Summary
非撹拌沈殿重合は、狭いサイズ分布の刺激応答性ポリ（N -isopropylacrylamide）ミクロゲルの合成への迅速な、再現性のプロトタイピング手法を提供します。このプロトコル合成では、光散乱特性評価および広視野顕微鏡のセットアップでこれらのミクロゲルの単一粒子蛍光追跡が実証されています。
Abstract
刺激応答性ポリ（N -isopropylacrylamide）（PNIPAM）マイクロゲルは、様々な将来の実用的なアプリケーションを持っており、基礎研究に使用しています。本研究では、迅速な非撹拌沈殿重合法によってチューニングミクロゲルサイズのためのショーケースとしての蛍光標識したPNIPAMマイクロゲルを追跡する単一粒子を使用しています。このアプローチは、新しい反応組成物および条件を試作するため、または製品を大量に必要としないアプリケーションに適しています。動的および静的光散乱によってミクロゲル合成、粒子サイズ及び構造決意は、プロトコルに詳述されています。官能性コモノマーの添加は、粒子の核生成及び構造に大きな影響を持つことができることが示されています。広視野蛍光顕微鏡による単一粒子追跡を容易にすることによって調査されないシステム、非標識ミクロゲルの濃縮マトリックス中の標識トレーサーマイクロゲルの拡散の調査を可能にしますこのような動的光散乱などの他の方法。
Introduction
刺激応答性ポリ（N -isopropylacrylamide）（PNIPAM）マイクロゲル1,2は、さまざまなスマートアプリケーションでの電位に起因する過去20年間連続の関心を集めています。実証されたユースケースは、低分子量化合物と他の生物医学的用途の12のために切り替え可能なエマルジ ョン安定剤3-8、マイクロレンズ9、細胞培養簡単細胞収穫10,11のための基質、およびスマート担体を含みます。ビューの基礎研究の観点から、これらの粒子は、コロイドの相互作用13-15およびポリマー-溶媒相互作用16-18として被験体を調査するために有用であることが証明されています。
任意のアプリケーションでPNIPAMミクロゲルおよびそれらの誘導体の使用の成功は、典型的には、粒度分布の平均粒径と幅に関する知識を必要とします。 PNIPAMマイクロを含む実験結果の正しい解釈のためのゲルは、官能性コモノマーの影響を受けることができる粒子構造は、知らなければなりません。動的および静的光散乱（DLSそれぞれSLSは、）は、これらの方法は、高速で使用するのが比較的容易であるため、この情報を取得するための一意に適しています。そして彼らは彼らのネイティブ環境（分散）で非侵襲的に粒子特性を調べます。 DLSおよびSLSはまた、顕微鏡法のための典型的な小さなサンプルサイズから生じるバイアスを回避する粒子の膨大な数のデータを収集します。したがって、この研究の最初の目的は、コロイド特性評価への新たな実務家のための光散乱に関するグッドプラクティスを導入することです。
一般的に、沈殿重合は、実験室規模で行われ、特定の粒子特性のための右の反応条件を見出すことは面倒であると合成の多くの繰り返しを必要とすることができます。大きなバッチ合成とは対照的に、非撹拌沈殿重合19,20は、ARであります異なる反応体組成物のバッチは、狭いサイズ分布の粒子を得、同時に重合することができるAPID手順。同時重合実験変動を最小限にし、大きな出力が正しい反応条件は、反応をアップスケーリングするための高速見つけることができることを意味します。したがって、私たちの第二の目的は、プロトタイピングで、製品を大量に必要としないアプリケーションで非撹拌沈殿重合の有用性を実証することです。
合成と特性評価のさまざまな側面は、コロイドの相互作用の研究における蛍光標識されたPNIPAMマイクロゲルの応用例で一緒に来ます。ここでは、広いマトリックス濃度範囲にわたって非標識行列ミクロゲルの分散液中の標識トレーサーのミクロゲルの拡散を調査し、濃縮コロイド分散液中のケージの効果を解決するために、高精度の単一粒子追跡を使用します。広視野蛍光顕微鏡法は、FO適していますrをそれとして、この目的は、潜在的に異なるマトリックス種の多数の中から、いくつかのトレーサー分子の特定の動作を特徴づけることができます。これは、システムのアンサンブル平均特性を測定するため、大規模なシステムでは、プローブ粒子の数が少ないの問題を解決することができないようなDLS、SLSおよびレオロジーなどの技術とは対照的です。また、この具体例では、従来の光散乱法は、任意の標準的な分析を無効に強い多重散乱をもたらす高粒子濃度に起因利用することができません。自動データ処理及び統計的方法の使用は、大きなサンプルサイズにわたって平均単一粒子追跡のために、全体的なシステム挙動の分析を可能にします。
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Protocol
1.マイクロゲルの合成
注：N -isopropylacrylamide（NIPAM）をn-ヘキサンから再結晶しました。受信した他の試薬を使用しました。
- ポリ（NIPAM）マトリックスミクロゲルの従来のバッチ合成
- 濾過245 ml中に1.8グラムのNIPAMと24ミリグラムのN、N '-bisacrylamide（BIS）を溶解（0.2μmの再生セルロース（RC）メンブレンフィルター）還流冷却器を備えた500mlの三首丸底フラスコ中の蒸留水、撹拌機及びゴム隔膜。
- セプタムを通して窒素入力用の温度計と120ミリメートルの針を挿入します。
- 攪拌しながら、60℃に溶液を加熱します。 40分間窒素でパージすることにより溶液を脱酸素。
- 同時に酸素を除去するために二重蒸留水と気泡を窒素で溶液をろ過5ミリリットル中に155mgの過硫酸カリウム（KPS）の開始剤溶液を準備します。
- 完全な5ミリリットルKPS秒の転送120ミリメートル針を装備した、窒素洗浄シリンジ内olution。
- 三口フラスコ内の溶液レベル以上の窒素針を持ち上げて、反応器内にゴム隔膜を介して急速にKPSソリューションを追加します。
- 重合は60℃の窒素気流とゆっくり撹拌しながら1時間進行しましょう。
- 大きな凝集体を破棄するために、熱い反応液をフィルタリングするためにブフナー漏斗とろ紙を使用してください。分散がクールダウンするしてみましょう。
- 遠心分離し、257000×gで40分間分散を3回再分散し、最終的に二重蒸留水の最小実行可能な量の土砂を再分散。典型的には、この2-4 mlです。
- 保存するための分散液を凍結乾燥。
- 蛍光標識ポリ（NIPAM）ミクロゲルの非撹拌合成
- ガラス容器に257.7ミリグラムNIPAM、3.5 mgのBIS、および1.5ミリグラムメタクリルオキシエチルチオカルバモイルローダミンB（染料）を計量し、濾過し、二重にdistillの10ミリリットルを追加します。エド水。
- Ultrasonicate 15分間染料モノマー溶液を水に色素を溶解しました。
- 別のガラス容器に染料を含まない同じ溶液を調製します。
- 様々な染料濃度の濃度系列を得るために、染料なしにモノマー溶液を使用して染料とモノマー溶液の種々の希釈液を調製します。この作業では、0.02から0.1ミリモル/ Lの濃度範囲で染料を使用しています。
- 開始剤溶液を得るために蒸留水をろ過し10ミリリットル中8.4ミリグラムのKPSを溶解させます。
- 最終反応液を取得し、ゴム隔膜でそれらを密封するために、10mmの直径を有する管をテストするために濃度系列を0.5mlとKPS溶液0.5mlを転送します。
- 63℃に加熱サーキュレータに接続された二重壁ガラス容器に油浴を予熱。
- 20分間、120ミリメートルの針を介して窒素でパージすることにより反応液を酸素を除去します。
- AFにチューブを挿入しますプラットフォームをloatingし、予熱した油浴中にプラットフォームを浸します。 60℃に温度を設定します。室温ソリューションはバスをクールダウンとして浴中で最初は高い温度が必要です。高精度な粒径調整の初期反応時の温度制御は、典型的には0.1℃、±、厳密でなければなりません。
- 反応は、適切な時間で進行してみましょう。典型的には1時間で十分です。
- 60℃のオーブンに迅速に反応管に移しにDLSの特徴付けのために、PNIPAM体積相転移温度（VPTT、32 -34℃）で1上予熱蒸留水を濾過し10mlまで熱い分散液の一滴を置きます折り畳まれた状態。
- 分散液の残りは、室温まで冷却し、遠心分離管にそれらを転送してみましょう。
- 257000×gでソリューションを40分間、3回遠心分離し、再蒸留水foのフィルタリング2ミリリットルに最終的にマイクロゲルを希釈Rトレーサー粒子として使用します。
2.光散乱特性評価
- 動的光散乱による折り畳まれた状態での流体力学半径の決意
- キュベットを洗浄し、アセトン蒸気でガラス製品。
- 熱PNIPAM VPTT上で濾過（ 例えば、200nm以下RCフィルタ）の二重蒸留水10ミリリットル。
- 予熱された針（0.9×40 mm）で、シリンジ（1 ml）を用いて濾過した水への熱い分散の低下を転送します。
- 50°CまでDLSゴニオメータインデックスマッチ浴を和らげるし、それがクールダウンさせることなく、機器にサンプルを移します。
- 散乱強度は、試験測定を行うことでコレを取得するのに十分である最大の散乱角を見つけます。
- 試料キュベット（粒子分散液1mLで直径10mmのガラス管）を挿入します。小さな散乱角（ここでは30°）に、検出器アームを移動します。
- foのビームプロファイルをチェックrの多重散乱： など一次ビーム、ノー多重散乱、周りのノーグローはカウント範囲が最も低い散乱角での測定に適していることを確認してください（約30〜600 kHzの間で、ソフトウェアのウィンドウの右上隅を。。）
- 最高の散乱角（ここでは120°を選択します）にゴニオメータアームを移動します。計数率は依然として（30と600 kHzの間）測定のために十分な大きさであることを確認してください。強度が低すぎる場合、散乱角下げるためにアームを移動させます。
- 最低の散乱角で視覚的にトルエン浴ガラスを通してビームを確認し、入射ビームの周りのグローが観察されている場合は、複数の散乱が起こります。この場合、レーザ強度を低下させるか、より高い希釈を使用します。
- 60秒の最小アクイジション時間で-最小と最大の散乱角（140° 例えば 、30°）との間に20相関曲線を取得します。弱い強度の大きな散乱角の取得時間を増やします必要であれば。
- データ解析37
- に従って散乱角のためのベクトルの大きさを散乱計算
ここで、nは、分散液の屈折率であり、 
真空中でのレーザの波長と
散乱角。 - ケースでは、測定ソフトウェアは、強度相関関数を提供します
電界相関関数に変換します
による
。パラメーター
散乱光オベの空間コヒーレンスの程度に関連する興味のない楽器のパラメータであり、検出器領域rを。 - コレログラムのキュムラント解析を行い、 すなわち 、それぞれの電界相関関数の対数に二次多項式にフィット
線形最小二乗によります。 フィットの切片として表示され、その正確な値は、データ分析の点で重要ではありません。最大振幅の20％ -の相関振幅が10になるように、 例えば 、意味の遅れ時間τ値に適合を制限します。一次の項の係数は、相関関数の平均減衰率であります
。 - 平均拡散係数のための最も可能性の高い値を探します
線形最小二乗することにより粒子の上にフィット
。もしに対して
リニア表示され、誤差の範囲内で、原点を通過しない、粒度分布が広く、流体力学的半径が不十分に定義されますです。 - ストークス - アインシュタインの関係から平均流体力学的半径を計算します
ここで、 
ボルツマン係数であり、 
絶対温度と
分散液の粘度に 。の標準偏差を伝播に
。 - 静的光散乱による粒子構造の決意
- キュベットを洗浄し、アセトン蒸気でガラス製品。シリンドリカルレンズの効果を最小にするために直径20mm以上のキュベットを使用します。
- フィルタ（200 nmのRCフィルタまたは小さい）ガラスバイアルに蒸留水の約20ミリリットルバイアルに精製された分散体の落下を転送します。製造プロセスから残存する不純物を除去するための試料調製のためにそれを使用する前に、10mlの水でフィルターを洗浄します。
- 任意の周囲の光源に対してサンプルを確認してください。青色の色相が観察された場合、サンプルも濃縮される可能性があります。それに応じて希釈します。
- キュベットを濾過し、水で複数回洗浄することにより、バックグラウンドの水のサンプルを準備した後、キュベット、機器内のレーザの位置に応じて、適切なサンプル容量に埋めます。レーザーは、メニスカスから屈折されずにサンプルを通過しなければなりません。
- instrumのキャリブレーションENTトルエンサンプルを使用。
- 利用可能な角度範囲全体にわたって水散乱（バックグラウンド）を測定します。
- 好ましくは、いくつかの波長で利用可能な角度範囲にわたって試料からの散乱強度を測定します。前方散乱強度に正規化散乱パターンは、フォームファクタとして知られています。
- 粒子構造が知られている場合、異なる波長で測定されたデータセット上のグローバルフィットを計算するために、適切なモデル式を使用します。
- （などFitIt！33）直接正則未知の粒子構造の使用、または、より一般的な間接的逆フーリエ変換のための粒子のおおよその分類（のみ球状粒子の場合）対距離分布関数の逆畳み込み23,24に関連して21,22ルーチンを変換タイプ。
- 場合フィッティングまたは反転ルーチンが多分散を計算し、粒子径分布関数の推定値を提供しますインデックス（その平均値で割った分布の標準偏差）。
広視野蛍光顕微鏡による3粒子追跡
注：20℃で465±7 nmおよび405±7nmで流体力学的半径のトレーサーとマトリックス粒子が、それぞれ、粒子追跡のために使用しました。
- 試料調製
- 二重蒸留水の既知量に凍結乾燥標識されていないミクロゲルの既知量を再分散することによって濃縮された行列のミクロゲル分散液を準備します。標識トレーサー粒子の小さな体積を追加します。
- 顕微鏡における適切なトレーサーミクロゲル濃度を確認してください。トレーサー粒子トラックが取得中に交差確率が無視できるように十分に低いトレーサ濃度を有しながら、最適な濃度は、トラックの最大数の同時取得の間の妥協です。
- 蒸発させて濃縮された分散液を調製オーブン内の水。蒸発前の試料の元の重量に分散体の重量を比較することにより、重量濃度を決定します。
- データ収集と分析
- サンプルからのトレーサーと同時蛍光コレクションの励起に所望の倍率と絞りの適切な対物レンズを使用してください。この作業では、100X / 1.3 NA油浸対物レンズを使用しています。
- 商業顕微鏡に収まるのxyzピエゾテーブル上に水分室を置きます。
- 乾燥からサンプルを防ぐために、スリップ上に所望の濃度の水分室及びポリ（NIPAM）のピペット10μlの分散にプラズマ洗浄カバースリップを配置。
- 蛍光色素の励起および発光スペクトルに応じて、励起のために適切なレーザーを使用し、適切にレーザーパワーを調整します。強度は、染料の速い光退色を避けるために十分に低いことが、でなければなりません正確な単一粒子の位置決めのために十分に強い、同じ時間（下記参照）。本研究では、561 nmのダイオード励起固体レーザーを使用し、すべての測定のために16ミリワット（ 約 0.5キロワットcm -2のサンプルで）でレーザパワーを一定に保ちます。
- 均質なサンプル照明を得るために、ここで説明するクリティカル照明のセットアップを使用します。このために、カップルは、マルチモードファイバにレーザー（NA 0.22±0.02、0.6ミリメートルのコア径）は、順番にに出て、時間的に平均レーザースペックルをボルテクサーを用いた繊維を振ると、繊維が試料面に終了突出しています。
- カバースリップの後方反射からのz距離を校正し、わずかに目標を移動することにより、試料中に数マイクロメートルの焦点を合わせるとz補償器を使用して、z位置を固定します。これは、カバーガラスとの任意のインターフェイスの影響を回避することができます。
- 蛍光シグナルの強度を、そのような露出時間として検出パラメータを調整します。この場合、EMCCDカメラを使用0.1秒の露光時間で、電子がモード50のゲインを乗じます。
- サンプルの異なる領域にマイクロゲルの平均二乗変位を計算するために十分な遅延時間を得るために、フレームの適切な数を持ついくつかの映画を取得します。本研究では、500または千フレームの取得フレーム番号を使用します。
- ガウシアンフィッティング25を用いて、各フレーム中の粒子を配置することによって、データを分析し、平均二乗変位を得るために適切な粒子追跡アルゴリズム26を使用しています。27の計算すべての映画の中ですべてのトラックを平均することにより値と標準偏差を意味します。から線形回帰によって長い遅延時間拡散係数を計算します
ここで、 
平均二乗変位、D平均拡散係数であり、遅れ時間をτ。 - EST（東部基準時異常拡散方程式から異常パラメータγを iMateの
対数スケールにデータを変換することによって、得
。異常パラメータ
プロットの微分で与えられます。誘導体は、データ点の有限差分によって推定、または多項式関数によってデータ点を適合し、分析的に分化することができます。多項式の次数を増加させるためのフィット残差と残差ノルムをプロットすることにより多項式フィット機能の十分な程度を決定します。 - マイクロゲルマトリックスの異なる濃度に対して同じ手順を繰り返します。
- に従って散乱角のためのベクトルの大きさを散乱計算
ここで、nは、分散液の屈折率であり、 
真空中でのレーザの波長と
散乱角。 
電界相関関数に変換します
による
。パラメーター
散乱光オベの空間コヒーレンスの程度に関連する興味のない楽器のパラメータであり、検出器領域rを。 
線形最小二乗によります。 
。 
線形最小二乗することにより粒子の上にフィット
。もし
リニア表示され、誤差の範囲内で、原点を通過しない、粒度分布が広く、流体力学的半径が不十分に定義されますです。 
ここで、 
ボルツマン係数であり、 
絶対温度と
分散液の粘度に
。 
ここで、 
平均二乗変位、D平均拡散係数であり、遅れ時間をτ。 
対数スケールにデータを変換することによって、得
。異常パラメータ
プロットの微分で与えられます。誘導体は、データ点の有限差分によって推定、または多項式関数によってデータ点を適合し、分析的に分化することができます。多項式の次数を増加させるためのフィット残差と残差ノルムをプロットすることにより多項式フィット機能の十分な程度を決定します。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
バッチ内PNIPAMミクロゲル粒子の数、および、最終的な粒子の体積は、チオカルバモイルローダミンBは、バッチ内の粒子数密度を減少させることによって、核形成に影響を与える核形成段階20疎水性コモノマー色素メタクリロキシエチル中に早期反応で決定されます。二つの異なる初期NIPAM濃度について粒子濃度の低下は、図1に示すように、増加染料濃度の折り畳まれた状態での平均最終粒体積の増加として見ることができる。体積の増加は、疎水性コモノマー色素に起因することができます粒子濃度を減少させ、最終粒子の体積を増加させる、早期の反応時間でミクロゲル核の凝集を促進します。
成功のDLS measuremenからの結果TSは、図2に示されている。Q 2及び誤差内ゼロy切片の平均減衰率Γ2の6最も小さな最終粒子体積バッチ線形依存性のために、これらのバッチの粒子サイズ分布が比較的狭く、十分であることを示しています平均拡散係数のための-defined推定値は線形フィットの傾きから求めることができる。 図3は、Γ2 は、中間のq範囲で線形挙動から外れる二大容量のバッチから、より複雑な結果を示しています。非直線性は、フォームファクタ（角度 散乱パターン）これらのQ値と一致する最小由来する28当該現象は、入射レーザ放射の波長とも適度な粒径分布に匹敵する寸法を有する粒子について観察することができます幅。このQにおける拡散係数の決意、図3の特定の場合には、Γ2は 、高いQで再び平均値の挙動を反映しています。平均拡散係数のための合理的な見積りを得るための簡単な方法は、線形フィットから中間Γ2の値を除外することです。粒子の形状因子が知られている場合には、より複雑なフィッティング方法28を使用することができます。
サンプルはPNIPAM VPTTの下にクールダウンさせることなく折りたたまれた状態で流体力学的体積を決定することは、非ゲル化ゾル画分を粒子から離脱していないことを保証します。したがって、折りたたまれた状態のボリュームはfundam場合に重要である重合時の質量と粒子の数を反映しています沈殿重合の内部の特性は20を調査しています。それは膨潤特性とモノマー混合物中の架橋剤の量によって調節される粒子中の非ゲル化ポリマーの割合とは独立しているので、折り畳まれた状態でボリュームも、異なる反応パラメータを比較するための良い量を提供します。小型化、折りたたまれた状態で、より高い散乱コントラストはまた、DLSの特徴付けを容易にします。
。球状粒子のための典型的な複数の著名な振動を全体を通して：642 nmでの二つの波長とマトリックスのための404 nmで測定し、トレーサー粒子は、図4に示されている角度散乱パターンの目視検査は、粒子は、明確に定義されていることが明らかになった静的光散乱データqは 、それぞれ、この場合には、7％及びトレーサーおよびマトリックスミクロゲル6％の狭い多分散性を示しています。スムーズBehavior低Qでサンプルが十分に希釈されていることを示し、有意な粒子の凝集は存在しません。極端Qの散乱強度の増加は、内側キュベットの壁からの反射ビーム背面に散乱に起因し得ます。マトリックス粒子のフォームファクタの反転は、高密度コアを有する典型的なミクロゲル構造29と架橋共重合速度30（挿入図を参照）に起因する半径方向に減衰する濃度プロファイルを確認します。破線は、マトリックス粒子のような旋回の同じ平均半径の参照ハード球のフォームファクタを示しています。実験的なフォームファクタはファジイ表面を有する粒子に典型的なハード球のフォームファクタ、よりQと速く減衰します。対照的に、トレーサー粒子は型破りなミクロゲルの構造を示します。これはまた、実験的なフォームファクタが最初しないことを示しており、参照ハード球フォームファクターからわかります基準より速く崩壊。この結果は、ミクロゲルに組み込む色素分子は、結果の解釈において考慮される必要があり、その構造に影響を与える可能性があることを示しています。
合成された粒子の高い均一性を正確にこの領域13に進化挙動を決定し、硬質粒子31と比較するために、ガラス転移温度付近の体積分率でのそれらの拡散の研究のために高い関心があります。したがって、標識されたミクロゲルの低い画分は、同等のサイズの非標識ミクロゲルと混合しました。排出経路に使用される励起波長及びフィルタ設定と共にミクロゲル内蔵色素分子は、 図5に示されているの励起及び発光スペクトルを示す。メタクリロキシエチルチオカルバモイルローダミンBの吸光度と発光極大励起波長と蛍光収集範囲に近いです、それぞれ、粒子追跡の設定に高い収集効率を可能にします。非標識の様々なミクロゲルマトリックス濃度のトレーサーミクロゲルの平均二乗変位の時間変化を、それぞれ、線形及び対数スケールで、図6及び図7に示されています。低ミクロゲルマトリックス濃度でトレーサ粒子が急速に拡散します。彼らは焦点面の外に移動する前に、フレームの限られた数のためにのみ表示されていても、それらの平均二乗変位の適度に良好な推定が可能です。時間との平均二乗変位の直線的な増加は、測定した全ての遅延時間のため、通常の拡散挙動を示しています。しかし、コロイドガラス転移に近いマイクロゲル濃度、 すなわちのために、29から36 mg / mlで、平均二乗変位の時間変化は、非線形（ 図7を参照）となります。動作はDESCコロイド状マイクロメートルサイズのPMMA粒子の1に似ています週によってribedとワイツ31とケージ効果に関連することができます。 図10に概略的に示されるように、密行列で標識されたミクロゲルは、ケージ内でかなり自由に拡散することができます。そのため、平均二乗変位は、最初の数ミリ秒で直線的に増加します。粒子は隣人によって形成された一過性のケージに閉じ込められているので、ミクロゲルがさらに移動するためにしかし、周囲のミクロゲルの集団的再配列が必要です。このケージ効果は、図7の第2の範囲ではなく、浅いスロープで自分自身を表現し、また、 図9の粒子トラックを検査することにより確認することができる。彼らはちょうど得るために脱出、そこから粒子がケージに軽く引く短い遅延時間において、再び閉じ込められました。長い遅延時間で、線形拡散挙動が回復されます。ケージ効果は、（二次元的に検出される）の時間発展は、正方形dは平均異常拡散モデルを用いて分析することができますisplacementは、時間にべき乗則で表されます。 
またはその対数形式で
異常パラメータで
32。通常の拡散のために、異常パラメータが1に等しく、subdiffusionは1. 図8以下の値で表される直接対数-対数プロット図7に傾きから求め異常パラメータの時間発展を示す。低濃度のために我々の研究中のミクロゲル、異常パラメータは、基本的にラグタイムについては1に等しいです。 
数秒の範囲内で、係数は低い値に向かって1からずれます。この現象は、広視野顕微鏡の軸（z方向）の観測範囲がわずか数マイクロメートルに制限されているという事実のために人工物です。狭いですZ-範囲は急速に低マトリックス濃度でトレーサーを拡散させるために長い時間間隔で高速拡散のための分析にバイアスをかけます。ミクロゲル濃度が増加すると、我々は（異常パラメータの最小値がはるかに顕著になっていることを見つけると、通常の拡散への移行
）後に表示されます。これは、それらのガラス遷移領域に近づくと密ミクロゲルシステムに対して現れるケージ効果の明確な指標です。
図1： バッチの最初の染料濃度と折り畳まれた状態での単一粒子体積二つの異なる初期NIPAMの濃度を使用した、57.5ミリモルDM -3（黒丸）および28.8ミリモルのDM -3（灰色の長方形）。架橋剤の1モル％を使用しました。初期KPSの濃度は、全てのバットで同じでした1.56ミリモルのDMでCHES -3。エラーバーは標準偏差を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：4 最小のボリュームミクロゲルバッチ用の散乱ベクトルの大きさの二乗で減衰率の線形依存性。 
Q 2およびゼロ切片に狭い粒度分布を示し、平均拡散係数の明確に定義された推定値は線形フィットの傾きから算出することができることを示しています。 NIPAM濃度は57.5ミリモルのDM -3（赤四角とオレンジの逆三角形）および28.8ミリモルDM -3（シンボルの残りの部分）でした。染料濃度は0.044ミリモルさdでしたメートル-3（赤四角）、0.022ミリモルのDM -3（オレンジ逆三角形）、0.088ミリモルのDM -3（緑の三角形）、0.066ミリモルのDM -3（シアン菱形）、0.044ミリモルのDM -3（濃い青の三角形）、そして、0.022ミリモルのDM -3（ピンク丸）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：2の最大のボリュームバッチの散乱ベクトルの大きさの二乗で減衰率の中央のq範囲内のq 2とΓ2の非線形挙動が異なるサイズの分画によって信号の強度重みの変化によって引き起こされますフォームファクタの最小値の近傍です。両方のバッチでNIPAM濃度は57.5ミリモルdmのでした-3、染料濃度が0.088ミリモルのDM -3（黒丸）と0.066ミリモルのDM -3（赤三角）でした。色あせたシンボルは線形フィットから除外した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 標識トレーサーと非標識マトリックス粒子のフォームファクタの両方が、フォームファクタは、2つの波長、642 nmの（水色と赤のデータポイント）と404 nmの（緑とダークブルーのデータポイント）で測定した粒子のため。実線は642 nmのグローバルフィットと404 nmのデータセットです。破線は、（オレンジと緑はそれぞれ、破線。）行列とトレーサー粒子として旋回同じ半径を有するハード球基準粒子のフォームファクタを示すインセットは、正規化された粒子を示します、計算された表面へのコアから密度分布例えば 、FitIt！ この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： 蛍光標識されたミクロゲル粒子の励起および発光スペクトルは、ブルーラインは、励起と赤線発光スペクトルを示しています。固体の縦線は、励起波長です。斜線部分は、蛍光収集波長範囲を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6： 平均平方DISPトレーサー粒子のためのラグタイムとlacement。ラベルのない行列ミクロゲル濃度が/ 22.05 mg / mlで、28.28 mg / mlで、28.67 mg / mlで、30.32 mg / mlで、31.13 mg / mlとし、35.35 mgの、15.56 mg / mlで（左）でしたミリリットル。点およびエラーバーは、それぞれ、実験値と標準偏差を示します。実線は、データポイントの線形フィットです。挿入図は、35.35 mg / mlでマトリックス濃度のトレーサーミクロゲルの広視野蛍光顕微鏡写真を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7は： 対数スケールにおけるトレーサー粒子のためのラグタイムの正方形の変位平均非標識行列ミクロゲル濃度は（左）15.56 mg / mlであったが、22.05 mg / mlで、28.28 mg / mlで、28.67 mg / mlで、30.32 mg / mlで、 31.13 mg / mlとし、35.3 5 mg / mlで。点およびエラーバーは、それぞれ、実験値と標準偏差を示します。実線はデータ点に多項式フィットしている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8： 異常トレーサー粒子のためのラグタイムを持つパラメータラベルのない行列ミクロゲル濃度は15.56 mg / mlで（左）であった22.05 mg / mlで、28.28 mg / mlで、28.67 mg / mlで、30.32 mg / mlで、31.13 mg / mlとし、 35.35 mg / mlで。ポイントは有限差分と実線で推定デリバティブ図7の多項式フィットから解析的に計算デリバティブを表す。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図9：35.35 mg / mlとマトリックス濃度の分散液中の12トレーサーミクロゲルのためのパーティクルトラックトレーサーの粒子は、それらの非標識の隣人によって形成された一過性のケージにトラップされることから、独特のブロブ結果にトラックのクラスタリング。。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。
図10： 濃縮された非標識行列ミクロゲル分散液中のトレーサーミクロゲル拡散の模式図赤軌道は、隣接する粒子によって形成された過渡ケージ内のトレーサーの迅速な拡散を（青の破線）です。ブルー軌道は長いラグTIを示し、私拡散は過渡ケージの集合的再配置で有効になっています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図11： 非標識マトリックスミクロゲル濃度が長いラグタイム拡散係数が低いマトリックス濃度でトレーサーミクロゲルの拡散がマトリックス粒子の影響を受けません。拡散はトレーサーが閉じ込められている過渡ケージの集団的再配置を必要とするため、長時間の拡散が桁違いを遅く行列ミクロゲルの濃度が増加すると。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
官能性コモノマーの少量の添加は、PNIPAMミクロゲル由来の粒子サイズおよび構造に大きな影響を持つことができます。同時小規模試験管重合は、このような変化を考慮するための良い方法であり、急速に必要に応じて反応をアップスケーリングするための目標粒径のための右の反応組成物を見つけるのに役立ちます。粒子の質量は、およそ例えばKPSなどの熱開始剤を分解し、重合温度に指数関数的に依存して20を使用しているので一つは、良好な再現性のために、反応器の内部に安定した正確な温度制御を確立する必要があります。一つは、このようなEVする反応混合物の、あまりにも暴力的な攪拌などのバッチ合成に関連する摂動を、最小限に抑える場合は従来のバッチ反応と非撹拌した反応からの最終粒子体積は、一般的によく一致していますアンアウト大きな反応器内の温度勾配、または開始期間中に反応温度が変化するように、開始剤溶液の過剰量を使用して。
動的光散乱は、in situで多数の粒子の拡散挙動を決定するために、十分に確立され、高速な方法です。複数の散乱角度でのデータを取得することが不可欠です。任意の一つの角度でDLS測定は、フォームファクタの最小値または広いサイズ分布の場合に一致する、かなりのサンプルの平均拡散係数は異なる見かけの拡散係数につながります。このような場合は、Q 2プロット対Γ2における非線形挙動から認識することができます。広いまたはマルチモーダルの粒子サイズ分布を解決するために、一つは、CONTIN 34として逆ラプラス変換アルゴリズムを使用することを試みることができます。 DLSは、しかし、理想的に起因悪条件NATに、この目的のためには適していません反転問題のURE。
サンプルを散乱、動的および静的の両方の光のために十分に日常的なデータ分析を無効化する多重散乱を避けるために希釈されなければなりません。 SLSによるフォームファクタ決意するために、粒子と溶媒の屈折率の差は、単純なフォームファクタの解析を妨げるミー散乱を避けるために低くなければなりません。この条件は、ときに満たされます
ここで、 
平均粒子半径であり、そして
溶媒及び粒子の屈折率の差。溶剤で広範囲に膨張したミクロゲルの場合、この基準は満たされているが、一般的には粒子が十分に高い屈折率溶媒と一致したコントラストでなければなりません。ミー散乱は、Tの汚れから認識することができます彼は、係数最小値、屈折率差が減少すると減少する効果を形成します。
光散乱法は、広視野粒子追跡は、実空間内の単一の粒子の拡散挙動を調査するために使用することができるのに対し、アンサンブルは、情報を平均提供します。光散乱に基づく粒子追跡とは対照的に、蛍光の高感度は、小さな粒子と、極端な場合には、単一分子の追跡を可能にします。さらに、標識および非標識粒子の割合は、高濃度溶液でも正確に測定するように構成することができます。粒子追跡は、したがって、1つでも粒子の挙動との間の比較を可能にする、その場でコロイドの拡散係数と拡散モードを決定するためのモデル無料の方法を提供します。単一トレーサーの測位精度は、典型的には、回折限界よりも良好であるが、蛍光SIの信号対雑音比に依存します広視野セットアップ上の単一粒子のgnal。このように、高い量子収率、良好な光安定性と密接な励起波長に吸収極大を示す色素で標識化は、良好な結果を得るための前提条件です。トレーサー濃度は、追跡アルゴリズムを乱す異なる粒子の軌道の交差を最小にするために低く維持されなければなりません。濃縮分散液は、蛍光トレーサーの濃度は、標識および非標識粒子を混合することによって調整することができます。点広がり関数工学の最近の研究は、空間の異なる方向に異方性拡散を調査するために使用することができる35,36を追跡3次元粒子を、可能にします。
要約すると、正確なDLSの特性評価および小規模試験管重合はミクロゲル最終粒子体積の高精度なチューニングのための堅牢なフレームワークを提供します。光散乱及び蛍光粒子追跡法は、集合上の相補的な情報を提供し広い分散濃度範囲にわたって単一粒子拡散挙動。異なる濃度の溶液でそれらを追跡する可能性が明確に定義されたソフト粒子の合成の組み合わせは、ソフトパーティクルシステムのダイナミクスの調査とよく研究ハードコロイドシステムとの比較のために非常に重要になります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR Chemicals | KRAF13455 | |
| Bisacrylamid | AppliChem | A3636 | |
| n-Hexane | Merck | 104374 | |
| N-Isopropylacrylamide | Fisher Scientific | AC412785000 | recrystallized from n-hexane |
| Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences | 23591 | |
| Potassium peroxodisulfate | Merck | 105091 | |
| Silicone oil 47 V 350 | VWR Chemicals | 83851 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| F12 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9116612 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| XY(Z) Piezo System | Physik Instrumente | P-545.3R7 | |
| 100X Oil immersion objective | Olympus | UPLSAPO | |
| QuadLine Beamsplitter | AHF Analysentechnik | F68-556T | |
| Cobolt Jive 150 laser | Cobolt | 0561-04-01-0150-300 | |
| Multimode Fiber | Thorlabs | UM22-600 | |
| iXON Ultra 897 EMCCD camera | Andor | DU-897U-CS0-BV | |
| Laser goniometer | SLS Systemtechnik | Mark III | |
| CF40 Cryo-compact circulator | Julabo | 9400340 | |
| Laser goniometer system | ALV GmbH | ALV / CGS-8F | |
| Multi-tau corretator | ALV GmbH | ALV-7004 | |
| Light scattering electronics | ALV GmbH | ALV / LSE 5004 | |
| Photon counting module | PerkinElmer | SPCM-CD2969 | 2 units in pseudo cross-correlation mode |
| 633 nm HeNe Laser | JDS Uniphase | 1145P | |
| F32 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9312632 |
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