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Genetics

डिजाइन और एक कम लागत का उपयोग, बैक्टीरिया की अनुकूली विकास के लिए एंटीबायोटिक दवा चयन के तहत स्वचालित Morbidostat

Published: September 27, 2016 doi: 10.3791/54426
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Electrical Engineering, National Tsing Hua University

Abstract

हम एंटीबायोटिक प्रतिरोध के विकासवादी मार्ग निस्र्पक के लिए एक कम लागत, विन्यास morbidostat का वर्णन है। morbidostat एक जीवाणु संस्कृति युक्ति है कि लगातार बैक्टीरिया विकास पर नजर रखता है और गतिशील दवा एकाग्रता समायोजित लगातार बैक्टीरिया को चुनौती के रूप में वे दवा प्रतिरोध हासिल करने के लिए तैयार है। डिवाइस ~ 10 मिलीलीटर की एक काम की मात्रा की सुविधा है और पूरी तरह से स्वचालित और ऑप्टिकल घनत्व माप और मध्यम और दवा वितरण के लिए सूक्ष्म पंप के साथ सुसज्जित है। मंच को मान्य करने के लिए, हम कोलाई एमजी 1655 में trimethoprim प्रतिरोध का चरणबद्ध अधिग्रहण मापा जाता है, और सेल आकृति विज्ञान और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता जांच के लिए एक मल्टिप्लेक्स microfluidic मंच के साथ डिवाइस एकीकृत। दृष्टिकोण हो सकता है एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध की प्रयोगशाला अध्ययन करने के लिए ऊपर पहुंचा, और चयापचय इंजीनियरिंग और अन्य जीवाणु संस्कृति प्रयोगों में तनाव के सुधार के लिए विकास अनुकूली के लिए लचीला है।

Introduction

पहली एंटीबायोटिक दवा पेनिसिलिन की शुरूआत के बाद से, माइक्रोबियल एंटीबायोटिक प्रतिरोध एक वैश्विक स्वास्थ्य समस्या 1 में विकसित किया है। हालांकि एंटीबायोटिक प्रतिरोध के अधिग्रहण पूर्वव्यापी विवो में अध्ययन किया जा सकता है, इन प्रयोगों की स्थिति अक्सर संपूर्ण विकास 2 के दौरान नियंत्रित नहीं कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, अनुकूली प्रयोगशाला विकास एक एंटीबायोटिक दवा 3 से पर्यावरण तनाव या दबाव में चयन एक माइक्रोबियल प्रजातियों के आणविक विकास प्रकट कर सकते हैं। हाल ही में, कई अच्छी तरह से नियंत्रित एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध के विकासवादी प्रयोगों एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध के उद्भव स्पष्ट कर दिया है। उदाहरण के लिए, ऑस्टिन के समूह एक ठीक से इंजीनियर microfluidic compartmented पर्यावरण 4 में तेजी से उभार का प्रदर्शन किया। हाल ही में विकसित morbidostat दवा चयन दबाव 5,6 के तहत व्यवस्थित म्यूटेशन लाती है। morbidostat, एक माइक्रोबियल selection युक्ति है कि लगातार एंटीबायोटिक एकाग्रता समायोजित लगभग निरंतर आबादी बनाए रखने के लिए, सूक्ष्म जीव विज्ञान में उतार-चढ़ाव 7.8 में इस्तेमाल की परीक्षा से एक प्रमुख अग्रिम है। उतार-चढ़ाव के परीक्षण में, एक एंटीबायोटिक दवा उच्च एकाग्रता में इंजेक्ट किया जाता है, और जीवित रहने का म्यूटेंट जांच की और गिने जाते हैं। इसके बजाय, एक morbidostat में रोगाणुओं को लगातार चुनौती दी और कई उत्परिवर्तन प्राप्त कर रहे हैं।

Morbidostat chemostat, एक संस्कृति डिवाइस 1950 में Novick और Szliard द्वारा आविष्कार किया है कि लगातार पोषक तत्वों की आपूर्ति जबकि माइक्रोबियल आबादी 9 गिराए द्वारा एक निरंतर जनसंख्या का कहना है के लिए इसी तरह चल रही है। इसकी शुरूआत के बाद से, chemostat उन्नत और सुधार किया गया है। वर्तमान microfluidic chemostats nanoliter और एकल कोशिका क्षमता पर पहुंच गया है। हालांकि, इन उपकरणों अनुकूली विकास प्रयोगों, जो कई उत्परिवर्तन घटनाओं 10,11 के साथ एक बड़ी सेल की आबादी की आवश्यकता के लिए अनुपयुक्त हैं। हाल ही में, मिनी~ 10 मिलीलीटर की मात्रा में काम कर रहे हैं साथ chemostats भी लीटर पैमाने बायोरिएक्टर और microfluidic chemostat 12,13 के बीच की खाई को भरने के लिए विकसित किया गया है।

यहाँ हम एक एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध के अध्ययन के लिए डिजाइन और एक कम लागत का उपयोग करते हैं, स्वचालित morbidostat प्रस्तुत करते हैं। प्रस्तावित मॉड्यूल न्यूनतम हार्डवेयर आवश्यकता के साथ एक सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला में एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर में नियोजित किया जा सकता है। खुला स्रोत फर्मवेयर भी आसानी से इस तरह के चयापचय इंजीनियरिंग 3 के रूप में अनुकूली विकास के विशिष्ट अनुप्रयोगों, के अनुरूप है। अंत में, morbidostat एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण 14 के लिए एक मल्टिप्लेक्स microfluidic मंच में एकीकृत है।

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Protocol

1. विधानसभा और Morbidostat डिवाइस की Pretesting

  1. Morbidostat के विधानसभा
    1. एक 18 जी सिरिंज सुई के साथ संस्कृति शीशी की टोपी पर 3 छेद पंच। पॉलीथीन ट्यूबिंग के तीन टुकड़े लंबाई में 7 सेमी कट ~। टोपी पर पॉलीथीन ट्यूबिंग के इन तीन टुकड़े डालें।
    2. टेप का उपयोग टोपी के किनारे लपेट के लिए polydimethylsiloxane (PDMS) मिश्रण के लिए कलाकारों के रूप में सेवा करने के लिए। एक दंर्तखोदनी के साथ मैन्युअल सरगर्मी से एक घटक के 5 ग्राम और एक 150 मिलीलीटर की प्लास्टिक कंटेनर में PDMS की बी घटक की 0.5 ग्राम मिलाएं। एक 10 मिलीलीटर सिरिंज में मिश्रण लोड।
      1. सिरिंज के साथ टोपी पर PDMS मिश्रण डालो। 70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में 8 घंटे के लिए PDMS इलाज करने के लिए पूरे टोपी सेंकना।
    3. 24 गेज तार और एक टांका लोहे के साथ कार्बन संघर्ष के साथ एलईडी कैथोड के साथ एलईडी एनोड मिलाप। एक 24 जी तार के साथ एक 680 Ω कार्बन रोकनेवाला मिलाप। बिजली के टेप का उपयोग कर तार कनेक्शन बचाने के।
    4. इसलिए24 जी तार और एक 100 kΩ कार्बन संघर्ष के साथ photodetector के emitter के साथ photodetector के कलेक्टर lder। बिजली के टेप का उपयोग कर तार कनेक्शन बचाने के।
    5. संस्कृति शीशी धारक में प्रकाश उत्सर्जक डायोड रखें। पूरक चित्रा 2 में सर्किट आरेख का पालन करके, प्रकाश 5 वी की एक बिजली की आपूर्ति के साथ डायोड और यह शक्ति उत्सर्जन कनेक्ट सुनिश्चित करें कि एलईडी एक डिजिटल कैमरा है कि आईआर (जैसे, एक मोबाइल फोन कैमरा) का पता लगा सकते का उपयोग करके काम करता है।
    6. संस्कृति शीशी धारक में photodetector रखें। पूरक चित्रा 2 में सर्किट आरेख का पालन करके, photodetector और यह शक्ति 5 वी की एक बिजली की आपूर्ति के साथ कनेक्ट इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रण बोर्ड भर में वोल्टेज को मापने के लिए photodetector प्रतिरोधों के दोनों पक्षों के तार कनेक्ट।
    7. जो चुंबकीय उत्तेजक इकाई के रूप में कार्य करता है शीतलन प्रशंसक, के शाफ्ट पर एक चुंबक गोंद। ध्यान दें कि alignmसंस्कृति शीशी प्रशंसक है, और संस्कृति की शीशी और चुंबक के बीच अंतर रखने की शाफ्ट के ईएनटी चुंबकीय सरगर्मी इकाई के समुचित कार्य के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।
    8. सूक्ष्म पंप, मध्यम बोतलें, और अपशिष्ट बोतल के लिए सिलिकॉन टयूबिंग की इसी टुकड़ा में संस्कृति शीशी के पॉलीथीन ट्यूबिंग का एक टुकड़ा कनेक्ट करें। 1 घंटे के लिए पंप पर बारी और उपाय कुल मात्रा संस्कृति शीशी मध्यम बोतल से लगाया जा रहा पंप दर निर्धारित करने के लिए। ध्यान दें कि ठेठ पंप दर ~ 4 एमएल / घंटा है, जो कमजोर पड़ने दर डी = 0.33 मानव संसाधन -1 काम कर संस्कृति शीशी की मात्रा एक 12 मिलीलीटर के लिए करने के लिए संगत होना चाहिए।
    9. एक मध्य आकार (34 सेमी x 34 सेमी x 43.5 सेमी) एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर पर पूरे विधानसभा रखें।
  2. Morbidostat Pretesting
    1. 5 वी को शांत प्रशंसक के सेट बिजली की आपूर्ति वोल्टेज चुंबकीय सरगर्मी बार परीक्षण करने के लिए अपनी मोटर शुरू करने के लिए। ध्यान दें कि सरगर्मी कार्रवाई नेत्रहीन का निरीक्षण किया जा सकता है। वोल्टेज है कि ड्राइवठंडा प्रशंसक मोटर ठीक पल्स चौड़ाई मॉडुलन (PWM) द्वारा नियंत्रित किया जाता रहा है।
    2. जंगली प्रकार ई की एक श्रृंखला तैयार 600 पर ऑप्टिकल घनत्व के साथ कोलाई नमूने आम तौर पर 0.07 से जांच के लिए 0.3 से लेकर एनएम। एक परीक्षण ई की जगह संस्कृति शीशी में कोलाई नमूना और photodetector वोल्टेज रिकॉर्ड है।
      1. प्लेस प्लेट रीडर में एक ही नमूने के ~ 100 μl और ऑप्टिकल घनत्व रिकॉर्ड है। अंशांकन वक्र साजिश करने बनाम ऑप्टिकल घनत्व डेटा photodetector वोल्टेज का प्रयोग करें। ध्यान दें कि आमतौर पर, ऑप्टिकल घनत्व में एक इकाई को बदलने ~ 7.6 वी यहां इस्तेमाल पूर्वाग्रह योजना के साथ photodetector में परिवर्तन से मेल खाती है।

2. Morbidostat रनिंग

  1. डेली प्रयोग शुरू करने से पहले तैयारी
    1. inlets खंड में के रूप में डिवाइस के लिए फार्म के लिए भीतरी व्यास 1/32 इंच और बाहरी व्यास 3/32 इंच के साथ तीन अल्ट्रा रासायनिक प्रतिरोधी Tygon tubings के साथ संस्कृति शीशी तैयार1.1 और पूरक चित्रा 1 में।
    2. M9 न्यूनतम मध्यम (0.2% ग्लूकोज) और trimethoprim (TMP) दवा युक्त मध्यम तैयार करें। 121 डिग्री सेल्सियस पर एक आटोक्लेव में मध्यम, मध्यम बोतल, दवा मध्यम बोतल, अपशिष्ट बोतल, और संस्कृति शीशी जीवाणुरहित।
      नोट: TMP एक शेयर समाधान है कि बाद में 1 टेबल में सांद्रता और मध्यम युक्त TMP दवा autoclaved नहीं है को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
  2. Morbidostat रनिंग
    1. प्रयोग के पहले दिन, जमे हुए जंगली प्रकार के 1 मिलीलीटर ई गल कमरे के तापमान और हस्तांतरण संस्कृति युक्त शीशी कोशिकाओं के 120 μl में 5 मिनट के लिए कोलाई MG1655 कोशिकाओं ~ M9 मध्यम विकास के 12 मिलीलीटर। पहले दिन के बाद, जमे हुए ई के 1 मिलीलीटर पिघलना कोलाई 5 मिनट और हस्तांतरण युक्त एक नई संस्कृति शीशी कोशिकाओं के 120 μl के लिए पिछले दिन से कोशिकाओं ~ M9 मध्यम विकास के 12 मिलीलीटर।
    2. एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर पर मुड़ें और Tempe सेट कोई झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस के लिए rature।
    3. सूक्ष्म पंप, चुंबकीय सरगर्मी इकाई, और ऑप्टिकल घनत्व माप पर बदल कर morbidostat आपरेशन शुरू।
      नोट: आपरेशन के दौरान, एक प्रतिक्रिया दहलीज एल्गोरिथ्म दवा इंजेक्शन नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। जब मापा ऑप्टिकल घनत्व एक पूर्व निर्धारित सीमा से अधिक है, नशीली दवाओं के इंजेक्शन पंप चालू किया जाएगा और मध्यम पंप बंद कर दिया जाएगा। अन्यथा, दवा इंजेक्शन पंप बंद रहता है और मध्यम पंप पर है।
    4. समय-समय पर वोल्टेज की निगरानी सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोबियल विकास नहीं है।
      नोट: फ्रीज और पिघलना चक्र, ई की वजह कोलाई कोशिकाओं को एक दिन के विकास के दौरान ~ 4 घंटा की देरी दिखा रहे हैं।
    5. ~ 23 घंटे के बाद, इसकी आपूर्ति वोल्टेज बंद करके सूक्ष्म पंप बंद करो और संस्कृति शीशी बाहर ले। संस्कृति शीशी में 15% ग्लिसरॉल जोड़ें और भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना फ्रीज।
    6. दोहराएँ 2.2.5 के लिए 2.2.1 कदम।
Le "96 अच्छी तरह प्रारूप में> 3। एंटीबायोटिक संवेदनशीलता मापन

ध्यान दें: एंटीबायोटिक प्रतिरोध स्तर निर्धारित करने के लिए एक साथ 96 प्रारूप के साथ एक प्लेट रीडर में विकास दर माप प्रदर्शन करना।

  1. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जमे हुए दैनिक नमूना गला लें और संस्कृति युक्त ~ 15 मिलीलीटर M9 मध्यम शीशी सेल के 15 μl हस्तांतरण। उन्हें 600 में ऑप्टिकल घनत्व एनएम पहुंचता है ~ 0.1 तक बढ़ने की अनुमति दें। 1 मिलीलीटर की बोतल में 15 मिलीलीटर फूट डालो और के रूप में तालिका 1 में दिखाया वांछित दवा सांद्रता प्राप्त करने के लिए इस कदम पर TMP दवा जोड़ें।
  2. प्लेट रीडर में अच्छी तरह से प्रत्येक में 3.1 कदम और जगह से नमूने के 200 μl ले लो और उन्हें 12 घंटे 5 के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं। तरंग दैर्ध्य 600 एनएम ऑप्टिकल घनत्व माप के दौरान स्वचालित रूप से दर्ज की गई है।
    नोट: प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए, तीन प्रतियों माप दर्ज की गई और डेटा की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए औसत रहे हैं। समय बनाम ऑप्टिकल घनत्व पर डेटा कर सकते हैं खई विकास दर प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया।
  3. आईसी 50 प्राप्त करने के लिए दवा एकाग्रता बनाम विकास दर डेटा प्लॉट। ध्यान दें कि आईसी 50 दवा एकाग्रता, जिस पर विकास दर अधिक से अधिक विकास दर 5 का पचास प्रतिशत है के रूप में परिभाषित किया गया है।

4. सिंगल सेल आकृति विज्ञान और microfluidic उपकरणों में एंटीबायोटिक संवेदनशीलता मापन

  1. के रूप में कहीं 15 में वर्णित PDMS से बहुपरत नरम लिथोग्राफी के माध्यम से microfluidic उपकरणों के निर्माण को पूरा करें।
    1. नियंत्रण और प्रवाह परतों के लिए photoresist मोल्ड बनाने के लिए photolithography का प्रयोग करें। ध्यान दें कि नियंत्रण परत के लिए, नकारात्मक photoresist (~ 15 माइक्रोन ऊंचाई) और सकारात्मक photoresist (~ 8 माइक्रोन ऊंचाई) का उपयोग एक नंगे सिलिकॉन वेफर पर एक मोल्ड उत्पादन करने के लिए।
    2. नियंत्रण परत और प्रवाह परत के लिए क्रमश: 1: 1 और 20: के 5 जोड़ने पार अनुपात के साथ PDMS मिश्रण तैयार करें। वैक्यूम के अंतर्गत एक desiccator में मिश्रण डाल किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए, 1 घंटे के लिए।
    3. सिलिकॉन वेफर पर नियंत्रण परत photoresist नए नए साँचे का पर्दाफाश करने के लिए trimethylchlorosilane (TMCS) वाष्प। कास्टिंग PDMS मिश्रण से ~ 6 मिमी मोटाई के नियंत्रण परत बनाने (जोड़ने पार अनुपात के साथ 5: 1) नियंत्रण परत photoresist मोल्ड पर सिलिकॉन वेफर पर। ओवन में 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए नियंत्रण परत सेंकना।
    4. एक प्रवाह परत photoresist मोल्ड पर: (1, स्पिन गति 60 सेकंड के लिए 3000 rpm जोड़ने पार अनुपात 20) के साथ स्पिन कोटिंग एक PDMS मिश्रण द्वारा प्रवाह परत बना। ओवन में 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रवाह परत सेंकना।
    5. एक रेजर ब्लेड का प्रयोग वांछित चिप आकार में नियंत्रण परत (आमतौर पर 3 सेमी x 2 सेमी) में कटौती और मैन्युअल नियंत्रण परत छील करने के लिए। प्रवाह परत के शीर्ष पर नियंत्रण परत प्लेस और एक stereomicroscope के तहत उन्हें पंक्ति। ओवन रात भर में 80 डिग्री सेल्सियस पर गठबंधन विधानसभा का इलाज। बाद में, विधानसभा विआयनीकृत पानी की 250 मिलीलीटर में एक प्लास्टिक कंटेनर में 5 घंटे के लिए अवशिष्ट TMCS भंग करने के लिए सोख।
    6. इसके बाद, 20 जी सुइयों के साथ इनलेट छेद पंच और (PDMS जोड़ने पार अनुपात 5: 1, स्पिन गति 2,000 आरपीएम के लिए 30 सेकंड) एक गिलास स्लाइड एक खाली PDMS परत के साथ लेपित करने के लिए पूरे इलास्टोमेर बांड पर 40 सेकंड के लिए हवा प्लाज्मा उपचार के द्वारा 1.2 Torr में हवा के दबाव।
    7. 80 डिग्री सेल्सियस पर 36 घंटे के लिए व्यापक पाक बाहर ले PDMS से साइटोटोक्सिक प्रभाव को कम करने के लिए। ध्यान दें कि यह पाक के कदम बैक्टीरियल कोशिकाओं को विषाक्तता को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. चिप विकास प्रयोग पर
    1. microfluidic युक्ति में लोड करने से पहले, 1 1 घंटे के लिए मानव संसाधन और M9 माध्यम के लिए विआयनीकृत पानी के साथ यह फ्लश।
    2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जमे हुए दैनिक नमूना गला लें और ताजा M9 मध्यम के साथ एक नया टेस्ट ट्यूब टीका लगाना। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर में नमूना रखें।
    3. M9 माध्यम के साथ माइक्रोबियल नमूना 10 गुना पतला और microfluidic डिवाइस में 5 साई माइक्रोबियल नमूना कंटेनर दबाव डाल द्वारा इसे लोड। तब TMP दवा लोड5 साई पर दवा मध्यम कंटेनर दबाव डाल द्वारा चिप में मध्यम। 15 मिनट के लिए microfluidic चिप पर दो कक्षों के बीच micromechanical वाल्व actuating द्वारा सूक्ष्म जीव और नशीली दवाओं के बीच मिश्रण का निष्पादन करें।
    4. माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर उलटा माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू में microfluidic चिप रखें। विकास कक्ष सीसीडी कैमरा के साथ 8 घंटे के लिए हर मानव संसाधन उलटा माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू में सेल छवि मोल।
    5. सेल छवि डेटा 18 पर एक सीमा एल्गोरिथ्म के माध्यम से सेल नंबर की गणना करने के लिए कस्टम कार्यक्रम स्क्रिप्ट का उपयोग करें। ध्यान दें कि सेल नंबर डेटा आम तौर पर तीन microfluidic कक्षों औसत रहे हैं।

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Representative Results

ऊपर वर्णित morbidostat चित्र 1 में schematized है। प्रयोगात्मक विकास, एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण और सेल आकृति विज्ञान की जाँच सहित आम morbidostat संचालन, एक ई में मान्य किया गया कोलाई MG1655 संस्कृति (TMP) trimethoprim से अवगत कराया, आमतौर पर इस्तेमाल किया एंटीबायोटिक दवा 5,6। TMP दवा प्रतिरोध में बहुत विशिष्ट चरणबद्ध बढ़ जाती है लाती है, और परिवर्तन के आसपास dihydrofolate रिडक्टेस (DHFR) जीन clustered रहे हैं। इसलिए, TMP morbidostat ऑपरेशन मान्य करने के लिए एक अत्यधिक प्रभावी मानक दवा है। प्रत्येक दिन, सूक्ष्म जीव पूर्व निर्धारित ऑप्टिकल घनत्व सीमा से ऊपर बढ़ने और के रूप में चित्रा 2A में दिखाया दवा इंजेक्शन को गति प्रदान करने की उम्मीद है। दवा इंजेक्शन विकास को बाधित करने की उम्मीद है और एक परिणाम के रूप में, ऑप्टिकल घनत्व में कमी। कई ट्रायल रन इष्टतम दवा एकाग्रता का निर्धारण करने की जरूरत हो सकती है। अंगूठे का एक नियम के रूप में, हम बढ़ानेई द्वारा दवा माध्यम की एकाग्रता लग रहा है कि दवा मध्यम विकास को दबाने के लिए विफल रहता है के बाद 5 गुना। प्रयोग के पूरे पाठ्यक्रम के बाद, दैनिक जमे हुए नमूने thawed और आईसी 50, दवा प्रतिरोध स्तर के एक मात्रात्मक उपाय निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। चित्रा 2 बी में भूखंड एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध में अस्थायी वृद्धि दर्शाता है। दवा प्रतिरोध लगभग वृद्धि हुई 1,500 गुना करने के लिए ~ 1000 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर से ज्यादा ~ 12 दिन, प्रयोगशाला विकास 5 में पिछले निष्कर्षों के साथ संगत और नैदानिक आइसोलेट्स 19। अंतिम दिन उत्परिवर्ती में DHFR बिंदु उत्परिवर्तन सेंगर अनुक्रमण द्वारा मापा गया और 2 टेबल में सूचीबद्ध हैं। एक उत्परिवर्तन प्रमोटर क्षेत्र पर स्थित पाया जाता है और यह संकेत करता है कि प्रमोटर क्षेत्र में एकल बिंदु उत्परिवर्तन काफी DHFR की अभिव्यक्ति के स्तर को बदल सकते हैं एंजाइम 20। स्थान 49,910 पर एक और उत्परिवर्तन DHFR के जीन क्षेत्र में स्थित है और अधिनियम के करीब हैDHFR की Ive साइट 21 एंजाइम। कई परिवर्तन के साथ दवा प्रतिरोध के अधिग्रहण, morbidostat की उपयोगिता साबित होता है के रूप में अगर प्लेट युक्त दवा पर चयन केवल एक उत्परिवर्तन प्रदान करने के लिए जाता है।

सेल आकृति विज्ञान का एक और अधिक संवेदनशील readout के रूप में, एंटीबायोटिक संवेदनशीलता के साथ एकल कोशिका आकृति विज्ञान की जांच के लिए एक समानांतर में किया जाता है, मल्टिप्लेक्स microfluidic मंच 14। चित्रा 3 मल्टिप्लेक्स microfluidic चिप के डिजाइन से पता चलता है। बैक्टीरियल कोशिकाओं की micrographs (चित्रा 5) TMP के उप निरोधात्मक सांद्रता के तहत दोनों जंगली प्रकार में परिवर्तन और आकृति विज्ञान उत्परिवर्ती उपभेदों प्रकट करते हैं। जंगली प्रकार उपभेदों महत्वपूर्ण filamentation दिखाने जबकि उत्परिवर्ती तनाव कोई महत्वपूर्ण filamentation पता चलता है। एक एकल कोशिका स्तर पर इस आकृति विज्ञान परिवर्तन एंटीबायोटिक प्रतिरोध का त्वरित निदान में इस्तेमाल किया जा सकता है। 4 प्रदर्शित करता है पर ची चित्राTMP के विभिन्न सांद्रता में पी विकास घटता। उत्परिवर्ती नमूना एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध में एक महत्वपूर्ण वृद्धि दर्शाता है। चित्रा 4 में पर चिप विकास डेटा भी प्लेट पाठक चित्रा 2 बी में दिखाया से आईसी 50 मूल्य के अनुरूप है।

आकृति 1
चित्रा 1:। Morbidostat के योजनाबद्ध morbidostat एक सतत संस्कृति डिवाइस है कि माइक्रोबियल आबादी के ऑप्टिकल घनत्व के उपाय, और तदनुसार दवा एकाग्रता समायोजित कर देता है। डिवाइस दवा इंजेक्शन मोड और दवा कमजोर पड़ने मोड में चलाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2 चित्रा 2: विकास की अवस्था और एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध स्तर की वृद्धि प्रतिक्रिया के तहत (ए) प्रतिनिधि विकास की अवस्था।। माइक्रोबियल विकास एंटीबायोटिक दवा है, जिसका इंजेक्शन एक सीमा एल्गोरिथ्म से शुरू हो रहा है से हिचकते हैं। जब सकारात्मक वृद्धि दर पूर्व निर्धारित सीमा से ऊपर ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट वें = 0.086) उठाती है, दवा इंजेक्शन मोड के लिए स्विच डिवाइस। अन्यथा, डिवाइस दवा कमजोर पड़ने मोड में चलाता है। लाल और बैंगनी तीर दवा इंजेक्शन और दवा कमजोर पड़ने मोड में स्विच संकेत मिलता है, क्रमशः। (ख) trimethoprim के लिए जोखिम के 12 दिनों के दौरान कोशिकाओं के प्रतिरोध स्तर। आईसी 50 एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध की एक अलग चरणबद्ध वृद्धि दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3: सेल आकृति विज्ञान और चिप पर एंटीबायोटिक संवेदनशीलता की जांच के लिए microfluidic उपकरणों (एक) चिप लेआउट की सूक्ष्मछवि।। हरे और नीले रंग के डिब्बों विकास और दवा मध्यम कक्षों, क्रमशः रहे हैं, और लाल लेआउट नियंत्रण परत को दर्शाता है। विकास कक्ष के आयामों 450 माइक्रोन (एल) x 400 माइक्रोन (डब्ल्यू) x 8 माइक्रोन (ज) कर रहे हैं। विकास कक्ष बैक्टीरिया के साथ भरी हुई है, और नशीली दवाओं के चैम्बर TMP के साथ भरी हुई है। स्केल बार 1 सेमी है। (ख) एक ही चिप के मद्देनजर बढ़ाया। स्केल बार = 500 माइक्रोन। (ग) से पहले बढ़ाया दोनों कक्षों के दृश्य और मिश्रण के बाद। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4: ई पर चिप विकास घटता (क) जंगली प्रकार पैतृक तनाव और (ख) (12 दिन) पर उत्परिवर्ती तनाव: कोली TMP के विभिन्न सांद्रता से अवगत कराया। उत्परिवर्ती नमूना एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध में एक महत्वपूर्ण वृद्धि दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: एकल सेल morphologies (एक - डी) TMP के उप निरोधात्मक स्तर के साथ उपचार के बाद सेल के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों। नोट में महत्वपूर्ण जंगली प्रकार की कोशिकाओं के filamentation (ख), जो म्यूटेंट में अनुपस्थित है (घ (ई - एच) (- डी ए) का डिजिटल चित्र हैं। सभी जीवाणु छवियों को एक 40x बढ़ाई उद्देश्य के साथ एक सीसीडी कैमरा द्वारा उठाए गए थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1:। आयामों और संस्कृति शीशी धारक की विधानसभा इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2:। एलईडी और photodetector के लिए सर्किट आरेख इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक कोड:। microfluidic चिप्स से अर्जित सेल छवियों से सेल नंबर गिनती करने के लिए कस्टम स्क्रिप्ट यहाँ इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

<टीडी> 15
नमूना TMP ड्रग (माइक्रोग्राम / एमएल)
दिन 1-3 0 0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32
4 दिन 0 1 2 3 5 10 20 40 80 160 320
दिन 5-7 0 2 4 8 30 60 120 240 480 960
दिन 8-12 0 3 7 15 30 60 125 250 500 1,000 2,000

तालिका 1:। ड्रग माइक्रोग्राम / एमएल की इकाई में आईसी 50 निर्धारित करने के लिए प्लेट पाठक माप दवा सांद्रता में इस्तेमाल एकाग्रता दैनिक जमे हुए नमूने के लिए प्रदर्शित कर रहे हैं। कोशिकाओं उच्च दवा प्रतिरोध का विकास, दवा का इस्तेमाल किया सांद्रता के हिसाब से बढ़ रहे हैं।

नहीं स्थान एसएनपी ध्यान दें
1 49,894 सी> टी
2 49,910 टी> एक DHFR जीन
3 49,795 सी> टी DHFR प्रमोटर

तालिका 2:। DHFR में उत्परिवर्तन सेंगर अनुक्रमण द्वारा की पहचान प्रतिनिधि अनुक्रम डेटा आखिरी दिन उत्परिवर्ती (12 दिन) में तीन DHFR बिंदु उत्परिवर्तन दिखा। प्रमोटर और जीन क्षेत्रों से एक और 2 SNPs, क्रमशः होते हैं। आगे और रिवर्स पीसीआर में इस्तेमाल प्राइमरों 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 'और 3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5' थे।

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Discussion

कम लागत वाली घटकों से एक कम पदचिह्न morbidostat डिवाइस प्रदर्शन किया है। डिवाइस द्वारा पंजीकृत दवा प्रतिरोध स्तर में वृद्धि पिछली रिपोर्टों 5 में से उन लोगों के साथ संगत कर रहे हैं। दवा प्रतिरोध के विकासवादी अध्ययन के लिए बनाया गया है, डिवाइस संभावित कई अन्य प्रयोगों के लिए लागू है। सबसे पहले, दवा प्रेरित परिवर्तन के लिए एक व्यापक डेटाबेस चिकित्सकीय प्रासंगिक एंटीबायोटिक दवाओं का एक बड़ा सेट के लिए स्थापित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कई दवा प्रतिरोध के विकासवादी मार्ग बस प्रयोग में इस्तेमाल दवाओं की संख्या में वृद्धि से अध्ययन किया जा सकता है। मॉड्यूल यहां बताया का मुख्य लाभ यह अपनी लचीली configurability, विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत बड़े पैमाने पर, समानांतर प्रयोगों को सक्षम करने के लिए है।

हालांकि अवधारणा microfluidics माप में प्रदर्शन किया गया था, खोजी शक्ति fluidic प्रौद्योगिकी 23 के साथ microfluidics के संयोजन से सुधार किया जा सकता है। लागत प्रतिमाप (पैमाने की अर्थव्यवस्था) नाटकीय रूप से कम अभिकर्मक की खपत और कम परिश्रम से कम है। इधर, एकल कोशिका आकृति विज्ञान डेटा microfluidic मंच से निकाला जा सकता है। हाल ही में, एकल कक्षों के microfluidic आकृति विज्ञान परीक्षण सफलतापूर्वक नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में लागू किया गया है, और मानक शोरबा धारावाहिक कमजोर पड़ने परीक्षण 24 को तुलनात्मक रूप से करता है। microfluidic उपकरणों की बढ़ती उपलब्धता के साथ, संयुक्त टेक्नोलॉजीज बड़े पैमाने पर, उच्च throughput प्रयोगशाला विकास प्रयोगों में सक्षम होगा।

कई कदम morbidostat चलाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, क्योंकि चुंबकीय सरगर्मी इकाई मैग्नेट और एक ठंडा प्रशंसक से बनाई है, यह महत्वपूर्ण संस्कृति शीशी प्रशंसक की शाफ्ट के लिए पंक्ति में है। इसके अलावा, संस्कृति शीशी और चुंबक के बीच की दूरी एक स्थिर संचालन सुनिश्चित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। दूसरे, प्रत्येक दिन के प्रयोग की शुरुआत में एक नई संस्कृति शीशी के लिए स्विचन भी करने के लिए महत्वपूर्ण हैbiofilm गठन से बचें। अन्यथा, biofilm गठन 2 या 3 दिन के भीतर हो सकता है। तीसरा, क्योंकि ई कोलाई नमूने प्रत्येक दिन के प्रयोग के दौरान एक जमे हुए नमूना से दैनिक thawed हैं स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए है, यह कम से कम 4 घंटे की देरी की अवधि निर्धारित करने के लिए रोगाणुओं से बाहर कुल धोने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, एक ई फ्रीज करने के लिए नहीं चुन सकते हैं कोली के नमूने और सीधे एक नई संस्कृति शीशी टीका लगाना एक नई संस्कृति शुरू करने के लिए नमूना का उपयोग करें।

एक व्यावहारिक सेटिंग में, वर्तमान प्रणाली के डिजाइन अपनी क्षमता का विस्तार करने के लिए usages के कई सीमाओं को दूर करना होगा। पूरी व्यवस्था की मात्रा वर्तमान में मध्यम प्रति दिन भस्म द्वारा सीमित है (chemostatic आपरेशन के दौरान, एक संस्कृति शीशी 0.33 मानव संसाधन -1 की खासियत कमजोर पड़ने दर पर प्रति दिन माध्यम के लगभग 0.5 एल सेवन करती है)। काम की मात्रा को कम करने के लिए, आगे अनुकूलन plumbi के साथ दवा-हिचकते जनसंख्या गतिशीलता पर सावधान अनुकरण करके प्राप्त किया जा सकता हैएनजी मापदंडों 25।

अंत में, morbidostat आसानी से जीवाणु संस्कृति प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूल है। उदाहरण के लिए, एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड संलग्न करके, प्रणाली एक तस्वीर के रूप में बायोरिएक्टर फिर विन्यस्त किया जा सकता है, cyanobacteria या सूक्ष्म शैवाल 26 के विकासवादी निगरानी सक्षम करने से। मॉड्यूल wirelessly एक बैटरी पैक में डिवाइस ऑपरेटिंग द्वारा Adsorbents के साथ एक गैस तंग कंटेनर में अवायवीय और microaerobic खेती करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। एक और उदाहरण के रूप में, एक विष की एकाग्रता धीरे-धीरे दबाव है कि लक्ष्य रासायनिक 27 के लिए प्रतिरोधी रहे इंजीनियर के लिए बढ़ाया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Environmental Shaker Incubator BioSan ES-20
Arduino Leonardo board Arduino Leonardo
680 Ohm Carbon Resistor Digikey Bias resistor for LED
100k Ohm Carbon resistor Digikey Bias resistor for phototransistor
940 nm light emitting diode Bright LED Electronic BIR-BM13E4G-2 Optical density measurement
940 nm phototransistor Kodenshi  ST-2L2B Optical density measurement
Darlington pair IC Toshiba Mouser ULN2803APG this IC drives micropumps and magnetic stirring unit
5 V DC brushless fan ADDA AD0405LX-G70 spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com
Piezoelectric micropump CurieJet PS15I-FT-5L Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min
Tygon 3350 Tuning Saint Gobain ABW00001 ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' 
Magnetic Stir bar COWIE tapered shape dim: 10 mm x 4 mm
Glass scintillation 20 ml vial DGS Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height)
Culture vial holder Custom made from Polyformaldehyde 
Silicone Dow Corning Sylgald 184 used to seal the glass vial
Medium bottle VWR 66022-065
Difco M9 minimal salt 5x BD Medium
Cadamino Acid BD Medium
glucose Sigma
Agar Bateriological Oxoid for agar plate
Luria Bertani medium
Inverted microscope Leica Microsystems Leica DMI-LED used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55
Microscope Incubator Live Cell Instrument CU-109 used for microfluidic measurement
Solenoidal valves Pneumadyne S10MM-31-12-3 Normally open 1.3 Watt 12 Vdc
USB interface card Hobby Engineering USBIO24-R Digital I/O Module  for microfluidics measurement
Air compressor Rocker Scientific ROCKER 440 Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi
Male luer-lock fittings to 1/8" barb ValuePlastics.com MTLL230-1 used for microfluidic control
1/8" barb to 10-32 threaded port ValuePlastics.com B-1 used for microfluidic control
Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port ValuePlastics.com KFTL-1 used for microfluidic control
NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) DigiKey.com 2N6427GOS-ND used for microfluidic control
10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W DigiKey.com P10KBACT-ND used for microfluidic control
Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% DigiKey.com 478-1841-ND used for microfluidic control
Andor CCD camera Andor Zyla 4.2 Plus SCMOS used for microfluidic on chip imaging
ELISA plate reader
two component Silicone  Momentive RTV 615 used for microfluidic chip fabrication
SU-8 photoresist Micrchem SU8 2015 used for microfluidic chip fabrication
AZ4620 photoresist Clariant AZ 4620 used for microfluidic chip fabrication
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC 32G used for microfluidic chip fabrication
20 Gauge Syringe Needle BD used for microfluidic chip fabrication
Labcycler Sensoquest Labcycler PCR
DNA polymerase Toyobo KDO Plus PCR amplification
Trimethoprim Sigma
Plate reader Biotek Synergy H1 hybrid  antibiotic resistane measurement

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References

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आनुवंशिकी अंक 115 chemostat एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध माइक्रोबियल पारिस्थितिकी अनुकूली विकास morbidostat अवरोध एकाग्रता जीवाणु संस्कृति जैव अभियांत्रिकी
डिजाइन और एक कम लागत का उपयोग, बैक्टीरिया की अनुकूली विकास के लिए एंटीबायोटिक दवा चयन के तहत स्वचालित Morbidostat
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Liu, P. C., Lee, Y. T., Wang, C. Y., … More

Liu, P. C., Lee, Y. T., Wang, C. Y., Yang, Y. T. Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection. J. Vis. Exp. (115), e54426, doi:10.3791/54426 (2016).

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