Abstract
We beschrijven een lage kostprijs, configureerbare morbidostat voor het karakteriseren van de evolutionaire route van resistentie tegen antibiotica. De morbidostat is een bacteriecultuur apparaat dat voortdurend toezicht op de groei van bacteriën en dynamisch de concentratie van het geneesmiddel om voortdurend uitdagen de bacteriën als ze zich ontwikkelen tot resistentie tegen geneesmiddelen te verwerven. Het apparaat beschikt over een werkend volume van ~ 10 ml en is volledig geautomatiseerd en uitgerust met een optische dichtheid meet- en micro-pompen voor middelgrote en drug delivery. Het platform te valideren, maten we de stapsgewijze verwerving van trimethoprim resistentie bij Escherichia coli MG 1655, en de inrichting geïntegreerd met gemultiplexte microfluïdische platform celmorfologie en antibiotische gevoeligheid onderzocht. De aanpak kan worden opgeschaald tot laboratoriumonderzoek van antibiotica-resistentie tegen geneesmiddelen, en is uitbreidbaar tot evolutie adaptieve voor stam verbeteringen in de metabolic engineering en andere bacteriële cultuur experimenten.
Introduction
Sinds de introductie van het eerste antibioticum penicilline heeft microbiële resistentie ontwikkeld tot een wereldwijd gezondheidsprobleem 1. Hoewel de overname van antibioticaresistentie achteraf kan worden bestudeerd in vivo, zijn de voorwaarden van deze experimenten vaak niet gecontroleerd door de hele evolutie 2. Als alternatief kan adaptieve laboratorium evolutie van de moleculaire evolutie van een microbiële soort in het kader van milieu-invloeden of selectiedruk onthullen van een antibioticum drug 3. Onlangs hebben veel goed gecontroleerde evolutionaire experimenten van antibiotica-resistentie het ontstaan van resistentie tegen antibiotica drug opgehelderd. Bijvoorbeeld, Austin's groep toonde snelle opkomst in een correct ontworpen microfluïdische gecompartimenteerd milieu 4. De recent ontwikkelde morbidostat induceert systematische mutaties onder drug selectiedruk 5,6. De morbidostat, een microbieel Selectie-apparaat dat continu aanpast het antibioticum concentratie een bijna constante bevolking te behouden, is een grote stap voorwaarts van de fluctuatie-test gebruikt in de microbiologie 7,8. In de fluctuatie test wordt een antibioticum ingespoten in een hoge concentratie, en de overlevende mutanten onderzocht en geteld. In plaats daarvan, microben in een morbidostat worden voortdurend uitgedaagd en het verwerven van meerdere mutaties.
De morbidostat werkt op dezelfde wijze als de chemostaat, een cultuur apparaat uitgevonden door Novick en Szliard in 1950, dat een constante populatie onderhoudt door voortdurend het leveren van voedingsstoffen, terwijl het verdunnen van de microbiële populatie 9. Sinds de introductie heeft de chemostaat naar voren gebracht en verbeterd. Huidige microfluïdische chemostaten hebben nanoliter en single-cell capaciteit bereikt. Maar deze inrichtingen zijn niet geschikt voor adaptieve evolutie experimenten, die een grote celpopulatie met vele mutatie gebeurtenissen 10,11 vereisen. Onlangs, mini-chemostaten met werkende volumes ~ 10 ml zijn ontwikkeld in de spleet tussen literschaal bioreactoren en de microfluïdische chemostaat 12,13 te vullen.
Hier presenteren we het ontwerp en gebruik van een low-cost, geautomatiseerde morbidostat voor een antibioticum resistentie tegen geneesmiddelen studie. De voorgestelde module kan worden toegepast in een shaker incubator in een microbiologisch laboratorium met minimale hardware vereisten. De open source firmware ook gemakkelijk afgestemd op specifieke toepassingen van adaptieve evolutie, zoals metabolic engineering 3. Tenslotte wordt de morbidostat geïntegreerd in een gemultiplexte microfluïdische platform antibiotische gevoeligheidstests 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montage en pretest van de Morbidostat Device
- Montage van de Morbidostat
- Punch 3 gaten op de kap van de cultuur flacon met een 18 G naald. Snijd drie stukken van polyethyleen buis ~ 7 cm lang. Plaats deze drie stukken van polyethyleen buis op de dop.
- Gebruik tape om de rand van de kap wikkel te dienen als de gietvorm voor het polydimethylsiloxaan (PDMS) mengsel. Meng 5 g component A en 0,5 g van component B de PDMS in een 150 ml plastic container handmatig roeren met een tandenstoker. Plaats het mengsel in een 10 ml spuit.
- Giet het PDMS mengsel op de dop met de spuit. Bak de gehele dop op het PDMS harden 8 uur in de oven op 70 ° C.
- Soldeer de LED anode met 24 gauge draad en LED kathode met de koolstof weerstand met een soldeerbout. Soldeer een 680 Ω koolstof weerstand met een 24 G draad. Isoleer de draad verbinding met behulp van elektrische tape.
- Zolder de collector van de fotodetector 24 met de G draad en de emitter van de fotodetector met een 100 kQ koolweerstand. Isoleer de draad verbinding met behulp van elektrische tape.
- Plaats de light emitting diode in de cultuur flacon houder. Door het volgen van het schema bij het tweede Aanvullend figuur 2, sluit de lichtemitterende diode en de macht met een voeding van 5 V. Zorg ervoor dat de LED werkt met behulp van een digitale camera die IR (bijvoorbeeld een mobiele telefoon met camera) kan detecteren.
- Plaats de fotodetector in de cultuur flacon houder. Door het schakelschema in figuur 2 Aanvullend sluit de fotodetector en voeding met een voeding van 5 V. Sluit de draad aan beide zijden van de fotodetector weerstanden om de spanning over de elektronisch bedieningspaneel meten.
- Lijm een magneet op de as van de ventilator, die als magnetische roerder unit. Merk op dat de alignment van de as van de ventilator aan de cultuur flesje, en de afstand tussen de cultuur flesje en de magneet is zeer belangrijk voor de goede werking van het magnetisch roerorgaan.
- Sluit elk stuk van polyethyleen buis van de cultuur flacon in de overeenkomstige stuk van siliconen buizen voor de micro-pompen, middelgrote flessen, en de fles afval. Zet de pomp gedurende 1 uur en het meten van het totale volume van het medium fles naar de kweek flesje wordt gepompt om de pompsnelheid te bepalen. Merk op dat de normale pompsnelheid ~ 4 ml / uur, wat overeenkomt met de verdunning D = 0,33 h-1 voor een 12 ml werkvolume van de kweek injectieflacon dient.
- Plaats het geheel op een middelgrote (34 cm x 34 cm x 43,5 cm) shaker incubator.
- Pretest de Morbidostat
- Set voedingsspanning van koele ventilator 5 V aan de motor om de magnetische roerstaaf testen beginnen. Merk op dat de roeren actie visueel kan worden geïnspecteerd. De spanning die rijdens de koelventilator motor wordt nauwkeurig gecontroleerd door pulsbreedtemodulatie (PWM).
- Bereid een reeks van wild-type E. coli monsters met optische dichtheden bij 600 nm gewoonlijk tussen 0,07-0,3 kalibratie. Plaats een test E. coli monster in de cultuur flacon en noteer de fotodetector spanning.
- Plaats ~ 100 ul van hetzelfde monster in de plaatlezer en noteer de optische dichtheid. Gebruik de fotodetector spanning versus optische dichtheid data om de kalibratiecurve te plotten. Merk op dat typisch een eenheid verandering in optische dichtheid overeenkomt met ~ 7,6 V wijziging van de fotodetector met de bias schema hier gebruikt.
2. Het uitvoeren van de Morbidostat
- Voorbereiding Voordat u de Daily Experiment
- Bereid de cultuur flacon met drie ultra-chemisch bestendige Tygon buizen met een binnendiameter 1/32 inch en buitendiameter 3/32 inch voor inlaten om het apparaat zoals in hoofdstuk vormen1,1 en aanvullende figuur 1.
- Bereid de M9 minimaal medium (0,2% glucose) en trimethoprim (TMP) geneesmiddel-bevattende medium. Steriliseer het medium, het medium fles, de drug medium fles, de fles afval en de cultuur flacon in een autoclaaf bij 121 ° C.
OPMERKING: De TMP is een voorraadoplossing die wordt gebruikt om de concentraties in tabel 1 en de TMP geneesmiddel bevattende medium wordt niet geautoclaveerd later bereiken.
- Het uitvoeren van de Morbidostat
- Op de eerste dag van het experiment, ontdooien 1 ml bevroren wildtype E. coli MG1655 cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en overdracht 120 ul van de cellen aan de cultuur flacon met ~ 12 ml M9 groeimedium. Na de eerste dag, ontdooien 1 ml ingevroren E. coli-cellen uit de vorige dag gedurende 5 min en overdracht 120 ul van de cellen om een nieuwe cultuur flacon met ~ 12 ml M9 groeimedium.
- Schakel de shaker incubator en stel de tempe tuur tot 30 ° C zonder schudden.
- Start de morbidostat operatie instelling door de micro-pomp, het magnetisch roerorgaan, en het meten extinctie.
OPMERKING: Tijdens de operatie wordt een feedbackdrempel algoritme gebruikt om de geneesmiddelinjectie regelen. Als de gemeten optische dichtheid een vooraf ingestelde drempel overschrijdt, zou het geneesmiddel injectiepomp worden ingeschakeld en de circulatiepomp worden uitgeschakeld. Anders, de drug injectiepomp blijft uit en de circulatiepomp is ingeschakeld. - Controleer de spanning van tijd tot tijd om te zorgen voor microbiële groei.
Let op: Als gevolg van de vorst en dooi cyclus, E. coli-cellen vertonen een vertraging van ~ 4 uur tijdens de groei elke dag. - Na ~ 23 uur, stop de micro-pomp door het uitschakelen van de voedingsspanning en neem de cultuur flacon. Voeg 15% glycerol in de cultuur flacon en bevriezen van het monster bij -80 ° C voor opslag.
- Herhaal de stappen 2.2.1 tot en met 2.2.5.
OPMERKING: Voer de groei gemeten in een plaat reader met een goed formaat 96 bij de resistentie tegen antibiotica te bepalen.
- Ontdooi de dagelijkse bevroren monster bij kamertemperatuur gedurende 5 min en breng 15 pl van de cellen aan de cultuur flacon met ~ 15 ml M9-medium. Laat ze groeien tot de optische dichtheid bij 600 nm ~ 0,1 bereikt. Verdeel de 15 ml in 1 ml flesjes en voeg de TMP geneesmiddel bij deze stap de gewenste geneesmiddelconcentraties verkrijgen zoals weergegeven in tabel 1.
- Neem 200 ul van het monster van stap 3.1 en plaats in elk putje in de plaat lezer en hen in staat stellen om te groeien gedurende 12 uur 5. De optische dichtheid bij 600 nm golflengte wordt automatisch opgenomen tijdens de meting.
LET OP: Voor elk meetpunt, drievoud metingen worden geregistreerd en gemiddeld om de consistentie van de gegevens te waarborgen. De gegevens op de optische dichtheid versus tijd be gebruikt om de groei te verkrijgen. - Plot de groei van gegevens ten opzichte van de concentratie geneesmiddel om IC 50 te verkrijgen. Merk op dat de IC50 wordt gedefinieerd als de geneesmiddelconcentratie waarbij de groei is de helft van de maximale groeisnelheid 5.
4. Single Cell morfologie en antibioticagevoeligheid Meting in microfluïdische apparaten
- Voer vervaardiging van microfluïdische inrichtingen via zachte meerlaagslithografie van PDMS zoals elders 15 beschreven.
- Gebruik fotolithografie om de fotoresist mal voor de controle en de stroom lagen te maken. Merk op dat voor de controle laag, gebruiken negatief fotolak (~ 15 micrometer hoogte) en de positieve fotoresist (~ 8 urn hoogte) om een mal te produceren op een kale silicium wafer.
- Bereid PDMS mengsels met verknoping verhoudingen van 5: 1 en 20: 1 voor de controle laag en de stroom laag resp. Doe het mengsel in een exsiccator onder vacuüm om eventuele luchtbellen te verwijderenVoor 1 uur.
- Expose de controle laag fotolak schimmels op silicium wafer te trimethylchloorsilaan (TMCS) damp. Het controlepaneel laag ~ 6 mm dikte door het gieten van de PDMS mengsel (met verknoping verhouding 5: 1) op de siliciumplak de besturingslaag fotoresist schimmel. Bak de besturingslaag gedurende 40 minuten bij 80 ° C gedurende 1 uur in de oven.
- Maak de stroom laag door draai het coaten van een PDMS mengsel (met de cross-linking verhouding van 20: 1, centrifugeersnelheid 3000 tpm gedurende 60 sec) op een stroom laag fotolak schimmel. Bak de stroom laag voor 30 minuten bij 80 ° C gedurende 1 uur in de oven.
- Gebruik een scheermesje om de besturingslaag in de gewenste chip grootte (gewoonlijk 3 cm x 2 cm) gesneden en handmatig trek het besturingslaag. Plaats de besturing laag bovenop de laag debiet en richt ze onder een stereomicroscoop. Hard de uitgelijnde samenstel bij 80 ° C in de oven gedurende de nacht. Daarna geniet het samenstel in 250 ml gedeïoniseerd water in een plastic container voor 5 uur om de resterende TMCS oplossen.
- Vervolgens punch de inlaat gaten 20 G naalden en bond de gehele elastomeer een glasplaatje gecoat met een blanco PDMS laag (PDMS verknopende verhouding 5: 1, centrifugeersnelheid 2000 tpm gedurende 30 sec) door de lucht plasmabehandeling gedurende 40 s bij 1.2 Torr luchtdruk.
- Voeren uitgebreide bakken voor 36 uur bij 80 ° C voor de cytotoxische effecten van PDMS verminderen. Merk op dat deze bakstap is cruciaal voor de toxiciteit voor de bacteriële cellen te minimaliseren.
- On Chip Growth Experiment
- Voordat u in de microfluïdische apparaat, spoelen met gedemineraliseerd water gedurende 1 uur en M9 medium gedurende 1 uur.
- Ontdooi de dagelijkse bevroren monster bij kamertemperatuur gedurende 5 min en beënt een nieuwe reageerbuis met vers M9 medium. Het monster wordt in een shaker incubator bij 37 ° C overnacht.
- Verdun het microbiële monster 10-voudige met M9 medium en plaats hem in de microfluïdische apparaat door druk uit op de microbiële sample container bij 5 psi. laadt dan de TMP drugmedium in de chip door druk uit op de drug medium container bij 5 psi. Voer de menging tussen de microbe en geneesmiddel door het bedienen van de micromechanische klep tussen de twee kamers op de microfluïdische chip gedurende 15 min.
- Plaats de microfluïdische chip in de incubator microscoop gemonteerd op de omgekeerde microscoop. Het verwerven van de afbeelding cel in de groeikamer elk uur gedurende 8 uur met de CCD camera gemonteerd op de omgekeerde microscoop.
- Gebruik het aangepaste programma script om de cel aantallen te berekenen via een drempel algoritme op het beeld cel data 18. Merk op dat het aantal cellen gegevens worden gemiddeld normaal meer dan drie microfluïdische kamers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bovenbeschreven morbidostat schematisch voorgesteld in figuur 1. De gemeenschappelijke morbidostat operaties, waaronder experimentele evolutie, antibioticagevoeligheid testen en celmorfologie controle werden gevalideerd in een E. coli MG1655 cultuur blootgesteld aan trimethoprim (TMP), een veel gebruikte antibioticum 5,6. TMP induceert zeer onderscheidend stapsgewijze toename van resistentie, en de mutaties zijn geclusterd rond de dihydrofolaat reductase (DHFR) gen. Daarom TMP is een zeer effectieve standaard medicijn voor het valideren van de morbidostat operatie. Elke dag wordt de microbe verwachting boven de ingestelde drempelwaarde optische dichtheid groeien en leiden tot de geneesmiddelinjectie zie figuur 2a. Het geneesmiddel injectie wordt verwacht dat de groei te remmen en daardoor verminderen de optische dichtheid. Verschillende proefdraaien kan nodig zijn om de optimale concentratie van het geneesmiddel te bepalen. Als vuistregel, we increase de concentratie van het geneesmiddel medium met 5-voudig na de vaststelling dat het geneesmiddel het uitblijven van de groei onderdrukken. Nadat het gehele verloop van het experiment worden dagelijks ingevroren monsters ontdooid en gebruikt voor het IC 50, een kwantitatieve maat voor de resistentie te bepalen. De plot in figuur 2b toont de tijdelijke verhoging van de resistentie tegen antibiotica drug. De resistentie steeg ongeveer 1.500-voudig tot ~ 1000 ug / ml meer dan ~ 12 dagen, in overeenstemming met eerdere bevindingen in het laboratorium evolutie 5 en klinische isolaten 19. Het DHFR puntmutaties in de laatste dagen mutant werden gemeten door Sanger sequentiebepaling en worden weergegeven in tabel 2. Een mutatie gevonden op het promotorgebied en geeft aan dat enkele puntmutatie in het promotorgebied significant de expressie van het DHFR veranderen enzym 20. Een andere mutatie op plaats 49.910 ligt in het gen regio DHFR en ligt dicht bij de handelingive plaats van het DHFR enzym 21. De overname van geneesmiddelresistentie meerdere mutaties toont de bruikbaarheid van de morbidostat, door selectie op geneesmiddel bevattende agarplaat neiging om alleen de enkele mutatie verleent.
Als een gevoeligere uitlezing van de celmorfologie, is enkel-celmorfologie controle met antibioticagevoeligheid in een parallel uitgevoerde multiplex microfluïdische platform 14. Figuur 3 toont de inrichting van de gemultiplexte microfluïdische chip. Microfoto's van de bacteriële cellen (Figuur 5) tonen de morfologie veranderingen in zowel wild-type en mutante stammen onder sub-remmende concentraties van TMP. Wild-type stammen tonen significante filamentatie terwijl de mutante stam vertoont geen significante filamentatie. Deze morfologie verandering op een enkele cel niveau kan worden gebruikt bij de snelle diagnose van antibioticaresistentie. Figuur 4 toont de on-chip groeicurven bij verschillende concentraties van TMP. De mutant monster een aanzienlijke toename van antibiotica resistentie. De on-chip groei gegevens in Figuur 4 is ook in overeenstemming met de IC50 waarde van de plaatlezer weergegeven in figuur 2b.
Figuur 1:. Schema van de morbidostat De morbidostat is een continukweek apparaat dat de optische dichtheid van de microbiële populatie meet en derhalve past de geneesmiddelconcentratie. Het toestel draait in drug-injectie mode en drugs-verdunning-modus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Groei curve en toename van antibiotica resistentie tegen geneesmiddelen niveau (a) Vertegenwoordiger groeicurve onder feedback.. De microbiële groei wordt geremd door het antibioticum, waarvan de injectie wordt geactiveerd door een drempel algoritme. Wanneer de positieve groei verhoogt de optische dichtheid boven de vooraf ingestelde drempel (OD TH = 0,086), schakelt het apparaat om drug-injectie-modus. Anders, het toestel draait in drug-verdunning mode. Rode en paarse pijlen geven schakelen in het injecteren van drugs en drugs verdunning modes, respectievelijk. (B) Weerstand niveau van de cellen gedurende 12 dagen van blootstelling aan trimethoprim. De IC 50 toont een duidelijke stapsgewijze toename van antibioticaresistentie geneesmiddel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
t = "Figuur 3" src = "/ files / ftp_upload / 54426 / 54426fig3.jpg" />
Figuur 3: microfluïdische inrichtingen voor het onderzoeken van celmorfologie en on-chip antibioticagevoeligheid (a) Microfoto van de chip lay-out.. Groen en blauw compartimenten zijn de groei en drugs medium kamers, respectievelijk, en de rode layout geeft de besturingslaag. De afmetingen van de groeikamer zijn 450 urn (l) x 400 urn (w) x 8 micrometer (u). De groei kamer wordt geladen met de bacteriën, en het geneesmiddel kamer wordt geladen met TMP. Schaal bar is 1 cm. (B) Vergrote weergave van dezelfde chip. Schaal bar = 500 pm. (C) Vergrote weergave van beide kamers voor en na het mengen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
"Src =" / files / ftp_upload / 54426 / 54426fig4.jpg "/>
Figuur 4: On-chip groeicurven van E. coli blootgesteld aan verschillende concentraties van TMP: (a) wildtype stam voorouderlijke en (b) mutant stam (op dag 12). De mutant voorbeeld toont een significante toename van de resistentie tegen antibiotica geneesmiddel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Single-cell morfologie (a - d) Bright gebied beelden van de cel na behandeling met sub-remmende niveaus van TMP. Let op de belangrijke filamentatie van het wild-type cellen in (b), welke afwezig is in de mutanten (d (e - h) zijn gedigitaliseerde beelden van (a - d). Alle bacteriële foto's werden genomen door een CCD-camera met een vergroting doelstelling 40X. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende Figuur 1:. De afmetingen en montage van de cultuur flacon houder Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Figuur 2:. Het schema voor de LED en fotodetector Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Code:. Custom script om het aantal cellen van de verworven cel beelden van de microfluïdische chips tellen Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Monster | TMP Drug (ug / ml) | |||||||||||
| dag 1-3 | 0 | 0.06 | 0.12 | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | |
| dag 4 | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | |
| dag 5-7 | 0 | 2 | 4 | 8 | <td> 1530 | 60 | 120 | 240 | 480 | 960 | ||
| dag 12/08 | 0 | 3 | 7 | 15 | 30 | 60 | 125 | 250 | 500 | 1000 | 2000 | |
Tabel 1:. Geneesmiddelconcentratie gebruikt om IC 50 bepalen de plaatlezer gemeten geneesmiddelconcentraties in eenheid pg / ml worden gedurende de dagelijkse bevroren monster. Aangezien de cellen zich ontwikkelen hogere resistentie, zijn de geneesmiddelconcentraties die evenredig verhoogd.
| Nee | plaats | SNP | Notitie |
| 1 | 49.894 | C-> T | |
| 2 | 49.910 | T-> A | DHFR-gen |
| 3 | 49.795 | C-> T | DHFR promotor |
Tabel 2:. Mutatie in DHFR geïdentificeerd door Sanger sequentiebepaling De sequentie representatieve gegevens tonen de drie DHFR puntmutaties in de laatste dagen mutant (dag 12). De promotor en gen gebieden bevatten een en 2 SNP's, respectievelijk. De forward en reverse primers gebruikt in de PCR waren 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 en 3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een low-footprint morbidostat apparaat goedkope componenten wordt aangetoond. De toename van geneesmiddelresistentie niveau door de inrichting geregistreerde komen overeen met die van eerdere verslagen 5. Geschikt voor evolutionaire studies van resistentie, de inrichting is potentieel van toepassing op vele andere experimenten. Ten eerste kan een uitgebreide database van drugs geïnduceerde mutaties worden vastgesteld voor een grote set van klinisch relevante antibiotica. Zo kan de evolutiepad van meervoudige geneesmiddelresistentie bestudeerd door simpelweg het aantal geneesmiddelen die in het experiment toe. Het belangrijkste voordeel van de hier gerapporteerde module is de flexibele configureerbaarheid, waardoor grootschalige parallelle experimenten onder verschillende experimentele omstandigheden.
Hoewel het concept werd aangetoond in de microfluidics metingen kan de onderzoeksbevoegdheid worden verbeterd door het combineren van microfluidics met vloeibare technologie 23. De kosten permeting (schaalvoordelen) wordt drastisch verminderd door de verlaagde reagensverbruik en lagere arbeidskosten. Hier kunnen één celmorfologie gegevens worden geëxtraheerd uit de microfluïdische platform. Onlangs, microfluïdische morfologie testen van enkele cellen is met succes geïmplementeerd in de klinische microbiologie laboratoria, en presteert vergelijkbaar met standaard bouillon seriële verdunning testen 24. Met de toenemende beschikbaarheid van microfluïdische inrichtingen zullen gecombineerde technologieën grootschalige, high-throughput laboratorium evolutie experimenten mogelijk.
Verschillende stappen zijn cruciaal voor de morbidostat draaien. Ten eerste omdat het magnetisch roerorgaan wordt gevormd uit magneten en een koelventilator, is het cruciaal om de as van de ventilator te passen aan de cultuur flacon. Ook de afstand tussen de cultuur flesje en de magneet is zeer kritisch voor een stabiele werking. Ten tweede schakelen naar een nieuwe cultuur flacon in het begin van elke dag experiment is belangrijkvoorkomen biofilmvorming. Anders kan biofilmvorming optreden binnen 2 of 3 dagen. Ten derde, omdat E. coli monsters dagelijks ontdooid uit een bevroren monster gedurende elke dag experiment om de samenhang is het belangrijk om een vertragingsduur van ten minste 4 uur in totaal wassen van de bacteriën te voorkomen. Als alternatief kan men niet voor kiezen om te bevriezen E. coli monsters en direct gebruik maken van het monster aan een nieuwe cultuur flacon te enten om een nieuwe cultuur te starten.
In een praktische instelling, moet het huidige ontwerp van het systeem een aantal beperkingen te overwinnen om zijn potentieel gebruiksmogelijkheden uit te breiden. Het volume van het gehele systeem is momenteel beperkt door het opgenomen per dag medium (in chemostatic werking, één cultuur flacon verbruikt ongeveer 0,5 L medium per dag bij de typische verdunningssnelheid van 0,33 uur-1). Om het werkvolume te verminderen, kan verdere optimalisatie worden bereikt door zorgvuldige simulatie op de drug-geremd populatiedynamiek met plumbing parameters 25.
Tenslotte de morbidostat gemakkelijk kan worden aangepast aan een breed scala bacteriekweek experimenten. Bijvoorbeeld door het aanbrengen van een licht emitterende diode, het systeem kan worden geconfigureerd als een fotobioreactor, waardoor de evolutionaire controle van cyanobacteriën of microalgen 26. De module kan worden uitgebreid tot anaërobe en microaerobic teelt in een gasdichte container met adsorbentia door draadloos bedienen van het apparaat in een accu. Als een ander voorbeeld kan de concentratie van een toxine geleidelijk worden verhoogd tot stammen die resistent zijn tegen de beoogde chemische 27 zijn ingenieur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
- Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
- Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
- Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
- Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. Digital image using Matlab processing. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).
- Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
- Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
- Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
- Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
- Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
- Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
- Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
- Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
- Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).
