Summary
Ikke-omrørt utfellingspolymerisering tilveiebringer en rask, reproduserbar prototyping tilnærming til syntese av stimuli-sensitive poly (N -isopropylacrylamide) mikrogeler av snever størrelsesfordeling. I denne protokollen syntese, er lysspredning karakterisering og enkelt partikkel fluorescens sporing av disse mikrogeler i et bredt felt mikroskopi oppsett demonstrert.
Abstract
Stimuli-sensitive poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) mikrogeler ha ulike potensielle praktiske anvendelser og bruker i grunnleggende forskning. I dette arbeidet bruker vi enkelt partikkel sporing av fluorescensmerkede PNIPAM mikrogeler som et utstillingsvindu for tuning mikrogelstørrelse av en rask ikke-rørt utfellingspolymerisering prosedyre. Denne tilnærmingen er godt egnet for prototyping nye reaksjons komposisjoner og betingelser eller for applikasjoner som ikke krever store mengder produkt. Mikrogel syntese, partikkelstørrelse og strukturbestemmelse av dynamisk og statisk lysspredning er beskrevet i protokollen. Det er vist at tilsetningen av funksjonelle komonomerer kan ha en stor innvirkning på partikkel nukleasjon og struktur. Enkelt partikkel sporing av bred-felt fluorescensmikroskopi muliggjør en undersøkelse av diffusjonen av merket tracer mikrogeler i en konsentrert matrise av ikke-merkede mikrogeler, ikke et system lett undersøkt ved åandre metoder som dynamisk lysspredning.
Introduction
Stimuli-sensitive poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) mikrogeler 1,2 har tiltrukket seg kontinuerlig interesse i løpet av de siste to tiårene på grunn av sitt potensial i ulike smarte programmer. Demonstrert bruk tilfeller inkluderer valgbar emulsjonsstabilisatorer 3-8, mikrolinser 9, cellekultur underlag for enkel celle høsting 10,11, og smarte bærere for lavmolekylære forbindelser og andre biomedisinske anvendelser 12. Fra en grunnleggende forskning synspunkt disse partiklene har vist seg å være nyttig for å undersøke fag som kolloidale interaksjoner 13-15 og polymer-løsemiddel interaksjoner 16-18.
Vellykket bruk av PNIPAM mikrogeler og deres derivater i en hvilken som helst gitt anvendelse vanligvis krever kunnskap om den midlere partikkelstørrelse og bredden på partikkelstørrelsesfordelingen. For den riktige tolkningen av de eksperimentelle resultatene som involverer PNIPAM microgeler, har partikkelstruktur, noe som kan bli påvirket av funksjonelle komonomerer, for å være kjent. Dynamisk og statisk lysspredning (DLS og SLS, henholdsvis) er unikt egnet for å innhente denne informasjonen fordi disse metodene er rask og forholdsvis enkel å bruke; og de sondere partikkelegenskaper non-invasiv i sitt opprinnelige miljø (spredning). DLS og SLS samler også data fra stort antall partikler unngå skjevhet som oppstår fra små utvalgsstørrelser, typisk for mikroskopi metoder. Derfor er første Målet med dette arbeidet er å introdusere god praksis når det gjelder lysspredning for utøvere nye til kolloidalt karakterisering.
Typisk utfelling polymerisasjonen utført i laboratorieskala og å finne de riktige reaksjonsbetingelser for spesifikke partikkelegenskaper kan være arbeidskrevende og krever mange repetisjoner av syntesen. I motsetning til store satssyntese, ikke-omrørt utfellingspolymerisering 19,20 er arAPID prosedyre som satser av forskjellig sammensetning reaktant kan polymeriseres samtidig ettergivende partikler av snever størrelsesfordeling. Simultan polymerisering minimerer eksperimentell variasjon og stor produksjon innebærer at riktige reaksjonsbetingelser kan bli funnet raskt for oppskalering reaksjonen. Derfor er vårt andre mål å demonstrere nytten av ikke-omrørt utfellingspolymerisering i prototyping og i anvendelser som ikke krever en stor mengde av produktet.
Forskjellige aspekter ved syntese og karakterisering kommer sammen i det eksempel på anvendelse av fluorescensmerkede PNIPAM mikrogeler i kolloidal interaksjon forskning. Her bruker vi svært nøyaktig enkelt partikkel sporing for å undersøke spredningen av merket tracer mikrogeler i spredning av umerkede matrise mikrogeler over et bredt matrise konsentrasjonsområde og løse buret effekt i konsentrert kolloiddispergeringen. Wide-field fluorescens mikroskopi er godt egnet for dette formål som det kan karakterisere den spesifikke oppførselen til et par sporstoffmolekyler blant et stort antall potensielt forskjellige matrise arter. Dette er i motsetning til teknikker som DLS, SLS og reologi, som måler ensemblet gjennomsnittlige egenskaper av systemer og kan derfor ikke løse problemet på lite antall av sonde partikler i et stort system. Videre er det i dette spesielle eksempelet konvensjonell lysspredning fremgangsmåter kan ikke benyttes også på grunn av høy partikkelkonsentrasjon, noe som fører til sterk multippel spredning ugyldiggjør en standard analyse. Bruk av automatisert databehandling og statistiske metoder muliggjøre analyse av totale systemet oppførsel også for enkelt partikkel sporing, når midlet over store utvalgsstørrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikrogel Synthesis
MERK: N -isopropylacrylamide (NIPAM) ble krystallisert fra n-heksan. Andre reagenser ble benyttet som mottatt.
- Konvensjonell Batch Syntese av Poly (NIPAM) Matrix mikrogeler
- Oppløs 1,8 g NIPAM og 24 mg N, N '-bisacrylamide (BIS) i 245 ml filtrert (0,2 pm regenerert cellulose (RC) membranfilter) dobbelt destillert vann i en 500 ml tre-halset rundbunnet kolbe utstyrt med en tilbakeløpskjøler, en rører og et gummiseptum.
- Sett et termometer og en 120 mm nål for nitrogen innspill gjennom septum.
- Oppvarm løsningen til 60 ° C under omrøring. Oksygen fra oppløsningen ved spyling med nitrogen i 40 min.
- Samtidig fremstille en initiator oppløsning av 155 mg kalium-persulfat (KPS) i 5 ml filtrert dobbeltdestillert vann og boble oppløsningen med nitrogen for å fjerne oksygen.
- Overfører hele 5 ml KPS solution i en nitrogenvasket sprøyte utstyrt med en 120 mm nål.
- Løft nitrogen nålen over løsningsnivået i den tre-halset kolbe og tilsett KPS oppløsningen hurtig gjennom gummiskillevegg i reaktoren.
- La polymerisasjonen fortsette i 1 time under nitrogenstrøm og under langsom omrøring ved 60 ° C.
- Bruke en Buchner-trakt og filterpapir for å filtrere den varme reaksjonsløsningen for å forkaste store aggregater. La spredning å kjøle seg ned.
- Sentrifuger og redispergere dispersjonen tre ganger i 40 minutter ved 257 000 x g, og til slutt redispergere det sediment i et minimum levedyktig mengde av dobbeltdestillert vann. Dette er vanligvis 2-4 ml.
- Lyofilisere spredning for lagring.
- Ikke rørt Syntese av fluorescensmerkede Poly (NIPAM) mikrogeler
- Veie 257,7 mg NIPAM, 3,5 mg BIS, og 1,5 mg methacryloxyethyl tiokarbamoyl rhodamine B (fargestoff) i glassbeholder og tilsett 10 ml filtrert dobbel distilled vann.
- Ultrasonicate fargestoff-monomer-løsningen i 15 minutter for å oppløse fargestoffet i vann.
- Fremstille den samme oppløsning uten fargestoff i en separat glassbeholder.
- Fremstille forskjellige fortynninger av monomer løsningen med fargestoffet ved hjelp av monomer-løsning uten fargestoff for å oppnå en konsentrasjon serie med forskjellige fargestoffkonsentrasjoner. I dette arbeidet bruk fargestoff i konsentrasjonsområdet fra 0,02 til 0,1 mmol / L.
- Oppløs 8,4 mg KPS i 10 ml filtrert dobbeltdestillert vann for å få den initiator-løsning.
- Overfør 0,5 ml av konsentrasjonsrekke og 0,5 ml av KPS løsning for å teste rør med 10 mm diameter for å oppnå den endelige reaksjonsløsninger, og forsegle dem med gummi-septa.
- Forvarme et oljebad i en dobbeltvegget glassbeholder forbundet med en sirkulator oppvarming til 63 ° C.
- Deoxygenize reaksjons løsninger ved spyling med nitrogen gjennom 120 mm nåler i 20 min.
- Sett rørene inn afloating plattformen og senk plattformen inn i forvarmet oljebad. Sett temperaturen på 60 ° C. Utgangspunktet høyere temperatur i badekaret er nødvendig som romtemperaturen løsninger kjøle ned badekaret. For høy presisjon partikkelstørrelse tuning har temperaturkontroll under den første reaksjonen til å være streng, ± vanligvis 0,1 ° C.
- La reaksjonen forløpe i en passende tid. Vanligvis en time er nok.
- Overfør reaksjonsrørene raskt til en ovn ved 60 ° C og sette en dråpe av den varme dispersjonen til 10 ml filtrert dobbeltdestillert vann forvarmes i løpet PNIPAM volum faseovergangstemperatur (VPTT, 32 -34 ° C) 1, for DLS karakterisering i sammenlagt tilstand.
- La resten av dispersjonen avkjøles til romtemperatur, og overføre dem til sentrifugerør.
- Sentrifuger oppløsningen tre ganger i 40 minutter ved 257 000 x g og fortynne mikrogelene til slutt i 2 ml filtrert dobbeltdestillert vann for anvendelse som tracer partikler.
2. lysspredning Karakterisering
- Hydrodynamisk Radius Bestemmelse i sammenlagt tilstand av dynamisk lysspredning
- Vask kyvetter og glass med aceton damp.
- Heat 10 ml filtrert (f.eks 200 nm eller mindre RC filter) dobbelt destillert vann over PNIPAM VPTT.
- Overføre en dråpe av varm dispersjon til det filtrerte vannet ved anvendelse av en forvarmet nål (0,9 x 40 mm) og sprøyte (1 ml).
- Temperere DLS goniometer indeksen kamp bad til 50 ° C og overføre prøven til instrumentet uten å la det avkjøles.
- Finn den største spredningsvinkelen der spredt intensitet er tilstrekkelig til å skaffe seg en korrelasjons ved å utføre kontrollmålinger.
- Sett prøvekuvetten (10 mm diameter glassrør med 1 ml av partikkel-dispersjon). Flytt detektoren armen til liten spredningsvinkelen (her 30 °).
- Sjekk bjelken profilen for flere spredning: ingen glød rundt den primære strålen, ingen flere spredning, etc. Sjekk at opptellingen serien er egnet for måling på det laveste spredningsvinkelen (ca mellom 30 og 600 kHz, øverst i høyre hjørne av programvaren vinduet..)
- Flytt goniometer armen til høyest spredningsvinkelen (velg 120 ° her). Kontroller at telleraten er fremdeles høy nok for måling (mellom 30 og 600 kHz). Dersom intensiteten er for lav, beveger armen for å redusere spredningsvinkel.
- Sjekk strålen visuelt gjennom toluen bad glass på det laveste spredningsvinkelen, hvis glød rundt den innfallende strålen er observert flere spredning foregår. I dette tilfelle redusere laserintensiteten eller bruke en høyere fortynning.
- Erverve 20 correlograms mellom minimum og maksimum spredningsvinkelen (f.eks 30 ° - 140 °) med minimum oppkjøp tid på 60 sek. Øk oppkjøpet tid for svak intensitet store spredningsvinklerhvis nødvendig.
- Data Analysis 37
- Beregn spredning vektorstørrelser for spredningsvinkelen ifølge
, Hvor n er brytningsindeksen for dispersjonen, 
bølgelengden til laseren i vakuum og 
spredningsvinkelen. - I det tilfelle målingen programvare gir intensiteten korrelasjonsfunksjonen
, Forvandle den til elektrisk felt korrelasjonsfunksjonen 
i følge 
. Parameter 
er en uinteressant instrumental parameter relatert til graden av romlige sammenhengen i spredt lys over detektoren området. - Utføre cumulant analyse på correlograms, dvs. passe andre ordens polynom med logaritmen av hvert elektrisk felt korrelasjonsfunksjonen
ved lineær minste kvadraters metode. fremkommer som skjæringspunktet på den passform og dens nøyaktige verdi er uten betydning i forhold til dataanalyse. Begrense den passer til en meningsfylt forsinkelsestid τ verdi, f.eks, slik at korrelasjonen amplitude er 10 - 20% av den maksimale amplitude. Koeffisienten til den første orden sikt er den midlere reduksjonshastigheten av korrelasjonsfunksjonen, 
. - Finne den mest sannsynlige verdi for den midlere diffusjonskoeffisienten
av partiklene av lineære minste kvadraters metode på 
. Hvis imot 
vises ikke lineær og gå gjennom origo innenfor feilen, er partikkelstørrelsesfordelingen bred og hydrodynamiske radius vil være dårlig definert. - Beregn middelverdien hydrodynamiske radius fra Stokes-Einstein relasjon
, hvor 
er Boltzmann koeffisienten, 
den absolutte temperatur og 
viskositeten av dispersjonen ved . Forplante standardavviket til 
. - Partikkel Struktur Bestemmelse av statisk lysspredning
- Vask kyvetter og glass med aceton damp. Bruk 20 mm diameter eller større kyvetter for å minimere den sylindriske linse virkning.
- Filter (200 nm RC-filter eller mindre) omtrent 20 ml dobbeltdestillert vann til et hetteglass og overføre en dråpe renset dispersjon til ampullen. Vask filteret med 10 ml vann før du bruker den for prøveopparbeidelse for å fjerne urenheter igjen fra produksjonsprosessen.
- Sjekk prøven mot en hvilken som helst omgivende lyskilde. Hvis blå nyanse er observert, er prøven trolig bli for konsentrert. Spe deretter.
- Forbered bakgrunn vannprøve ved spyling kuvetten flere ganger med filtrert vann og deretter fylle opp til passende prøvevolumet, avhengig av kyvetten og laseren posisjon i instrumentet. Laseren må passere gjennom prøven uten å bli brutt fra menisken.
- Kalibrer Instrument anvendelse av en toluen prøve.
- Mål vann spredning (bakgrunnen) i hele den tilgjengelige vinkelområde.
- Mål spredning intensitet fra prøven i hele det tilgjengelige vinkelområde fortrinnsvis ved flere bølgelengder. Spredningsmønsteret normalisert til den fremre spredningsintensitet er kjent som formfaktoren.
- Hvis partikkelstruktur er kjent, bruke riktig modell uttrykk for å beregne global plass på datasettene målt på ulike bølgelengder.
- For ukjent partikkel strukturen bruk ordnet direkte (for eksempel FitIt! 33) eller en mer generell indirekte inverse Fourier transform 21,22 rutine i forbindelse med deconvolution av paret avstand fordelingsfunksjonen (kun for sfæriske partikler) 23,24 for omtrentlig klassifisering av partikkel type.
- I tilfelle armaturen eller inversjon rutine gir et estimat av partikkelradius fordelingsfunksjon, å beregne polydispersitetenindeks (standardavvik av fordelingen dividert med dens middelverdi).
3. Particle Tracking av Wide-field Fluorescensmikroskopi
NOTE: Tracer og matrisepartikler 465 ± 7 nm og 405 ± 7 nm hydrodynamisk radius ved 20 ° C, respektivt, ble anvendt for partikkel sporing.
- Prøvepreparering
- Forbered konsentrert matrise mikrogelstørrelse spredning av redispergering kjent mengde lyofilisert umerket mikrogel til kjent beløp dobbelt destillert vann. Legge til et lite volum av merket tracer partikler.
- Bekrefte den riktige sporstoff mikrogelen konsentrasjon i mikroskopet. Den optimale konsentrasjonen er et kompromiss mellom samtidige kjøp av maksimalt antall spor, samtidig som de har spor konsentrasjonen lav nok til at sannsynligheten for at tracer partikkelspor krysser under oppkjøpet er ubetydelig.
- Forbered konsentrerte dispersjoner av fordampervann i en ovn. Bestemme vektkonsentrasjon ved sammenligning av vekten av dispersjonen til den opprinnelige vekten av prøven før fordampning.
- Datainnsamling og analyse
- Bruk en egnet objektiv på ønsket forstørrelse og blenderåpning for eksitasjon av sporstoffer og samtidig fluorescens samling fra prøven. I dette arbeidet, bruk en 100X / 1.3 NA olje nedsenking objektiv.
- Plasser fuktighetskammeret på en xyz-piezo bord, som passer inn i en kommersiell mikroskop.
- For å hindre at prøven fra tørking, plasserer en plasma renset dekkglass inn fuktigheten kammer og pipette 10 mL av poly (NIPAM) spredning av ønsket konsentrasjon på slip.
- Avhengig av eksitasjon og emisjonsspektra av den fluorescerende fargestoff, brukes en egnet laser for magnetisering og justere lasereffekten på riktig måte. Intensiteten skal være tilstrekkelig lav til å unngå hurtig fotobleking av fargestoffer, men vedSamtidig sterk nok for nøyaktig posisjonering enkelt partikkel (se nedenfor). I dette arbeidet, bruker en 561 nm diode-pumpet solid-state laser og holde laser makt konstant på 16 mW (ca. 0,5 kW cm -2 på prøve) for alle målingene.
- For å oppnå homogen prøve belysning, bruk kritisk belysning oppsett beskrevet her. For dette paret laseren i en multimode fiber (NA 0,22 ± 0,02, 0,6 mm kjernediameter), riste fiber ved hjelp av en vortexer for å timelig gjennomsnittlig ut laser flekker, og projisere fiber ender i prøveplanet.
- Kalibrer z avstand fra baksiden refleksjon av dekkglass og fokus flere mikrometer inn i prøven ved å bevege objektivet litt opp og feste den z-posisjon ved hjelp av en z-kompensator. Dette unngår eventuelle grensesnitt effekter med dekkglass.
- Juster detektor parametere, slik som eksponeringstiden, til styrken av det fluorescens-signalet. I dette tilfellet bruker en EMCCD kameramed eksponeringstiden på 0,1 sek, elektron multiplisere modus og gevinst på 50.
- Skaffe flere filmer med riktig antall rammer for å oppnå tilstrekkelig lag tid å beregne middelkvadrat forskyvning av mikrogelene i ulike regioner i prøven. I dette arbeidet bruker oppkjøpsrammenumrene på 500 eller 1000 bilder.
- Analysere dataene ved å plassere partiklene i hver ramme ved hjelp av Gauss montering 25 og bruke en passende partikkelsporingsalgoritme 26 for å få den middelkvadrat fortrengning. 27 Beregn middelverdier og standardavvik ved midling over alle sporene i alle filmene. Beregn lang oppholdstid Diffusjonskoeffisientene ved lineær regresjon fra
, hvor 
er den midlere kvadrat forskyvning, D middel diffusjonskoeffisienten og ź lag tid. - EstImate anomali parameter γ fra avvik diffusjon ligning
ved å transformere data til logaritmisk skala, hvilket ga 
. Den anomali parameter 
er gitt av den deriverte av tomten. Derivatet kan anslås ved den endelige forskjellene mellom datapunkter, eller montering av datapunkter ved polynomfunksjoner og differensierende analytisk. Bestem tilstrekkelig grad av polynomet tilpasse funksjoner ved å plotte de passer residualene og rest norm for å øke polynom orden. - Gjenta fremgangsmåten for forskjellige konsentrasjoner av mikrogel-matriser.
- Beregn spredning vektorstørrelser for spredningsvinkelen ifølge
, Hvor n er brytningsindeksen for dispersjonen, 
bølgelengden til laseren i vakuum og 
spredningsvinkelen. 
, Forvandle den til elektrisk felt korrelasjonsfunksjonen 
i følge 
. Parameter 
er en uinteressant instrumental parameter relatert til graden av romlige sammenhengen i spredt lys over detektoren området. 
ved lineær minste kvadraters metode. 
. 
av partiklene av lineære minste kvadraters metode på 
. Hvis
vises ikke lineær og gå gjennom origo innenfor feilen, er partikkelstørrelsesfordelingen bred og hydrodynamiske radius vil være dårlig definert. 
, hvor 
er Boltzmann koeffisienten, 
den absolutte temperatur og 
viskositeten av dispersjonen ved 
. 
, hvor 
er den midlere kvadrat forskyvning, D middel diffusjonskoeffisienten og ź lag tid. 
ved å transformere data til logaritmisk skala, hvilket ga 
. Den anomali parameter 
er gitt av den deriverte av tomten. Derivatet kan anslås ved den endelige forskjellene mellom datapunkter, eller montering av datapunkter ved polynomfunksjoner og differensierende analytisk. Bestem tilstrekkelig grad av polynomet tilpasse funksjoner ved å plotte de passer residualene og rest norm for å øke polynom orden. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Antallet PNIPAM mikrogel-partikler i batch, og dermed den endelige partikkelvolum, bestemmes tidlig i reaksjonen i løpet av kjernedannelsesfasen 20 hydrofobe komonomer fargestoff methacryloxyethyl tiokarbamoyl rhodamin B påvirker kjernedannelsen ved å redusere partikkelantallstettheten i batchen. Reduksjonen i partikkelkonsentrasjon for to forskjellige initiale NIPAM konsentrasjoner kan sees som økning i gjennomsnittlig endelig partikkelvolum i sammenlagt tilstand med økende fargestoff konsentrasjon, er vist i figur 1. Volumøkningen kan tilskrives den hydrofobe komonomer fargestoff, hvilken fremmer mikrogel kjerner aggregering på tidlige reaksjonstider, redusere partikkelkonsentrasjonen og øker den endelige partikkelvolum.
Resultater fra en vellykket DLS measurements er vist i figur 2. For de seks minste endelige partikkelvolum partier lineær avhengighet av den midlere reduksjonshastigheten Γ 2 på q 2 og null y-aksen innenfor den feil indikerer at partikkelstørrelsesfordelingen for disse grupper er forholdsvis smal og et godt -defined estimat for den midlere diffusjonskoeffisient kan fås fra helningen av det lineære form. Figur 3 viser et mer komplisert resultat fra de to største volum partier, hvor Γ 2 avviker fra den lineære oppførsel i den mellomliggende q rekkevidde. Den ikke-lineariteten stammer fra formfaktoren (vinkelspredningsmønster) minimum som faller sammen med disse q-verdier. 28 Fenomenet angjeldende kan observeres for partikler med dimensjoner som er sammenlignbare med bølgelengden for den innfallende laserstråling, og selv en moderat partikkelstørrelsesfordeling bredde. Fastsettelse av diffusjonskoeffisienten i denne q figur 3, Γ 2 gjenspeiler middelverdien oppførsel igjen ved høy q, der alle partikkelstørrelsesfraksjoner bidra mer jevnt til den totale spredte intensitet. En enkel måte å få et rimelig anslag for gjennomsnittlig diffusjonskoeffisienten er å utelukke de mellomliggende Γ 2 verdier fra lineær tilpasning. Hvis formfaktor av partiklene er kjent, kan en mer utførlig passende metode brukes 28.
Bestemmelse av den hydrodynamiske volum i sammenlagt tilstand uten å la prøvene avkjøles under PNIPAM VPTT sikrer at det ikke-gelede sol fraksjon ikke har løsrevet fra partiklene. Derfor volumet i den sammenfoldede tilstand reflekterer massen og antallet av partiklene under polymeriseringen, noe som er viktig hvis Fundamental egenskapene til utfellingspolymerisering blir undersøkt 20. Volum i sammenlagt tilstand også gir en god mengde for å sammenligne forskjellige reaksjonsparametere, fordi det er uavhengig av svelleegenskapene og den fraksjon av ikke-gelert polymer i partiklene regulert av mengden av tverrbindingsmiddel i monomerblandingen. Mindre størrelse og høyere spredning kontrast i skjult tilstand også legge til rette for DLS karakterisering.
Statisk lysspredning data målt ved to bølgelengder på 642 nm og 404 nm for matrisen og sporstoffpartikler er vist i figur 4 Visuell inspeksjon av vinkelspredningsmønstre viser at partiklene er godt definert. Flere fremstående oscillasjoner typiske for kuleformede partikler i hele q angir smale polydispersitet, i dette tilfelle 7% og 6% for tracer og matrise-mikrogeler, respektivt. glatt behavior ved lav q indikerer at prøvene er tilstrekkelig fortynnet, og ingen vesentlig partikkelaggregatet er til stede. Økningen i spredte intensitet ved ekstrem q kan tilbakeføres til spredning på grunn av den reflekterte strålen tilbake fra innerveggen kyvetten. Inversjon av formfaktorer av matrise partikler bekrefte typisk mikrogelstørrelse struktur 29 med tett kjerne og radielt råtnende tetthetsprofil som følge av kryssbinder kopolymeriseringsprosedyrer kinetikk 30 (se innfelt). Den stiplede linje viser den formfaktoren av referanse vanskelig sfære med det samme midlere treghetsradius som matrisepartiklene. Den eksperimentelle formfaktor henfaller raskere med q enn hard sfære formfaktor, som er typisk for partikler med uklar overflate. I motsetning til dette spor partikler oppviser ukonvensjonell mikrogel struktur. Dette kan også sees fra referanse vanskelig sfære formfaktor, som viser at det eksperimentelle formfaktoren i utgangspunktet ikkeråtner raskere enn referansen. Dette resultatet viser at de omfatter fargestoffmolekyler til mikrogelene kan påvirke deres struktur, som må tas hensyn til i tolkning av resultatene.
Den høye ensartetheten av de syntetiserte partiklene er av stor interesse for studier av deres diffusjon ved volumandeler over glassovergangstemperaturen for å nøyaktig bestemme utviklingen oppførsel i dette regimet 13, og sammenligne det med harde partikler 31. Derfor ble en lav fraksjon av merket mikrogeler blandet med ikke-merket mikrogel av sammenlignbar størrelse. Eksitasjon og emisjonsspektra av mikrogel-inkorporert fargestoffmolekyler sammen med eksitasjonsbølgelengden og filterkonfigurasjon som brukes i emisjonsbanen er vist i figur 5. Absorbans og utslipp av maksima methacryloxyethyl tiokarbamoyl rodamin B er nær eksitasjonsbølgelengden og fluorescens samling rekkevidde,henholdsvis, slik at høy innsamling effektivitet i partikkelsporingen. Tidsutviklingen av middelkvadrat forskyvning til spor mikrogeler i forskjellige ikke-merket mikrogel matrisekonsentrasjoner er vist i figur 6 og figur 7 i lineær og logaritmisk skala, respektivt. Ved lave mikrogel matrix konsentrasjoner tracer partikler spres raskt. Selv om de bare er synlige for et begrenset antall rammer før du går ut av fokus fly, er det mulig med en rimelig god estimering av sine middelkvadrat forskyvninger. Den lineære økningen av middelkvadrat forskyvning med tiden tyder på normal diffusjon oppførsel for alle etterslep ganger målt. Men for mikrogel-konsentrasjoner i nærheten av den kolloidale glassovergangs, dvs. 29-36 mg / ml, blir den tidsmessige utviklingen av middelkvadrat forskyvningene ikke-lineær (se figur 7). Oppførselen ligner på en av kolloidale mikrometer store PMMA partikler som synkenderibed av Weeks og Weitz 31 og som kan knyttes til buret virkning. Som vist skjematisk i figur 10, kan et merket mikrogel i en tett matrise diffundere heller fritt inne i buret. Av den grunn øker den midlere kvadrat forskyvning lineært i de første få millisekunder. Imidlertid, siden partiklene blir fanget i transiente bur dannet av sine naboer, er en kollektiv omleiring av de omkringliggende mikrogelene som er nødvendig for mikrogelene til å bevege seg videre. Dette buret effekt uttrykker seg i et ganske grunt skråning i andre rekke figur 7, og kan også bekreftes ved å undersøke partikkelspor i figur 9. På kort etterslep ganger partiklene jiggle i burene, hvorfra de rømmer bare for å få fanget igjen. Ved lange etterslep ganger, blir den lineære diffusjon oppførsel utvinnes. Cage effekter kan analyseres ved hjelp av unormale diffusjonsmodeller hvor det timelige utviklingen av (todimensjonalt oppdaget) mener Square Displacement uttrykkes ved en kraft lov i tid: 
eller i sin logaritmisk form 
med anomali parameter 
32. For normal spredning, den anomali parameter lik 1, subdiffusion er representert ved verdier under 1. Figur 8 viser tidsmessige utviklingen av anomali parameter direkte bestemmes ut fra skråningen i log-log-plot Figur 7. For de lavere konsentrasjoner av mikrogeler i vår studie, den anomali parameter i utgangspunktet lik 1. for etterslep ganger 
i størrelsesorden flere sekunder, avviker faktoren fra en mot lavere verdier. Denne atferden er en gjenstand på grunn av at den aksiale (z) målestasjon utvalg i bredt felt mikroskopi er begrenset til bare noen få mikrometer. Den smale z-område forspenner analyse for rask diffusjon med lange tidsintervaller for hurtig å spre tracere ved lave konsentrasjoner matrise. Ved å øke konsentrasjonen mikrogel, finner vi at minimum av uregelmessigparameteren blir mye mer uttalt og overgang til normal diffusjon ( 
) Vises senere. Dette er en klar indikasjon på buret effekten vises for tette mikrogeler systemer når det nærmer seg sine glass overgang regime.
Fig. 1: Enkeltpartikkelvolum i kollapset tilstand med initial fargestoff konsentrasjon i batchen To forskjellige initiale konsentrasjoner NIPAM ble anvendt, 57,5 mmol dm -3 (svarte sirkler) og 28,8 mmol dm -3 (grå rektangler). 1 mol-% av tverrbindingsmiddel ble anvendt. Initial KPS konsentrasjonen var den samme i alle balltreches på 1,56 mmol dm -3. Feilfelt betegne standardavviket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Decay sats med kvadratet av spredning vektoren magnitude for de fire minste volum mikrogel batcher Linear avhengighet av. 
på q 2 og null skjæringspunkt indikerer snever partikkelstørrelsesfordeling, og angir at veldefinert estimat av den midlere diffusjonskoeffisienten kan beregnes ut fra helningen av det lineære tilpasning. NIPAM konsentrasjonene var 57,5 mmol dm -3 (røde firkanter og oransje invertert trekanter) og 28,8 mmol dm -3 (resten av symbolene). Dye konsentrasjonene var 0,044 mmol dm -3 (røde firkanter), 0,022 mmol dm -3 (oransje inverterte trekanter), 0,088 mmol dm -3 (grønne trekanter), 0,066 mmol dm -3 (cyan rhombuses), 0,044 mmol dm -3 (mørk blå trekanter), og 0,022 mmol dm -3 (rosa sirkler). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: dempefaktor med kvadratet av spredningsvektorstørrelses for de to største volum partier ikke-lineær oppførsel av Γ 2 med q 2 i den sentrale q serien er forårsaket av endringer i intensiteten vekting av signalet ved forskjellige størrelsesfraksjoner i nærheten av formfaktoren minimum. NIPAM konsentrasjonen i begge grupper var 57,5 mmol dm-3, Fargestoff konsentrasjonene var 0,088 mmol dm -3 (svarte sirkler) og 0,066 mmol dm -3 (røde trekanter). Faded symboler ble ekskludert fra lineær tilpasning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Form faktorer av merket tracer og umerkede matrise partikler For både partikler formfaktoren ble målt ved to bølgelengder, 642 nm (lys blå og rød datapunkter) og 404 nm (grønn og mørk blå datapunkter).. Solid linjer er globale passer til 642 nm og 404 nm datasett. Stiplede linjene viser formfaktorer av harde sfære referanse partikler med samme radius av treghets som matrise og tracer partikler (oransje og grønn stiplede linjer, henholdsvis.) Innfellinger viser normalisert partikkeltetthetsprofiler fra kjernen til overflaten beregnet, f.eks FitIt! Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 5: eksitasjon og emisjonsspektra av fluorescens-merket mikrogel partikler blå linje betegner eksitasjon og røde linje emisjonsspektrum. Solid vertikal linje er eksitasjon bølgelengde. Skraverte området betegner bølgelengdeområdet fluorescens samling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Mean square displacement med lag tid for tracer partikler. Umerket matrix mikrogel konsentrasjonene var 15,56 mg / ml (til venstre), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml og 35,35 mg / ml. Poeng og feilfelt betegne eksperimentelle verdier og standardavvik, henholdsvis. Solid linjer er lineære passer til datapunktene. Inset viser et bredt felt fluorescens mikroskopibilde av tracer mikrogeler på 35,35 mg / ml matrise konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7:. Mean square forskyvning med lag tid for tracer partikler i logaritmisk skala uten merking matrix mikrogel konsentrasjonene var 15,56 mg / ml (til venstre), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml og 35,3 5 mg / ml. Poeng og feilfelt betegne eksperimentelle verdier og standardavvik, henholdsvis. Solid linjer er polynomfunksjoner passer til datapunktene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8:. Anomaly parametere med oppholdstid for tracer partikler uten merking matrix mikrogel konsentrasjonene var 15.56 mg / ml (til venstre), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml og 35,35 mg / ml. Punkter representerer derivater estimert av begrensede forskjeller og heltrukne linjer analytisk beregnede derivater fra polynomet passer i Figur 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9:.. Partikkelspor for 12 tracer mikrogeler i dispergering med 35,35 mg / ml matrise konsentrasjon Clustering av spor til særegne blobs resultater fra tracer er partikler blir fanget i forbi bur dannet av sine umerkede naboer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 10: Skjematisk illustrasjon av tracer mikrogel diffusjon i konsentrert umerket matrise mikrogel dispersjon Red bane betegner rask diffusjon av sporstoff i løpet av de transiente burene (blå stiplet linje) som dannes av de nærliggende partiklene. Blå bane betegner lang lag timeg diffusjon aktivert av den kollektive omorganisering av forbigående bur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 11: lange tidsforsinkelse diffusjonskoeffisienter med umerket matrise mikrogel konsentrasjonen Ved lav konsentrasjon matrise diffusjon av sporstoff mikrogelene ikke påvirkes av matrisepartikler. Med økende matrise mikrogelstørrelse konsentrasjon lang tid diffusjon bremser ned størrelsesordener fordi diffusjon krever kollektiv omorganisering av forbigående bur, hvor markørene er fanget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilsetning av små mengder av funksjonell komonomer kan ha en betydelig effekt på partikkelstørrelse og struktur av de PNIPAM avledet mikrogelene. Samtidig småskala reagensrør polymerisasjon er en god metode for å ta høyde for slike endringer, og bidrar til å raskt finne de riktige reaktant komposisjoner til mål partikkelstørrelse for oppskalering reaksjonen etter behov. Massen av partiklene er tilnærmet eksponensielt avhengig av polymerisasjonstemperaturen ved termisk dekomponering av initiator, slik som KPS, blir brukt 20, og derfor en behov for å etablere stabil og nøyaktig temperaturkontroll inne i reaktoren for god reproduserbarhet. Endelige partikkelvolumer fra konvensjonell satsvis reaksjon og ikke-omrørte reaksjons er vanligvis i god overensstemmelse hvis man minimaliserer satssyntese relaterte forstyrrelser, slik som for voldsom omrøring av reaksjonsblandingen to evno ut temperaturgradienter i den store reaktoren, eller ved hjelp av overdreven mengde av initiator-løsning, slik at reaksjonstemperaturendringer under oppstart perioden.
Dynamisk lysspredning er et veletablert og hurtig metode for å bestemme diffusjon oppførsel av store antall partikler in situ. Det er imidlertid viktig å skaffe data på flere spredningsvinkler. DLS måling ved en vilkårlig vinkel, som sammenfaller med en formfaktor minimum eller i tilfellet med bred størrelsesfordeling, vil føre til en tilsynelatende diffusjonskoeffisient vesentlig forskjellig fra den midlere diffusjonskoeffisienten av prøven. Slike saker kan gjenkjennes fra ikke-lineær oppførsel i Γ 2 vs. q to plot. For å løse brede eller multimodale partikkelstørrelsesfordelingen, kan man forsøke å bruke en invers Laplace transformasjon algoritme som CONTIN 34. DLS er imidlertid ikke ideelt egnet til dette formålet på grunn av dårlig kondisjonerte nature av inversjon problem.
For både dynamisk og statisk lysspredning prøvene må være tilstrekkelig fortynnet for å unngå flere spredning, som underkjenner rutinen dataanalyse. For formfaktor bestemmelse av SLS også brytningsindeksforskjellen av partiklene og løsningsmidlet må være lav for å unngå Mie-spredning, som hindrer grei formfaktor analyse. Dette vilkåret er oppfylt når 
, hvor 
er den midlere partikkelradius og 
forskjellen mellom brytningsindeksene for oppløsningsmiddel og partikler. For mikrogeler omfattende svellede med oppløsningsmiddel dette kriteriet er oppfylt, men generelt at partiklene må være kontrast matchet med tilstrekkelig høy brytningsindeks oppløsningsmiddel. Mie-teorien kan gjenkjennes fra smøre av than formfaktor minima, en effekt som avtar når brytningsindeks forskjellen minker.
Lysspredning metodene gir ensemble gjennomsnitt informasjon, mens vidvinkel partikkel sporing kan brukes til å undersøke spredningen oppførselen til enkeltpartikler i reell plass. I motsetning til partikkelsporings basert på lysspredning, den høye følsomheten av fluorescens tillater sporing av små partikler og, i ekstreme tilfeller, til og med enkle molekyler. I tillegg kan forholdet mellom merkede og ikke-merkede partikler være innrettet til å måle nøyaktig også i svært konsentrerte løsninger. Partikkel sporing gir derfor en modell gratis måte å bestemme diffusjonskoeffisienten og diffusjon modus av kolloider i situ selv åpner for en sammenligning mellom atferd av enkeltpartikler. Lokalisering nøyaktighet av enkeltsporstoff er typisk bedre enn diffraksjonsgrensen men er avhengig av signal-til-støy-forholdet av fluorescensen signal av enkeltpartikler på vidvinkel oppsett. Således merking med fargestoffer som oppviser et høyt kvanteutbytte, god fotostabilitet og et absorpsjonsmaksimum i nærheten av eksitasjonsbølgelengden er en forutsetning for et godt resultat. Tracer-konsentrasjonen må holdes lav for å minimere kryssing av baner av ulike partikler urovekkende sporingsalgoritme. For konsentrerte dispersjoner, kan tettheten av fluorescerende tracere justeres ved blanding av merkede og ikke-merkede partikler. Nyere arbeider med punktspredefunksjonen teknikk gjør det mulig for 3D partikkelsporings 35,36, som kan brukes til å undersøke anisotrop diffusjon i forskjellige retninger av plass.
I sammendraget, nøyaktig DLS karakterisering og småskala reagensrør polymerisasjon gir robust rammeverk for høy presisjon tuning mikrogel endelige partikkelvolum. Lysspredning og fluorescens partikkel sporing teknikker gir utfyllende informasjon om ensemblet ogenkelt partikkel diffusjon atferd over lang spredning konsentrasjonsområde. Kombinasjonen av syntesen av veldefinerte myke partikler, med mulighet for å spore dem i oppløsninger av forskjellige konsentrasjoner vil være av vesentlig betydning for undersøkelse av dynamikken i myke partikkelsystemer og en sammenligning med godt studert harde kolloide systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR Chemicals | KRAF13455 | |
| Bisacrylamid | AppliChem | A3636 | |
| n-Hexane | Merck | 104374 | |
| N-Isopropylacrylamide | Fisher Scientific | AC412785000 | recrystallized from n-hexane |
| Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences | 23591 | |
| Potassium peroxodisulfate | Merck | 105091 | |
| Silicone oil 47 V 350 | VWR Chemicals | 83851 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| F12 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9116612 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| XY(Z) Piezo System | Physik Instrumente | P-545.3R7 | |
| 100X Oil immersion objective | Olympus | UPLSAPO | |
| QuadLine Beamsplitter | AHF Analysentechnik | F68-556T | |
| Cobolt Jive 150 laser | Cobolt | 0561-04-01-0150-300 | |
| Multimode Fiber | Thorlabs | UM22-600 | |
| iXON Ultra 897 EMCCD camera | Andor | DU-897U-CS0-BV | |
| Laser goniometer | SLS Systemtechnik | Mark III | |
| CF40 Cryo-compact circulator | Julabo | 9400340 | |
| Laser goniometer system | ALV GmbH | ALV / CGS-8F | |
| Multi-tau corretator | ALV GmbH | ALV-7004 | |
| Light scattering electronics | ALV GmbH | ALV / LSE 5004 | |
| Photon counting module | PerkinElmer | SPCM-CD2969 | 2 units in pseudo cross-correlation mode |
| 633 nm HeNe Laser | JDS Uniphase | 1145P | |
| F32 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9312632 |
References
- Pelton, R.
- Pich, A., Richtering, W. Microgels by Precipitation Polymerization: Synthesis, Characterization and Functionalization. Adv. Polym. Sci. 234, 1-37 (2010).
- Richtering, W. Responsive Emulsions Stabilized by Stimuli-Sensitive Microgels: Emulsions with Special Non-Pickering Properties. Langmuir. 28 (50), 17218-17229 (2012).
- Wiese, S., Spiess, A. C., Richtering, W. Microgel-Stabilized Smart Emulsions for Biocatalysis. Angew. Chem. Int. Edit. 52 (2), 576-579 (2012).
- Schmitt, V., Ravaine, V. Surface compaction versus stretching in Pickering emulsions stabilised by microgels. Curr. Opin. Colloid In. 18 (6), 532-541 (2013).
- Wellert, S., Richter, M., Hellweg, T., von Klitzing,, R,, Hertle, Y. Responsive Microgels at Surfaces and Interfaces. Z. Phys. Chem. 229 (7-8), 1-26 (2015).
- Li, Z., Harbottle, D., Pensini, E., Ngai, T., Richtering, W., Xu, Z. Fundamental Study of Emulsions Stabilized by Soft and Rigid Particles. Langmuir. 31 (23), 6282-6288 (2015).
- Deshmukh, O. S., van den Ende, D., Stuart, M. C., Mugele, F., Duits, M. H. G. Hard and soft colloids at fluid interfaces: Adsorption, interactions, assembly & rheology. Adv. Colloid Interfac. 222, 215-227 (2015).
- Serpe, M. J., Kim, J., Lyon, L. A.
- Schmidt, S., Zeiser, M., Hellweg, T., Duschl, C., Fery, A., Möhwald, H. Adhesion and Mechanical Properties of PNIPAM Microgel Films and Their Potential Use as Switchable Cell Culture Substrates. Adv. Func. Mater. 20 (19), 3235-3243 (2010).
- Xia, Y., He, X., et al. Thermoresponsive Microgel Films for Harvesting Cells and Cell Sheets. Biomacromolecules. 14 (10), 3615-3625 (2013).
- Guan, Y., Zhang, Y. PNIPAM microgels for biomedical applications: from dispersed particles to 3D assemblies. Soft Matter. 7 (14), 6375 (2011).
- Yunker, P. J., Chen, K., Gratale, M. D., Lohr, M. A., Still, T., Yodh, A. G. Physics in ordered and disordered colloidal matter composed of poly(N-isopropylacrylamide) microgel particles. Rep. Prog. Phys. 77 (5), 056601-056629 (2014).
- Lohr, M. A., Still, T., et al. Vibrational and structural signatures of the crossover between dense glassy and sparse gel-like attractive colloidal packings. Phys. Rev. E. 90 (6), 062305 (2014).
- Dreyfus, R., Xu, Y., Still, T., Hough, L. A., Yodh, A. G., Torquato, S. Diagnosing hyperuniformity in two-dimensional, disordered, jammed packings of soft spheres. Phys. Rev. E. 91 (1), 012302-012312 (2015).
- Kojima, H., Tanaka, F. Reentrant volume phase transition of cross-linked poly(N-isopropylacrylamide) gels in mixed solvents of water/methanol. Soft Matter. 8 (10), 3010-3011 (2012).
- Hofmann, C. H., Plamper, F. A., Scherzinger, C., Hietala, S., Richtering, W. Cononsolvency Revisited: Solvent Entrapment by N-Isopropylacrylamide and N, N-Diethylacrylamide Microgels in Different Water/Methanol Mixtures. Macromolecules. 46 (2), 523-532 (2013).
- Bischofberger, I., Calzolari, D. C. E., Trappe, V. Co-nonsolvency of PNiPAM at the transition between solvation mechanisms. Soft Matter. 10 (41), 8288-8295 (2014).
- Virtanen, O. L. J., Richtering, W. Kinetics and particle size control in non-stirred precipitation polymerization of N-isopropylacrylamide. Colloid Polym. Sci. 292 (8), 1743-1756 (2014).
- Virtanen, O. L. J., Ala-Mutka, H. M., Richtering, W. Can the Reaction Mechanism of Radical Solution Polymerization Explain the Microgel Final Particle Volume in Precipitation Polymerization of N-Isopropylacrylamide? Macromol. Chem. Phys. 216 (13), 1431-1440 (2015).
- Glatter, O. A new method for the evaluation of small-angle scattering data. J. Appl. Crystallogr. 10 (5), 415-421 (1977).
- Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. J. Appl. Crystallogr. 25 (4), 495-503 (1992).
- Glatter, O. Convolution Square Root of Band-Limited Symmetrical Functions and Its Application to Small-Angle Scattering Data. J. Appl. Crystallogr. 14, 101-108 (1981).
- Glatter, O., Hainisch, B. Improvements in Real-Space Deconvolution of Small-Angle Scattering Data. J. Appl. Crystallogr. 17, 435-441 (1984).
- Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative Comparison of Algorithms for Tracking Single Fluorescent Particles. Biophys. J. 81 (4), 2378-2388 (2001).
- Wöll, D., Kölbl, C., Stempfle, B., Karrenbauer, A. A novel method for automatic single molecule tracking of blinking molecules at low intensities. Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (17), 6196-6205 (2013).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Bioph. Biom. 26, 373-399 (1997).
- Pusey, P. N., van Megen, W. Detection of small polydispersities by photon correlation spectroscopy. J. Chem. Phys. 80 (8), 3513 (1984).
- Stieger, M., Pedersen, J. S., Richtering, W., Lindner, P. Small-angle neutron scattering study of structural changes in temperature sensitive microgel colloids. J. Chem. Phys. 120 (13), 6197-6206 (2004).
- Wu, X., Pelton, R. H., Hamielec, A. E., Woods, D. R., McPhee, W. The kinetics of poly(N-isopropylacrylamide) microgel latex formation. Colloid Polym. Sci. 272, 467-477 (1994).
- Weeks, E. R., Weitz, D. A. Subdiffusion and the cage effect studied near the colloidal glass transition. Chem. Phys. 284 (1-2), 361-367 (2002).
- Ernst, D., Köhler, J., Weiss, M. Probing the type of anomalous diffusion with single-particle tracking. Phys. Chem. Chem. Phys. 16 (17), 7686-7691 (2014).
- Virtanen, O. L. J. FitIt! (Version 1.1.4). , Available from: https://www.github.com/ovirtanen/fitit (2015).
- Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method For Inverting Data Represented By A Linear Algebraic or Integral Equations. Comput. Phys. Commun. 27 (3), 213-227 (1982).
- Holtzer, L., Meckel, T., Schmidt, T. Nanometric three-dimensional tracking of individual quantum dots in cells. Appl. Phys. Lett. 90 (5), 053902-053904 (2007).
- Diezmann, A. V., Lee, M. Y., Lew, M. D., Moerner, W. E. Correcting field-dependent aberrations with nanoscale accuracy in three-dimensional single-molecule localization microscopy. Optica. 2 (11), 985-989 (2015).
- Neutrons, X-rays and Light: Scattering Methods Applied to Soft Condensed Matter. Lindner, P., Zemb, T. , North Holland Delta Series. Amsterdam. (2002).
