.
- Fremstille 0,5 mg / ml natrium-trifluoracetat (pH 3,5) som en kalibrerings 39.
- Veie 50 mg (ca. 34 mL) av tri acid i et beger.
- Tilsett 30 ml ultrapurified vann og titrere til pH 3,5 med 10 mM natrium-hydroksyd ved hjelp av et pH-meter.
- Fyll opp til 50 ml med ultrapurified vann. Tilsett 50 ml acetonitril (LC / MS grade) og bland.
- Ta en del av arbeidsoppløsningen og lagre det ved romtemperatur. Lagre resten av løsningen ved 4 ° C.
- Redusere nitrogentrykk på den C-felle som følger.
Merk: Recent Fourier transform massespektrometrene som er egnet for intakt protein analyse, har kontroll programvare for å kontrollere trykket.- Ta av til venstre toppdeksel massespektrometer. C-fellen ventilen er på hjørnet av til venstre i forgrunnen.
- Sjekk høyt vakuum trykkverdi i instrumentstatusvinduet i kontrollprogramvare.
Merk: Verdien er typisk, 3 x 10 -8 bar. - Trekk knotten for å låse opp og vri på bryteren mot klokken veldig sakte for å redusere høyt vakuum trykkure til 1/3 (vanligvis 1 x 10 -8 bar). Den indikerte Trykket bør endres gradvis i en forsinket måte. Ignorer advarselen om lavt trykk. Trykk på knappen for å låse.
- Gjenopprett toppdekselet for sikkerhet.
- Kalibrere massespektrometer med natrium trifluoroacetate 39.
Merk: Daglig masse kalibrering kan erstattes av denne protokollen, men det anbefales kalibrering foreslått av produsenten burde vært gjennomført før denne kalibreringen.- Sett skanneparametre og oppvarmede ESI kilde parametere i instrumentet kontrollboks for tuning programvaren som følger: skannetype i full MS; scan range m / z 500-4,000; fragmentering (in-kilde kollisjon indusert dissosiasjon (CID) spenning 60 eV, polaritet negative; automatisk styrkekontroll (AGC) målrette 1 x 10 6, maksimum injisere tid 50 msek, skjede gass strømningshastighet 5; aux gass strømningshastighet 0; feie gass strømningshastighet 0; spray spenning 3 kV, kapillær temperatur 320 ° C; S-objektiv radiofrekvens (RF) nivå 100; varmeapparat temperatur 30 ° C.
- Input listen over negative ioner for å bli overvåket som m / z 792,85908, 1064,80870, 1336,75832, 1608,70794, 1880,65755, 2152,60717, 2424,55679, 2696,50640, 2968,45602, 3376,38045.
- Bevege den oppvarmede ESI sonden nærmere grensesnittet av massespektrometer (stilling B). Koble sonden og en sprøyte med et rør.
- Sette mot kalibrerings konstant ved en strømningshastighet på 10 ul / min ved anvendelse av det innebygde sprøytepumpe. Sjekk bare de 6 nedre masseioner (m / z 792,85908 til 2152,60717) i den tilpassede kalibreringstabellen.
- Fortsett med kalibrering etter intensiteten av signalene er stabilisert. Etter kalibrering, sjekk bare de seks høyere masseioner (m / z 1880,65755 til 3376,38045) og fortsett med kalibrering. Unngå kalibrering ved hjelp av alle ionene samtidig for å unngå svikt.
- Sett skanneparametre og oppvarmede ESI kilde parametere i instrumentet kontrollboks for tuning programvaren som følger: skannetype i full MS; scan range m / z 500-4,000; fragmentering (in-kilde kollisjon indusert dissosiasjon (CID) spenning 60 eV, polaritet negative; automatisk styrkekontroll (AGC) målrette 1 x 10 6, maksimum injisere tid 50 msek, skjede gass strømningshastighet 5; aux gass strømningshastighet 0; feie gass strømningshastighet 0; spray spenning 3 kV, kapillær temperatur 320 ° C; S-objektiv radiofrekvens (RF) nivå 100; varmeapparat temperatur 30 ° C.
- Flytt sonden til appropriate posisjon for en strømningshastighet på 0,4 ml / min (stilling D) og kobles til den væskekromatograf med en inert metallrør.
- Sett de oppvarmede ESI kilde parametere i instrumentet kontrollboks for tuning programvaren som følger: skjede gass strømningshastighet 50; aux gasstrømningshastigheten 15; feie gasstrømningshastigheten 1; spray spenning 2,5 kV; kapillær temperatur 350 ° C; S-objektiv RF nivå 100; varmeapparat temperatur 350 ° C.
- Sett oppkjøp parametre av massespektrometer i instrumental oppsettvinduet som følger: metode varighet 8 min; avlede ventil, 3,5-6 min til massespektrometer, 0 til 3,5 og 6-8 min til avfall; runtime 3,5 til 6 min; polaritet negative; i kilde CID spenning 15,0 eV; microscans 3; nominell oppløsning strøm (ved m / z 200) 140 000; AGC mål 1 x 10 6; maksimal ion tid 50 ms; antall skanninger 1; scan range m / z 700-3,500; spektrum datatype profil.
- Sett parametre i flytende kromatograf som følger: kolonne ovn temperatur 20 ° C; sample skuffen temperatur 10 ° C; gradient program 0-0,5 min 5% B, 0,5-1 min 5-30% B, 1-3,5 min 30-40% B, 3,5 til 5 min 40-98% B, 5-6 min 98% B, 6- 6.05 min 98-5% B, 6,05 til 8 min 5% B; strømningshastighet 0,4 ml / min.
- Purge bobler ved å trykke på bunnen av hetteglassene. Sett prøverør på prøven rack og injisere 1,0 mL av en prøve ved hjelp av autosampler å starte analysen.
- Åpne rådatafiler med nettleser og bekrefter at alle oppkjøpene er vellykket ferdig, inkludert de positive og negative kontroller.
Merk: Vanligvis vil to eller tre topper observeres i den totale ionestrøm kromatogrammet ved en retensjonstid på 4 til 5,5 min når pufferfish DNA er vellykket amplifisert og spaltet.
5. Deconvolution og tolkning
- Start deconvolution programvare. Velg eksperiment type "auto-ekstrakt (isotopically løst)".
- Redigere en metode ved hjelp av følgende parametere: utgangsmasse M; S / N threshold 3, relative overflod terskel 0; negativ ladning ja; beregne hentet ion nåværende kromatogram (XIC) ja, m / z utvalg 700-3,500; lade carrier H +; minimum antall oppdaget kostnad 3; isotop-forhold nucleotide; fit faktor 80%; Resten terskel 0%; vurdere overlapp ja; lade range 3-50; minimum intensitet 1; forventet intensitet feil tre.
- Lagre som en ny metode, og velg den.
- Velg katalogen der eksisterer rå datafiler. Velg rådatafiler som skal analyseres, og klikk "Legg til i kø" -knappen.
- Klikk "Kjør" -knappen på fanen "Kjør Kø 'for å starte deconvolution.
- Etter køen er fullført, velger en rad og klikk 'Open Resultat "i øvre bildeteksten for å få resultatene av deconvolution.
- Tolke resultatene fra de monoisotopic massene avledet fra toppene på en retensjonstid på 4-5.5 min ved hjelp av tabell 4.
Representative Results
Tre kommersielt tilgjengelige kolonner ble evaluert for separasjon av lange oligonukleotider ved strømningshastigheter på 100 til 400 ul / min. En vid-poret oktadecyl-karbonkjede (C-18)-bundet partikkelformig silikakolonne (a), en kommersielt tilgjengelig poly (styren-divinylbenzen) (PS-DVB) monolitten kolonne (b) og en C-18-bundet silika monokolonne ( c) ble sammenlignet (figur 1). Tre par av DNA-duplekser (26, 37 og 53 bp) ble separert ved hjelp av alle kolonnene, og den C-18-bundet silika monokolonne ble anvendt i etterfølgende studier.
Representative resultater for analyse av en DNA-prøve ekstraheres fra muskel av T. rubripes er vist i figur 2. Isotopisk oppløste topper, slik som vist i figur 2a, er nødvendig for å lykkes med å beregne monoisotopic masse. Den teoretiske og measfigurert monoisotopic masse av T. rubripes er vist i figur 2b. Fordi spaltning med endonukleaser er utført like etter PCR amplifikasjon uten rensing, er 3'-klebrig ende som genereres av MSP I endonuklease fylt opp med det resterende DNA-polymerase. Ifølge analysen av amplikonene avledet fra de syntetiske DNA-templater, masse nøyaktighet varierte fra -2,48 til 2,40 ppm (0,62 ± 0,74 ppm i gjennomsnitt, n = 280). Således ble en masse toleranse på 3 ppm som brukes for å skille artene (tabell 4). Ved hjelp av tabellen, er alle de Pufferfish prøver tatt fra markeder og lagrer ble riktig differensiert som spesifikke arter 37.
I henhold til den periodiske analyse av prøven oppnådd fra det syntetiske DNA-templat av T. chrysops, alle monoisotopic masser av analyttene ble vellykket bestemt innenfor ± 3 ppm for på least 180 hr uten masse kalibrering (figur 3). Dette betyr at massen kalibrering vil være nødvendig på en ukentlig basis.
Figur 1: Totale ionestrøm kromatogrammer av PCR-RFLP produkt avledet fra den syntetiserte DNA-templat av T. pardalis ved hjelp av en C-18-bundet partikkelformig silikakolonne (a, 3 x 250 mm, partikkelstørrelse 3 um), en poly (styren-divinylbenzen) (PS-DVB) monokolonne (b, 1,0 x 250 mm) og en C-18 -bundet monosilikakolonne (c, liggende fremgangsmåte) betingelser for (a).: strømningshastighet 0,2 ml / min; forhold mellom metanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-20 min 25% -40%, 20-35 min 40% -98%, 35-50 min 98%, 50- 51 min 98% -5%, 51-65 min 5%. Betingelser for (b):strømningshastighet 0,1 ml / min; forhold mellom metanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-35 min 25% -40%, 35-40 min 40% -98%, 40-55 min 98%, 55- 56 min 98% -5%, 56-70 min 5%. Temperaturen for begge kolonnene var 20 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative resultater for analysering av rå muskel av T. rubripes. (a) Typiske total ion gjeldende kromatogrammene og massespektrum. (B) Teoretiske og målte monoisotopic masser av PCR-RFLP produkter avledet fra det syntetiserte DNA mal av T. rubripes. Klikk her for å se et stortr versjon av denne figuren.
Fig. 3: Stabilitetstest i samle amplikonene avledet fra den syntetiske DNA fra T. chrysops ble analysert hver 10 time. Mass kalibrering ble ikke utført i løpet av testen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navn | Sekvens |
| lago86F | 5'-CCATGTGGAATGAAAACACC-3' |
| taki114F | 5'-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA-3' |
| fugu86-114R | 5'-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3' |
Tabell 1: PCR primere.
| PCR reagens | volumet som | Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP |
| Ultrapurified vann | 15.75 mL | |
| Vaskemiddel fritt 5x Buffer | 5,0 mL | 1x |
| dNTP mix (10 mM hver) | 0,5 ul | 0,2 mm |
| Primer blanding (10 mM hver av lago86F, taki114F og fugu86-114R i TE-buffer pH 8,0) | 1,0 mL | 0,4 pM hver |
| DNA polymerase (2,5 enhet / mikroliter) | 0,25 mL | 0,1 enhet / mikroliter |
| Mal DNA i TE-buffer pH 8,0 (5,0 til 10 ng / mL for ekstraherte prøven, 0,2 mikrometer for syntetisk DNA som positiv kontroll) | 2,5 mL | 0,5-1,0 ng / mL for ekstraherte DNA og 20 nM for syntetisk DNA |
| Totalt: 25 pl |
Tabell 2: komponenter i en 25 ul PCR målestokk.
| Syklus | Betingelse | Funksjon |
| 1 | 2 min ved 95 ° C | initial denaturering |
| 2 | 30 s ved 95 ° C | denaturering |
| 3 | 30 s ved 56 ° C | gløding |
| 4 | 30 s ved 72 ° C | Forlengelse |
| 5 | Gjenta 2-4 (totalt 30 sykluser) | |
| 6 | 7 min ved 72 ° C | endelig Forlengelse |
| 7 | Hold ved 12 ° C inntil fjerning av prøven |
Tabell 3: PCR-programmet.
| Peak nummer ved retensjonstid på 4,0 til 5,5 min | Monoisotopic massen av det tredje topp i området (Da) | Monoisotopic massen av den andre topp i området (Da) | pufferfish arter | ||
| mindre strand | større strand | mindre strand | større strand | ||
| 2 | → | → | 15890,707 til 15890,803 | 16177,531 til 16177,629 | L. inermis |
| 15921,702 til 15921,797 | 16146,537 til 16146,634 | L. gloveri | |||
| 15930,713 til 15930,809 | 16137,525 til 16137,622 | L. Lunaris | |||
| 15937,697 til 15937,792 | 16131,537 til 16131,634 | L. wheeleri | |||
| 24173,034 til 24173,179 | 24566,905 til 24567,053 | T. chrysops | |||
| 3 | 16295,706 til 16295,804 | 16467,610 til 16467,709 | 11341,851 til 11341,919 | 11466,875 til 11466,944 | T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus |
| 11654,908 til 11654,978 | 11770,920 til 11770,991 | T. niphobles | |||
| 16296,701 til 16296,799 | 16468,605 til 16468,704 | → | → | T. rubripes | |
| 16311,701 til 16311,799 | 16452,610 til 16452,709 | → | → | T. poecilonotus T. exascurus | |
| 16320,713 til 16320,811 | 16443,599 til 16443,697 | → | → | T. porphyreus T. obscurus | |
| 16599,751 til 16599,851 | 16780,667 til 16780,767 | → | → | T. vermicularis | |
Tabell 4: Differensiering av pufferfish fra monoisotopic massene stammer fra LC / ESI-MS.
Tabell 5: amplifisert DNA-sekvens (a) sekvens er identisk med.at av de andre Pufferfish arter som er beskrevet i tabell 4. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Discussion
For å ekstrahere DNA, er et kommersielt sett for å ekstrahere DNA fra blod og vev som brukes i henhold til protokollen fra produsenten med mindre modifiseringer (mengde av proteinase K og sentrifugering av lysis løsning). Imidlertid kan en hvilken som helst ekstraksjon kit benyttes så lenge som cellulært DNA kan ekstraheres med passende utvinning og renhet for PCR. Denne fremgangsmåten har blitt testet ved hjelp av muskler, finnen, lever, ovarie, og hud 37. Fin er spesielt egnet på grunn av det store arealet, noe som muliggjør rask lysis med proteinase K. fersk, frossen, tørket, kokt og bakt Pufferfish prøver ble testet med hell 37.
PCR primersett (tabell 1) er utformet for pufferfish og forsterker den mitokondrielle 16S ribosomal RNA genet av pufferfish. Mål-DNA for å forsterke er 114-115 bp (genus Takifugu) og 86 bp (genus Lagocephalus) (tabell 5). For å lette metoden development, ble syntetisert oligonukleotider som har de målsekvenser som brukes for referanse i stedet for å samle autentiske Pufferfish prøver. Den primersett kan erstattes av en annen primer angitt i respons til formålet, men endelige DNA-lengde etter enzymatisk spaltning bør være mindre enn 100 nt når det gjelder å opprettholde kvaliteten av massespekteret som kreves for vellykket dekonvolvering. I tillegg bør nitrogentrykk i den C-felle reduseres når målet oligonukleotidet er lengre enn 75 nt, og kvaliteten på massespekteret er utilstrekkelig for vellykket dekonvolvering. Slike begrensninger kan styres via den senere tids utvikling i instrument-programvare, ellers ventilen for den C-fellen inne i selve kabinettet må innstilles som beskrevet i fremgangs delen. Som for prøveopparbeidelse, er bruk av vaskemiddel frie reagenser kritisk for den påfølgende LC i form av passende topp form, tilstrekkelig peak intensitet og stabil oppholdstid 31.
21,24-33, en C-18 revers-fase partikkelformig silikakolonne 23,40,41 og en hydrofob interaksjonskromatografi (HILIC) kolonne 42 er blitt anvendt for LC / ESI-MS analyse av oligonukleotider. Blant dem er det kapillære monolitten kolonnen overlegne i forhold til de andre i form av separasjonskapasiteten, men det kapillær monolitten kolonnen som brukes i tidligere studier ble gjort i huset og drevet ved en lav strømningshastighet (2 mL / min), noe som krever instrumentering dedikert til micro LC. For å lette enkel betjening, ble kommersielt tilgjengelige kolonner evaluert for separasjon av lange oligonukleotider ved høyere strømningshastigheter (100 til 400 ul / min). Tre par av DNA-duplekser (26, 37 og 53 bp) ble separert ved anvendelse av de ovennevnte kolonner, imidlertid syklustider på C-18-bundet partikkelformig silikakolonne og PS-DVB monolitten kolonne var 65 og 70 min, respektivt , mens det av den C-
Ionepar-kromatografi er vanligvis brukes for MS-kompatible separasjon av oligonukleotider. Imidlertid kan en ione-par-reagens generelt forstyrrer ESI prosessen og reduserer følsomheten av ESI-MS. Derfor er HFIP ofte brukt for den mobile fasen for å forbedre følsomheten av oligonukleotidet. Imidlertid HFIP (kokepunkt 59 ° C) fordamper hurtig ved grenseflaten før metanol (kokepunkt 65 ° C), og derfor dette tapet av oppløsningsmiddel øker pH og fremmer dissosiasjon av ione-par-reagens (dvs. TEA)fra oligonukleotidet. Fordi den foreliggende fremgangsmåte anvender en oppvarmet ESI sonde, som nebulizes eluatet med varm nitrogengass ved 350 ° C, kan denne effekten understrekes sterkt nok. I stedet for HFIP-TEA buffer, Erb og Oberacher anbefales cyclohexyldimethylammonium acetat (CycHDMAA, pH 8,4) for genotyping analyse på grunn av en reduksjon i adduktdannelse med spormetallioner 33. Forfatterne sluttet at CycHDMAA seg undertrykket dannelsen av metall adduktet. Til tross for den litteratur, har betydelig adduktdannelse ikke blitt observert i den foreliggende fremgangsmåte. Dessuten er det bemerkelsesverdig fordel for HFIP-TEA-metanol system at topparealet oppnådd med HFIP-TEA-metanol system var 17 ganger større enn det som ble oppnådd fra den CycHDMAA-acetonitril-system for å analysere en 86 bp fragment av T. poecilonotus (data ikke vist). En ulempe ved de HFIP-TEA-metanol system, er imidlertid den økte kostnaden i forhold til den CycHDMAA-acetonitril-system.
Beregning av monoisotopic massen krever separasjon av isotoper toppene formere ladede ioner. Derfor er oppløsning kritisk for den foreliggende analyse. Selv om nødvendig oppløsning strømmen er avhengig av basepar lengde av analytten, konvensjonelle TOF analysatorer, som har en oppløsning kraft på flere titalls tusen, kan være begrenset til analyse av korte oligonukleotider.
De teoretiske monoisotopic massene er vist i tabell 4, ble beregnet ut fra den tilsvarende base sammensetninger av analytter. Alternativt Muddiman et al. Utviklet et program for å beregne basesammensetningen fra nøyaktig masse 43. Et lignende program ble integrert i automatiserte ESI-MS system 16-18. Bruken av disse algoritmene kan forbedre robustheten den nåværende metoden fordi en målt monoisotopic masse ikke alltid svarer til en unik base komposisjon ovinge til massen toleranse på 3 ppm som følge av den uunngåelige målefeil. Dessverre kunne vi ikke få tak i disse programvareprodukter for denne studien.
Den foreliggende monoisotopic masse-basert bestemmelse art kan være egnet ikke bare for differensiering av pufferfish men også for påvisning av andre DNA-polymorfismer fordi den foreliggende fremgangsmåte er basert på analyse av basisblandingen og ikke involverer en prosedyre spesielt utformet for pufferfish. Når det gjelder påvisning av DNA-polymorfisme, er den dedikerte ESI-MS system helautomatisk og lett å betjene, noe som kan være egnet for diagnostisk anvendelse slik som påvisning av patogener 15,17,18,20,30. Omvendt er den foreliggende fremgangsmåte mulig med vanlige forskningsinstrumenter og apparater, og derfor egnet for forsknings- formål. ESI-MS har allerede blitt brukt til menneskelig DNA polymorfisme som enkeltnukleotidpolymorfi 13,28,32, kort tandem repetisjon 26Og mitokondrielle DNA analsis 16,19. Micro RNA ble også analysert via kapillær LC / ESI-MS 44. Disse publiserte søknader kan også realiseres ved den foreliggende fremgangsmåte. I tillegg kan denne metoden være egnet for overvåkning av interaksjon mellom oligonukleotid og lav-molekylvekt-forbindelser, såsom interaksjonen av antibiotika og ribosomalt RNA 45 på grunn av den lave temperatur separasjon. I slike tilfeller, oligonukleotider og lav-molekylvekt-forbindelser skal bli detektert samtidig, noe som er en fordel med å bruke LC / ESI-MS.
Det er en begrensning at den instrumentering er ikke egnet for å utføre parallell analyse som i konvensjonelle teknikker som Sanger-sekvensering og real-time PCR. I tillegg identifiserer den foreliggende fremgangsmåte bare basesammensetning og enhver base substitusjon innenfor det samme molekyl kan ikke skilles fra hverandre. Imidlertid kan MS-baserte DNA-analyse er beskrevet her fortsatt har fortrinn på sikts av nøyaktighet i sammenligning med DNA-bindende fargestoffbaserte teknikker som gelelektroforese og real-time PCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Ethanol (99.5+ vol%) | Wako | 054-07225 | For dilution of wash buffers |
| TE buffer (pH 8.0) | Wako | 310-90023 | For dilution of DNA sample |
| PCR primer | Fasmac | NA | Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier |
| Template DNA | Eurofins Genomics | NA | Purified by HPLC by the supplier |
| Ultrapurified water | NA | NA | Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation |
| Detergent Free 5x Phusion HF Buffer | Thermo Fisher | F-520L | Use instead of the provided buffer of DNA polymerase |
| Pfu-X DNA polymerase | Jena Bioscience | PCR-207S | |
| dNTP mix (20 mM each) | Jena Bioscience | NA | Supplied with the DNA polymerase |
| 10× Universal buffer M | Takara Bio | NA | Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl |
| Dra I | Thermo Fisher | FD0224 | Restriction enzyme |
| Msp I | Thermo Fisher | FD0544 | Restriction enzyme |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Fluka | 42060-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
| Triethylamine (TEA) | Fluka | 65897-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | For preparation of calibrant. |
| Sodium hydroxide (1.0 M) | Fluka | 72082 | Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid. |
| Acetonitrile | Fluka | 34967 | For preparation of calibrant, LC/MS grade. |
| Methanol | Kanto | 25185-76 | For mobile phase, LC/MS grade. |
| Water | Thermo Fisher | W6-1 | For mobile phase, LC/MS grade. |
| Microcentrifuge tube (0.5 ml) | Eppendorf | 0030123301 | PCR clean grade |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | Eppendorf | 0030123328 | PCR clean grade |
| UVette | Eppendorf | 0030106300 | Disposable UV cuvette. |
| Gel Green | Biotium | 41004 | Fluorescent DNA stain |
| Cosmospin filter G (0.2 μm) | Nakalai Tesque | 06549-44 | Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable. |
| 300 μl PP screw vial | American Chromatography Supplies | V0309P-1232 | |
| Preassembled screw cap and septa | Finneran | 5395-09R | |
| Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) | Kyoto Monotech | 2050H30ODS | Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/) |
| Monobis C18 guard column | Kyoto Monotech | GCSET-ODS3210 | Holder included. |
| Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) | Imtakt | CW036 | C18-bonded particulate silica column |
| ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) | Thermo Fisher | 066640 | Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column |
| Themo Mixer C | Eppendorf | 5382 000.023 | For digestion of fish tissues. |
| Spectrophotometer | Shimadzu | UV-3150 | Quantification of DNA concentration. |
| Thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Portable refrigerator | Twinbird | D-CUBE | For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box. |
| Ultimate 3000 liquid chromatograph | Thermo Fisher | NA | |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | NA | Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer. |
| Protein deconvolution 3.0 | Thermo Fisher | NA | Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide. |
References
- Oberacher, H. On the use of different mass spectrometric techniques for characterization of sequence variability in genomic DNA. Anal. Bioanal. Chem. 391, 135-149 (2008).
- Banoub, J. H., Miller-Banoub, J., Jahouh, F., Joly, N., Martin, P. Chapter 1, Overview of recent developments in the mass spectrometry of nucleic acid and constituents. Mass spectrometry of nucleosides and nucleic acids. Banoub, J. H., Limbach, P. A. 1, CRC Press. 1-90 (2010).
- Yergey, J., Heller, D., Hansen, G., Cotter, R. J., Fenselau, C. Isotopic distributions in mass spectra of large molecules. Anal. Chem. 55, 353-356 (1983).
- Zubarev, R. A., Demirev, P. A. Isotope depletion of large biomolecules: Implications for molecular mass measurements. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 149-156 (1998).
- Null, A. P., Muddiman, D. C. Determination of a correction to improve mass measurement accuracy of isotopically unresolved polymerase chain reaction amplicons by electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 1714-1722 (2003).
- Hu, Q., Noll, R. J., Li, H., Makarov, A., Hardman, M., Cooks, R. G. The Orbitrap: a new mass spectrometer. J Mass Spectrom. 40, 430-443 (2005).
- Senko, M. W., Beu, S. C., McLaffertycor, F. W. Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 6, 229-233 (1995).
- Horn, D. M., Zubarev, R. A., McLafferty, F. W. Automated reduction and interpretation of high resolution electrospray mass spectra of large molecules. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, 320-332 (2000).
- Frahm, J. L., Mason, C. J., Muddiman, D. C. Utility of accurate monoisotopic mass measurements to confidently identify lambda exonuclease generated single-stranded amplicons containing 7-deaza analogs by electrospray ionization FT-ICR mass spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 234, 79-87 (2004).
- Frahm, J. L., Muddiman, D. C. Nucleic Acid analysis by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry at the beginning of the twenty-first century. Curr. Pharm. Des. 11, 2593-2613 (2005).
- Null, A. P., George, L. T., Muddiman, D. C. Evaluation of sample preparation techniques for mass measurements of PCR products using ESI-FT-ICR mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13, 338-344 (2002).
- Null, A. P., Benson, L. M., Muddiman, D. C. Enzymatic strategies for the characterization of nucleic acids by electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 2699-2706 (2003).
- Manduzio, H., Ezan, E., Fenaille, F. Evaluation of the LTQ-Orbitrap mass spectrometer for the analysis of polymerase chain reaction products. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 3501-3509 (2010).
- Manduzio, H., Martelet, A., Ezan, E., Fenaille, F. Comparison of approaches for purifying and desalting polymerase chain reaction products prior to electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Biochem. 398, 272-274 (2010).
- Hofstadler, S. A., et al. TIGER: the universal biosensor. Int. J. Mass Spectrom. 242, 23-41 (2005).
- Eduardoff, M., et al. Mass spectrometric base composition profiling: Implications for forensic mtDNA databasing. Forensic Sci. Int. Genet. 7, 587-592 (2013).
- Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J. Clin. Microbiol. 51, 40-45 (2013).
- Legoff, J., et al. Broad-range PCR-electrospray ionization mass spectrometry for detection and typing of adenovirus and other opportunistic viruses in stem cell transplant patients. J. Clin. Microbiol. 51, 4186-4192 (2013).
- Kiesler, K. M., Coble, M. D., Hall, T. A., Vallone, P. M. Comparison of base composition analysis and Sanger sequencing of mitochondrial DNA for four U.S. population groups. Forensic Sci. Int. Genet. 8, 226-232 (2014).
- Bacconi, A., et al. Improved sensitivity for molecular detection of bacterial and Candida infections in blood. J. Clin. Microbiol. 52, 3164-3174 (2014).
- Huber, C. G., Oberacher, H. Analysis of nucleic acids by on-line liquid chromatography-mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 20, 310-343 (2001).
- Pourshahian, S., McCarthy, S. M. Chapter 4, Analysis of oligonucleotides by liquid chromatography and mass spectrometry. Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products. Bonilla, J. V., Srivatsa, G. S. , CRC Press, Chapter. 137-166 (2011).
- Apffel, A., Chakel, J. A., Fischer, S., Lichtenwalter, K., Hancock, W. S. Analysis of Oligonucleotides by HPLC-Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 69, 1320-1325 (1997).
- Premstaller, A., Oberacher, H., Huber, C. G. High-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry of single- and double-stranded nucleic acids using monolithic capillary columns. Anal. Chem. 72, 4386-4393 (2000).
- Oberacher, H., Oefner, P. J., Parson, W., Huber, C. G. On-Line Liquid Chromatography Mass Spectrometry: A Useful Tool for the Detection of DNA Sequence Variation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 3828-3830 (2001).
- Oberacher, H., Parson, W., Muhlmann, R., Huber, C. G. Analysis of polymerase chain reaction products by on-line liquid chromatography-mass spectrometry for genotyping of polymorphic short tandem repeat loci. Anal. Chem. 73, 5109-5115 (2001).
- Oberacher, H., Huber, C. G. Capillary monoliths for the analysis of nucleic acids by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Trends Anal. Chem. 21, 166-174 (2002).
- Oberacher, H., et al. Re-sequencing of multiple single nucleotide polymorphisms by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 30, e67 (2002).
- Oberacher, H., Parson, W., Holzl, G., Oefner, P. J., Huber, C. G. Optimized suppression of adducts in polymerase chain reaction products for semi-quantitative SNP genotyping by liquid chromatography-mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 1897-1906 (2004).
- Mayr, B. M., et al. Identification of bacteria by polymerase chain reaction followed by liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 4563-4570 (2005).
- Oberacher, H., Niederstatter, H., Casetta, B., Parson, W. Some guidelines for the analysis of genomic DNA by PCR-LC-ESI-MS. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 124-129 (2006).
- Beer, B., et al. CYP2D6 genotyping by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 400, 2361-2370 (2011).
- Erb, R., Oberacher, H. Comparison of mobile-phase systems commonly applied in liquid chromatography-mass spectrometry of nucleic acids. Electrophoresis. 35, 1226-1235 (2014).
- Cohen, N. J., et al. Public health response to puffer fish (Tetrodotoxin) poisoning from mislabeled product. J. Food Prot. 72, 810-817 (2009).
- Cole, J. B., et al. Tetrodotoxin poisoning outbreak from imported dried puffer fish--Minneapolis, Minnesota 2014. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 63, 1222-1225 (2015).
- Ohno, Y., et al. The influence of tetrodotoxin on the toxic effects of aconitine in vivo. Tohoku J. Exp. Med. 167, 155-158 (1992).
- Miyaguchi, H., Yamamuro, T., Ohta, H., Nakahara, H., Suzuki, S. Genotyping of Toxic Pufferfish Based on Specific PCR-RFLP Products As Determined by Liquid Chromatography/Quadrupole-Orbitrap Hybrid Mass Spectrometry. J. Agric. Food Chem. 63, 9363-9371 (2015).
- Sambrook, J. F., Russell, D. W. Neutral polyacrylamide gel electrophoresis. in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 40-46 (2001).
- Moini, M., Jones, B. L., Rogers, R. M., Jiang, L. Sodium trifluoroacetate as a tune/calibration compound for positive- and negative-ion electrospray ionization mass spectrometry in the mass range of 100-4000 Da. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 977-980 (1998).
- Fountain, K. J., Gilar, M., Gebler, J. C. Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 646-653 (2003).
- Chen, B., Bartlett, M. G. Evaluation of mobile phase composition for enhancing sensitivity of targeted quantification of oligonucleotides using ultra-high performance liquid chromatography and mass spectrometry: application to phosphorothioate deoxyribonucleic acid. J. Chromatogr. A. 1288, 73-81 (2013).
- Gong, L., McCullagh, J. S. Analysis of oligonucleotides by hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to negative ion electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1218, 5480-5486 (2011).
- Muddiman, D. C., Anderson, G. A., Hofstadler, S. A., Smith, R. D. Length and base composition of PCR-amplified nucleic acids using mass measurements from electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 69, 1543-1549 (1997).
- Kullolli, M., Knorf, E., Arampatzidou, M., Tewari, M., Pitteri, S. J. Intact MicroRNA analysis using high resolution mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 80-87 (2013).
- Cummins, L. L., Chen, S., Blyn, L. B., Sannes-Lowery, K. A., Drader, J. J., Griffey, R. H., Hofstadler, S. A. Multitarget affinity/specificity screening of natural products: finding and characterizing high-affinity ligands from complex mixtures by using high-performance mass spectrometry. J. Nat. Prod. 66, 1186-1190 (2003).
