Abstract
אנו מתארים בעלות נמוכה, morbidostat להגדרה לאפיון נתיב אבולוציוני של עמידות לאנטיביוטיקה. Morbidostat הוא מכשיר תרבית חיידקים מנטרים התפתחות חיידקים ברציפות ומתאימה באופן דינמי את ריכוז התרופה לקרוא תיגר על חיידקי זמן כפי שהם מתפתחים לרכוש עמידות לתרופות. המכשיר כולל נפח עבודה של ~ 10 מיליליטר הוא אוטומטי לחלוטין ומצויד מדידת צפיפות אופטית ו-משאבות מייקרו בינוני משלוח סמים. כדי לאמת את הפלטפורמה, מדדנו את הרכישה בשלבים של התנגדות trimethoprim ב coli Escherichia MG 1655, ומשולב המכשיר עם פלטפורמת microfluidic מרובבת לחקור מורפולוגיה תאי רגישות לאנטיביוטיקה. הגישה יכול להיות עד-לשנותם כדי במחקרי מעבדה של עמידות לתרופות אנטיביוטיות, והוא extendible כדי אדפטיבית האבולוציה לשיפורים זן בהנדסה מטבולית וניסויים התרבות חיידקים אחרים.
Introduction
מאז כניסתה של פניצילין התרופה הראשון האנטיביוטי, עמידות לאנטיביוטיקה של חיידקים התפתחה עולמית בעיה בריאותית 1. למרות רכישת עמידות לאנטיביוטיקה ניתן ללמוד למפרע in vivo, התנאים של ניסויים אלה הם בדרך כלל לא מבוקרים לאורך האבולוציה כולה 2. לחלופין, אבולוצית מעבדת אדפטיבית יכולה לחשוף את האבולוציה המולקולרית של מינים של חיידקים תחת לחצים סביבתיים או לחץ ברירה מתרופת אנטיביוטיקת 3. לאחרונה, מבוקר היטב ניסויים רבים האבולוציונית של עמידות לתרופות אנטיביוטיות יש הבהיר את הופעתה של עמידות לתרופות אנטיביוטיות. לדוגמה, קבוצה של אוסטין הפגינו הופעתם המהירה בסביבה 4 מחולקים microfluidic מהונדסים כראוי. Morbidostat שפותח לאחרונה גורם מוטציות שיטתיות תחת לחץ ברירת תרופת 5,6. Morbidostat, תמיכה בבחירה מיקרוביאלימכשיר tion אשר מתאים את ריכוז האנטיביוטיקה ללא הרף כדי לשמור על אוכלוסייה קבועה כמעט, הוא התקדמות גדולה ממבחן התנודות בשימוש במיקרוביולוגיה 7,8. במבחן התנודות, תרופה אנטיביוטית מוזרקת בריכוז גבוה, ואת מוטנטים לשרוד מוקרנים ומנה. במקום זאת, חיידקים בתוך morbidostat מאותגרים כל הזמן צוברים מוטציות מרובות.
Morbidostat פועלת בדומה chemostat, מכשיר התרבות הומצא על ידי נוביק ו Szliard בשנת 1950, אשר שומר אוכלוסייה קבועה על ידי אספקת חומרים מזינים באופן רציף תוך דילול אוכלוסיית החיידקים 9. מאז השקתו, את chemostat כבר מתקדמת ומשופרת. chemostats microfluidic הנוכחי הגיע nanoliter וקיבולות תא בודד. עם זאת, מכשירים אלה אינם מתאימים לניסויי אבולוציה אדפטיבית, הדורשים אוכלוסיית תא גדולה עם אירועים רבים מוטציה 10,11. לאחרונה, מיניchemostats עם כרכים עובדים של ~ 10 מיליליטר גם פותח כדי למלא את הפער בין מתקני גידול בהיקף ליטר ואת 12,13 microfluidic chemostat.
כאן אנו מציגים את העיצוב ושימוש של בעלות נמוכה, morbidostat אוטומטית מחקר עמידות לתרופות אנטיביוטי. המודול המוצע יכול להיות מועסק בתוך חממה שייקר במעבדה למיקרוביולוגיה עם דרישת חומרה מינימאלית. הקושחה הקוד הפתוח גם מותאם בקלות ליישומים ספציפיים של התפתחות אדפטיבית, כגון הנדסה מטבולית 3. לבסוף, morbidostat משתלבת פלטפורמת microfluidic מרובבת עבור בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הרכבה Pretesting של התקן Morbidostat
- עצרת של Morbidostat
- פונץ '3 חורים על המכסה של בקבוקון התרבות עם מחט מזרק 18 G. חותכים שלוש חתיכות של צינורות פוליאתילן ~ 7 ס"מ אורך. הכנס שלושת חלקים אלה של צינורות פוליאתילן על הכובע.
- השתמש קלטת לעטוף את קצה הכובע לשמש בגבס תערובת polydimethylsiloxane (PDMS). מערבבים 5 גרם של רכיב ו -0.5 גרם של רכיב ב 'של PDMS במיכל פלסטיק 150 מ"ל ידי ערבוב ידני עם קיסם. טען את התערובת לתוך מזרק 10 מ"ל.
- יוצקים את התערובת PDMS על כובע עם מזרק. אופים את הכובע כולו כדי לרפא את PDMS עבור 8 שעות בתנור על 70 מעלות צלזיוס.
- הלחם את האנודה LED עם חוט 24 מד ואת קתודת LED עם נגד פחמן עם מלחם. הלחמת נגד פחמן 680 Ω עם חוט G 24. לבודד את חיבור תיל באמצעות הקלטת חשמל.
- כךlder האספן של גלאי האור עם 24 חוט G ואת הפולט של photodetector עם נגד פחמן 100 קילו-אוהם. לבודד את חיבור תיל באמצעות הקלטת חשמל.
- מניחים את דיודה פולטת אור במחזיק הבקבוקון תרבות. על ידי ביצוע דיאגרמת מעגל ב משלים איור 2, לחבר את אור דיודה וכוח זה עם ספק כוח של 5 V. ודא LED פועלת באמצעות מצלמה דיגיטלית שיכולה לזהות IR (למשל, מצלמת הטלפון הנייד).
- מניח את גלאי האור במחזיק בקבוקון התרבות. על ידי ביצוע דיאגרמת המעגל ב משלים איור 2, לחבר את גלאי האור וכוח זה עם ספק כוח של 5 V. חבר את הכבל לשני הצדדים של נגדי photodetector למדוד את המתח על פני לוח הבקרה האלקטרוני.
- מדביק מגנט על הפיר של מאוורר הקירור, אשר משמש כיחידת בוחש המגנטית. ראוי לציין, כי alignmאף אוזן גרון של הפיר של מאוורר בקבוקון התרבות, ואת המרווח בין בקבוקון תרבות המגנט הוא מאוד קריטי עבור פעילותו התקינה של היחידה בחישה המגנטית.
- חבר כל חתיכה של צינורות פוליאתילן של בקבוקון התרבות לתוך חתיכת מקביל צינורות סיליקון עבור משאבות מייקרו, בקבוקים בינוניים, ובקבוק פסולת. הפעל את המשאבה למשך שעה 1 ולמדוד את הנפח הכולל נשאב מהבקבוק הבינוני עד בקבוקון התרבות לקבוע את שיעור המשאבה. ראוי לציין, כי קצב השאיבה הטיפוסי צריך להיות ~ 4 מיליליטר / שעה, אשר תואמת את שיעור הדילול D = 0.33 hr -1 עבור 12 מיליליטר עובד נפח של בקבוקון התרבות.
- הנח את מכלול שלם על בינוניים חממה שייקר (34 ס"מ x 34 ס"מ x 43.5 ס"מ).
- Pretesting Morbidostat
- מתח החשמל סט אוהד מגניב 5 V להתחיל המנוע שלה כדי לבדוק את בר בחישה מגנטית. ראוי לציין, כי פעולת הערבוב יכולה להיבדק חזותית. המתח שמניעשעות מנוע מאוורר הקירור לשלוט במדויק על ידי אפנון רוחב פולס (PWM).
- הכינו סדרה של סוג בר E. דגימות coli עם צפיפות אופטית ב 600 בדרך כלל ננומטר החל 0.07 כדי 0.3 לכיול. מניחים מבחן E. מדגם coli בבקבוקון התרבות ולהקליט את מתח photodetector.
- מקום ~ 100 μl של המדגם הזהה אצל קורא הצלחת ולהקליט את הצפיפות האופטית. השתמש מתח photodetector לעומת נתוני צפיפות אופטיים להתוות את עקומת הכיול. שים לב שבדרך כלל שינוי יחיד אחת צפיפות אופטית מקביל ~ 7.6 V שינוי photodetector עם ערכת ההטיה משמשת כאן.
2. הרצת Morbidostat
- הכנה לפני תחילת הניסוי היומי
- הכן את בקבוקון התרבות עם שלושה tubings Tygon אולטרה-כימי עמיד עם אינץ פנימי בקוטר 1/32 ו- inch בקוטר 3/32 חיצוני עבור צריכת אוויר כדי ליצור את המכשיר כאמור בסעיף1.1 וב משלים איור 1.
- הכן את המדיום מינימלי M9 (0.2% גלוקוז) וסרימתופרים (TMP) בינוני המכיל תרופה. לעקר את המדיום, הבקבוק הבינוני, בקבוק בינוני התרופה, בקבוק פסולת, ואת בקבוקון התרבות ב חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס.
הערה: TMP הוא פתרון המניות המשמש מאוחר יותר להשיג את הריכוזים בטבלה 1 והתרופה TMP המכיל בינוני אינו autoclaved.
- הרצת Morbidostat
- ביום הראשון של הניסוי, להפשיר 1 מ"ל של סוג בר קפוא E. coli MG1655 התאים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהעביר 120 μl של תאים כדי בקבוקון תרבות המכילה ~ 12 מ"ל של מדיום הגידול M9. אחרי היום הראשון, להפשיר 1 מ"ל של E. קפוא coli תאים מן היום הקודם במשך 5 דקות ולהעביר 120 μl של תאים כדי בקבוקון תרבות חדשה המכילה ~ 12 מ"ל של מדיום הגידול M9.
- הפעל החממה שייקר ולהגדיר את בטמפה rature עד 30 מעלות צלזיוס ללא רעד.
- להתחיל את הפעולה morbidostat על ידי הפעלת משאבת מיקרו, היחידה בחישה מגנטית, ומדידת צפיפות אופטית.
הערה: במהלך המבצע, אלגוריתם סף משוב משמש כדי לשלוט על הזרקת סמים. כאשר הצפיפות האופטית נמדדה עוברת סף שנקבע מראש, משאבת הזרקת התרופה הייתה להיות מופעל המשאבה הבינונית תהיה כבויה. אחרת, משאבת הזרקת התרופה נותרת כבויה ואת המשאבה הבינונית פועל. - לפקח על המתח מעת לעת כדי להבטיח שיש התפתחותם של חיידקים.
הערה: בגלל מחזור הקפאת הפשרה, E. coli תאי תערוכת עיכוב של ~ 4 שעות במהלך כל זקן בן יום. - אחרי ~ 23 שעות, להפסיק את שאיבת מיקרו-ידי כיבוי מתח האספקה שלה להוציא את הבקבוקון תרבות. הוסף 15% גליצרול לתוך בקבוקון התרבות ולהקפיא המדגם ב -80 מעלות צלזיוס לאחסון.
- חזור על שלבים 2.2.1 עד 2.2.5.
הערה: בצע את מדידת קצב צמיחה קוראת צלחת עם פורמט 96 גם כדי לקבוע את רמת עמידות לאנטיביוטיקה.
- להפשיר את המדגם הקפוא היומי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולהעביר 15 μl של התא אל בקבוקון התרבות המכיל ~ 15 מיליליטר בינוני M9. ולאפשר להם לגדול עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מגיעה ~ 0.1. מחלקים את 15 מ"ל לתוך 1 מ"ל בקבוקים ולהוסיף התרופה TMP בשלב זה כדי לקבל את ריכוזי התרופה הרצויה כפי שמוצג בטבלה 1.
- קח 200 μl של המדגם משלב 3.1 ומקום לבאר כל בקורא צלחת ולאפשר להם לגדול במשך 12 שעות 5. הצפיפות האופטית ב ננומטר אורך גל 600 נרשמה באופן אוטומטי בזמן המדידה.
הערה: עבור כל נקודת נתונים, מדידות בשלושה עותקים נרשמות בממוצע כדי להבטיח עקביות של הנתונים. הנתונים על צפיפות אופטית לעומת הזמן יכול בדואר על מנת לקבל את שיעור הצמיחה. - מגרש את נתוני שיעור צמיחה לעומת ריכוז התרופה להשיג IC 50. שים לב IC 50 מוגדר ריכוז התרופה שבה שיעור הצמיחה הוא חמישים אחוזי שיעור הצמיחה המקסימאלי 5.
מורפולוגיה 4. תא בודד ומדידה רגישה לאנטיביוטיקה ב מכשירי microfluidic
- בצע ייצור של מכשירי microfluidic באמצעות ליתוגרפיה multilayer הרכה מן PDMS כמתואר במקום אחר 15.
- השתמשו photolithography כדי להפוך את התבנית photoresist עבור שכבות שליטה וזרימה. שים לב כי עבור השכבה מלאה, השתמש photoresist שלילית (~ 15 מיקרומטר גובה) ו photoresist חיובי (~ 8 מיקרומטר גובה) לייצר עובש על פרוסות סיליקון חשוף.
- הכן תערובות PDMS עם יחס לחצות קישור 5: 1 ו -20: 1 עבור ההשכבה מלאת השכבת הזרימה, בהתאמה. שים את התערובות לתוך ייבוש תחת ואקום כדי להסיר בועות, במשך שעה 1.
- לחשוף את תבניות photoresist השכבה מלאה על פרוסות סיליקון כדי trimethylchlorosilane אדי (TMCS). הפוך את השכבה המלאה של ~ עובי מ"מ 6 על ידי יציקה את תערובת PDMS (עם יחס לחצות קישור 5: 1) על פרוסות סיליקון על תבנית photoresist השכבה המלאה. אופים את השכבה מלאה במשך 40 דקות ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. בתנור.
- הפוך את שכבת זרימת ידי ספין ציפוי תערובת PDMS (עם 20 יחס לחצות קישור: 1, ספין מהירות 3,000 סל"ד במשך 60 שניות) על תבנית photoresist שכבת הזרם. אופים את שכבת זרימת למשך 30 דקות ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. בתנור.
- השתמש סכין גילוח לחתוך את השכבה מלאה לתוך גודל השבב הרצוי (בדרך כלל 3 ס"מ X 2 ס"מ) ידני לקלף את השכבה מלאה. מניח את השכבה המלאה על גבי שכבת הזרימה וליישר אותם תחת סטראו. לרפא את המכלול מיושר על 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתנור. לאחר מכן, יש להשרות את הרכבה ב 250 מ"ל מים ללא יונים במיכל פלסטיק במשך 5 שעות כדי לפזר את TMCS שיורית.
- בהמשך לכך, אגרוף החורים מפרצון עם 20 מחטים G והאג"ח אלסטומר כולו לשקופית זכוכית מצופה בשכבה PDMS ריק (צלב PDMS המקשר יחס 5: 1, ספין מהירות 2,000 סל"ד למשך 30 שניות) על ידי טיפול פלזמה אוויר במשך 40 שניות ב לחץ 1.2 אוויר Torr.
- לבצע אפייה נרחבת במשך 36 שעות ב 80 מעלות צלזיוס כדי להפחית את ההשפעות ציטוטוקסיות מן PDMS. שים לב, שלב האפייה זה הוא קריטי כדי למזער את רעילות תאים חיידקיים.
- על שבב צמיחת ניסוי
- לפני הטעינה לתוך מכשיר microfluidic, יש לשטוף אותו עם מים ללא יונים 1 hr ובינוני M9 עבור שעה 1.
- להפשיר את המדגם הקפוא היומי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולחסן מבחנה חדשה עם מדיום M9 טרי. הנח את הדוגמה חממה שייקר ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לדלל את הקיפול 10 מדגם חיידקים עם המדיום M9 ולטעון אותו לתוך המכשיר microfluidic על ידי הפעלת לחץ על מיכל מדגם חיידקים ב 5 psi. לאחר מכן טען את תרופת TMPמדיום לתוך השבב על ידי הפעלת לחץ על מיכל בינוני התרופה 5 psi. הפעל את הערבוב בין חיידק התרופה על ידי מפעילי שסתום micromechanical בין שני החדרים על שבב microfluidic במשך 15 דקות.
- מניח את שבב microfluidic בחממת מיקרוסקופ רכובה על מיקרוסקופ ההפוכה. רוכש את תמונת התא בתא הצמיחה בכל שעה במשך 8 שעות עם מצלמת CCD רכוב על מיקרוסקופ ההפוכה.
- השתמש תסריט התכנית האישית כדי לחשב את מספרי התא באמצעות אלגוריתם סף על נתוני תמונת תא 18. ראוי לציין כי הנתונים מספר הסלולרי הם ממוצעים בדרך כלל מעל שלושה תאי microfluidic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Morbidostat המתואר לעיל הוא schematized באיור 1. פעילות morbidostat המשותפת, לרבות התפתחות ניסיונית, מבחן רגישות לאנטיביוטיקה ובדיקת מורפולוגיה תא, אושש בבית E. תרבות MG1655 coli נחשף וסרימתופרים (TMP), תרופה אנטיביוטית נפוץ 5,6. TMP גורם עליות בשלבים ייחודיות מאוד עמידים לתרופות, ואת מוטציות מקובצים סביב דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR) הגן. לכן, TMP הוא סם תקן יעיל מאוד עבור אימות מבצע morbidostat. כל יום, החיידק צפוי לגדול מעל הסף שנקבע מראש צפיפות האופטית הדק הזרקת הסמים כפי שמוצג באיור 2a. זריקת התרופה צפויה לעכב את הצמיחה וכתוצאה מכך, להקטין את הצפיפות האופטית. פיילוטים כמה עשוי להיות נחוץ כדי לקבוע את ריכוז התרופה האופטימלית. ככלל אצבע, אנו increasדואר הריכוז של מדיום התרופה על ידי פי 5 לאחר שמצא כי מדיום התרופה נכשל לדכא את הצמיחה. לאחר כל מהלך הניסוי, דגימות קפואות יומיות הם הפשירו והשתמשו לקבוע IC 50, מדד כמותי של רמת עמידות לתרופות. העלילה איור 2b מראה את הגידול הזמני עמידות לתרופות אנטיביוטיות. התנגדות הסמים עלתה כ -1,500 לקפל ~ 1,000 מיקרוגרם / מיליליטר מעל ~ 12 ימים, עולים בקנה אחד עם ממצאים קודמים באבולוצית מעבדת 5 וקליניים מבודדים 19. מוטציות נקודת DHFR של המוטציה האחרון היום נמדדו על ידי רצף סנגר ו מפורטות בטבלה 2. מוטציה אחד נמצאת הממוקמת על אזור האמרגן ומציינת כי מוטציה נקודתית אחת באזור האמרגן יכולה לשנות את רמת הביטוי משמעותית של DHFR אנזים 20. עוד מוטציה במיקום 49,910 ממוקמת באזור הגן של DHFR והוא קרוב המעשהאתר ive של DHFR אנזים 21. רכישת עמידות לתרופות עם מוטציות רבות מוכיחה את התועלת של morbidostat, כמו הבחירה על תרופה המכילה צלחת אגרה נוטה להעניק את המוטציה היחידה בלבד.
כתוצאת הודעה רגישה יותר של מורפולוגיה התאים, בדיקת מורפולוגיה התא הבודד עם רגישות לאנטיביוטיקה מתבצעת במקביל, פלטפורמת microfluidic מרובבת 14. איור 3 מציג את העיצוב של שבב microfluidic המרובב. Micrographs של תאים חיידקיים (איור 5) לגלות שינויים במורפולוגיה בשני סוג בר זנים מוטנטים תחת ריכוזים תת-המעכבת של TMP. זני סוג ברים להראות filamentation ניכר בעוד זן מוטנטי לא מראה filamentation משמעותי. שינוי המורפולוגיה זה ברמה תא בודד יכול לשמש לאבחון מהיר של עמידות לאנטיביוטיקה. איור 4 מציג את על-צ'יעקומות גדילה p בריכוזים שונים של TMP. המדגם מוטציה, ניכר גידול משמעותי עמידות לתרופות אנטיביוטיות. נתוני הצמיחה על-שבב באיור 4 עולה בקנה אחד גם עם הערך 50 IC מקורא צלחת מוצג איור 2b.
איור 1:. סכמטי של morbidostat morbidostat הוא מכשיר תרבות רציף אשר מודד את הצפיפות האופטית של אוכלוסיית החיידקים, ובהתאם לכך מתאים את ריכוז התרופה. המכשיר פועל במצב סמים בהזרקה ומצב סמי דילול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: עקומת הצמיחה והגדלת רמת עמידות לתרופות אנטיביוטיות (א) עקומת הצמיחה נציג תחת משוב.. הצמיחה של החיידקים מעוכבות על ידי תרופת האנטיביוטיקה, זריקה אשר מופעל על ידי אלגוריתם סף. כאשר שיעור הצמיחה החיובי מעלה את הצפיפות האופטית מעל הסף שנקבע מראש (OD TH = 0.086), המכשיר למצב סמים בהזרקה. אחרת, המכשיר פועל במצב סמי דילול. האדום סגול החצים מצביעים מיתוג לתוך מצבי הזרקת סמים ודילול סמים, בהתאמה. (ב) התנגדות ברמה של התאים במהלך 12 ימים של חשיפת trimethoprim. IC 50 מראה גידול בשלבים ברורים של עמידות לתרופות אנטיביוטיות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
t = "איור 3" src = "/ files / ftp_upload / 54,426 / 54426fig3.jpg" />
איור 3: התקני microfluidic חוקר מורפולוגיה תאים על-שבב רגישות לאנטיביוטיקה (א) מיקרוסקופ של פריסת השבב.. מדורים ירוק וכחול הם תאי הגידול ובינוניים סמים, בהתאמה, ואת פריסת האדומה מציינת את השכבה מלאה. הממדים של חדר הצמיחה הם 450 מיקרומטר (אורך) x 400 מיקרומטר (w) x 8 מיקרומטר (ח). תא הצמיחה טעון עם החיידקים, ובית נבחרי התרופה עמוס TMP. סרגל קנה מידה הוא 1 ס"מ. (ב) יתגדל לאור באותו השבב. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (ג) מוגדל לאור שני התאים לפני ואחרי הערבוב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"Src =" / files / ftp_upload / 54,426 / 54426fig4.jpg "/>
איור 4: על שבב עקומות גדילה של E. coli נחשפו לריכוזים שונים של TMP: (א) זן קדמון wild-type ו (ב) זן מוטנטי (ביום 12). המדגם מוטציה, ניכר גידול משמעותי עמידות לתרופות אנטיביוטיות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: מורפולוגיות מתא בודד (א - ד) תמונות שדה מוארת של התא לאחר טיפול עם רמות תת-המעכבת של TMP. שים לב filamentation המשמעותי של תאים מהסוג בר ב (ב), אשר נעדר מוטנטים (ד טרונג>). פנלים (ה - ח) הם תמונות דיגיטליות של (א - ד). כל התמונות חיידקי נלקחו על ידי מצלמת CCD עם מטרה בהגדלה 40X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 1 משלים:. המידות וההרכבה של בעל בקבוקון התרבות אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
איור 2 משלים:. התרשים מעגל עבור LED ו photodetector אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
דק-page = "1"> קוד משלים:. תסריט מותאם אישית לספור את המספר הסלולרי מתמונות תא רכש מן השבבים microfluidic אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
| לִטעוֹם | והתרופות TMP (מיקרוגרם / מ"ל) | |||||||||||
| יום 1-3 | 0 | 0.06 | 0.12 | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | |
| יום 4 | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | |
| יום 5-7 | 0 | 2 | 4 | 8 | <td> 1530 | 60 | 120 | 240 | 480 | 960 | ||
| יום 8-12 | 0 | 3 | 7 | 15 | 30 | 60 | 125 | 250 | 500 | 1,000 | 2,000 | |
טבלת 1:. ריכוז תרופה המשמש לקביעת IC 50 במדידה קוראת צלחת ריכוזי התרופה ביחידה של מיקרוגרם / מיליליטר מוצגת למדגם הקפוא היומי. כאשר התאים לפתח עמידות לתרופות גבוהה, ריכוזי התרופה המשמשת גדלו בהתאם.
| לא | מקום | SNP | הערה |
| 1 | 49,894 | C-> T | |
| 2 | 49,910 | T-> | גן DHFR |
| 3 | 49,795 | C-> T | אמרגן DHFR |
טבלה 2:. מוטצית DHFR המזוהית על ידי רצף סנגר נתוני רצף הנציג להראות שלוש מוטציות נקודתיות DHFR של המוטציה האחרונה היום (יום 12). אזורי אמרגן הגנים מכילים SNPs אחד ו -2, בהתאמה. פריימרים קדימה הפוכה המשמשים PCR היו 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 'ו 3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מכשיר morbidostat נמוך טביעת רגל מרכיבים בעלות הנמוכה מודגם. העליות רמות עמידות לתרופות שנרשמו על ידי המכשיר הנן עקביות עם אלו של דוחות קודמים 5. עוצב עבור מחקרים אבולוציוניים של עמידות לתרופות, המכשיר הוא ישים פוטנציאל ניסויים רבים אחרים. ראשית, מסד נתונים מקיף של מוטציות-סמים ניתן לקבוע עבור קבוצה גדולה של אנטיביוטיקה משמעות קלינית. לדוגמה, מסלול אבולוציוני של עמידות לתרופות מרובות ניתן ללמוד רק על ידי הגדלת מספר התרופות השתמשו בניסוי. היתרון העיקרי של מודול דיווח כאן הוא קונפיגורציה הגמישה שלה, המאפשר בקנה מידה גדולה, ניסויים מקבילים תחת תנאי ניסויים שונים.
למרות הרעיון הודגם מדידות מיקרופלואידיקה, כוח החקירה ניתן לשפר על ידי שילוב של מיקרופלואידיקה עם טכנולוגית fluidic 23. העלות לכלהמדידה (יתרון לגודל) מצטמצם באופן דרמטי על ידי צריכת מגיב הוריד עבודה מופחתת. כאן, נתוני מורפולוגיה תא בודד יכולים להיות מופקים פלטפורמת microfluidic. לאחרונה, בדיקות מורפולוגיה microfluidic של תאים בודדים יושמו בהצלחה במעבדות מיקרוביולוגיה קליניות, ומבצע דומה ל- בדיקות דילול סדרה מרק תקן 24. עם הזמינות הגוברת של מכשירי microfluidic, טכנולוגיות משולבות תאפשרנה ניסויי אבולוצית מעבדה בקנה מידה גדולה, תפוקה גבוהה.
מספר צעדים חיוניים כדי להפעיל את morbidostat. ראשית, כי היחידה בחישה המגנטית נוצרה מן המגנטים מאווררים, חשוב כדי ליישר את הפיר של מאוורר בקבוקון התרבות. כמו כן, המרחק בין בקבוקון תרבות המגנט הוא מאוד קריטי כדי להבטיח פעולה יציבה. שנית, מעבר בקבוקון התרבות חדש בתחילת כל הניסוי של יום חשוב גםלמנוע היווצרות ביופילם. אחרת, היווצרות ביופילם יכול להתרחש בתוך 2 או 3 ימים. ושלישית, משום E. דגימות coli הם הפשירו יומי ממדגם קפוא במהלך כל הניסוי של יום על מנת להבטיח עקביות, חשוב להגדיר פרק זמן של איחור של שעה לפחות 4 כדי למנוע שטיפה מתוך מסגרת החיידקים. לחלופין, אפשר לבחור לא להקפיא E. דגימות coli וישירות להשתמש במדגם לחסן בקבוקון תרבות חדש להתחיל תרבות חדשה.
בשנת הגדרה מעשית, תכנון המערכת הנוכחי חייב להתגבר על מגבלות כמה להאריך שימושים הפוטנציאליים שלה. ההיקף של המערכת כולה כיום מוגבל על ידי המדיום מאוכל ליום (במהלך מבצע chemostatic, בקבוקון תרבות אחת הצורכת כ -0.5 ליטר של מדיום ליום בשיעור הדילול הטיפוסי של 0.33 hr -1). כדי לצמצם את היקף העבודה, אופטימיזציה נוספת יכולה להיות מושגת על ידי סימולציה זהירה על הדינמיקה באוכלוסיית עכבות תרופה עם plumbing פרמטרים 25.
לבסוף, morbidostat ניתנת להתאמה בקלות למגוון רחב של ניסויי התרבות חיידקים. לדוגמה, על ידי הצמדת דיודה פולטת אור, המערכת יכולה להיות מחדש בתור bioreactor-צילום, המאפשר ניטור האבולוציונית של אצות כחוליות או מיקרו 26. המודול יכול להתארך עד אנאירובי וטיפוח microaerobic במיכל הדוק גז עם adsorbents ידי אלחוטי הפעלת המכשיר במארז הסוללה. כדוגמא נוספת, הריכוז של טוקסין יכול להיות בהדרגה להנדס זנים עמידים בפני כימיים היעד 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
- Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
- Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
- Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
- Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. Digital image using Matlab processing. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).
- Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
- Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
- Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
- Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
- Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
- Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
- Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
- Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
- Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).
