Abstract
Vi beskriver en lav kostnad, konfigurerbar morbidostat for å karakterisere den evolusjonære vei av antibiotikaresistens. Den morbidostat er en bakteriekultur enhet som kontinuerlig overvåker bakterievekst og dynamisk justerer legemiddelkonsentrasjonen å stadig utfordre de bakteriene som de utvikler seg til å erverve resistens. Enheten har et arbeidsvolum av ~ 10 ml og er helautomatisk og utstyrt med optisk tetthet måling og mikro-pumper for medium og levering av legemidler. For å validere plattformen, målte vi trinnvis oppkjøp av trimetoprim motstand i Escherichia coli MG 1655, og integrert enhet med en multiplekset microfluidic plattform for å undersøke celle morfologi og antibiotika mottakelighet. Tilnærmingen kan være opp-skalert til laboratoriestudier av antibiotika narkotika motstand, og er utbyggbar adaptive evolusjon for belastningsskader forbedringer i metabolske engineering og andre bakteriekultur eksperimenter.
Introduction
Siden innføringen av de første antibiotikum stoffet penicillin, og mikrobiell resistens utviklet seg til et globalt helseproblem 1. Selv om oppkjøpet av antibiotikaresistens kan retrospektivt studert in vivo, er betingelsene for disse forsøkene ofte ikke kontrollert gjennom hele evolusjonen to. Alternativt kan adaptive laboratorium evolusjon avsløre molekylær evolusjon av en mikrobiell arter under miljømessige påkjenninger eller utvalg press fra en antibiotika narkotika tre. Nylig har mange velkontrollerte evolusjonseksperimenter av antibiotisk medikamentresistens belyst fremveksten av antibiotisk resistens. For eksempel, Austin gruppe demonstrert raske fremveksten i en skikkelig konstruert microfluidic compartmented miljø fire. Det nyutviklede morbidostat induserer systematiske mutasjoner i henhold til narkotikaseleksjonstrykk 5,6. Den morbidostat, en mikrobiell selecsjon anordning som kontinuerlig justerer antibiotisk konsentrasjon for å opprettholde en nesten konstant befolkning, er et stort fremskritt fra fluktuasjonsprøven brukes i mikrobiologi 7,8. I fluktuasjonsprøven er et antibiotisk stoff injisert ved høy konsentrasjon, og de overlevende mutanter er vist og telles. I stedet er mikrober i en morbidostat stadig utfordret og skaffe flere mutasjoner.
Den morbidostat virker på samme kjemostat, en dyrkingsanordning oppfunnet av Novick og Szliard i 1950 som opprettholder en konstant befolkning ved kontinuerlig tilførsel av næringsstoffer samtidig fortynning av den mikrobielle populasjonen 9. Siden lanseringen har kjemostaten er avansert og forbedret. Nåværende microfluidic chemostats har nådd nanoliter og encellede kapasiteter. Men disse enhetene er uegnet for adaptive evolution eksperimenter, som krever en stor celle befolkning med mange mutasjon hendelser 10,11. Nylig, mini-chemostats med arbeidsmengder ~ 10 ml har også blitt utviklet for å fylle gapet mellom liters skala bioreaktorer og microfluidic kjemostat 12,13.
Her presenterer vi utforming og bruk av en lav-kost, automatisert morbidostat for en antibiotika resistens studien. Den foreslåtte Modulen kan anvendes i en rysteinkubator i en mikrobiologisk laboratorium med minimal maskinvare krav. Open-source firmware er også lett tilpasses til spesifikke anvendelser av adaptiv evolusjon, som for eksempel metabolsk ingeniør tre. Til slutt blir morbidostat integrert i en multiplekset mikrofluid plattform for antibiotisk resistenstesting 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montering og pretesting av Morbidostat Device
- Montering av Morbidostat
- Punch 3 hull på hetten av kulturen hetteglass med en 18 G sprøytespissen. Skjær tre stykker av polyetylenrør ~ 7 cm i lengde. Sette inn disse tre stykker av polyetylenrør på hetten.
- Bruk tape til å vikle kanten av lokket for å tjene som støpt for polydimethylsiloxane (PDMS) blanding. Bland 5 g av komponent A og 0,5 g av B-komponenten av PDMS i et 150 ml plastbeholder ved omrøring manuelt med en tannpirker. Installering av blandingen inn i en 10 ml sprøyte.
- Hell blandingen PDMS på hetten med sprøyten. Stek hele lokket for å kurere PDMS i 8 timer i ovnen ved 70 ° C.
- Lodd LED anode med 24 gauge og LED katode med carbon motstander med en loddebolt. Lodd en 680 Ω karbon motstand med en 24 G wire. Isoler kabeltilkobling ved hjelp av elektrisk tape.
- Sålder kollektoren til fotodetektoren med 24 G ledning og emitteren til fotodetektoren med en 100 kohm karbonmotstand. Isoler kabeltilkobling ved hjelp av elektrisk tape.
- Plasser light emitting diode i kultur hetteholderen. Ved å følge koblingsskjema i Tilleggs figur 2, kobler lysdiode og kraft det med en strømforsyning på 5 V. Kontroller at LED fungerer ved hjelp av et digitalt kamera som kan registrere IR (for eksempel en mobiltelefon kamera).
- Plasser fotodetektoren i kultur hetteholderen. Ved å følge koblingsskjema i Tilleggs figur 2, kobler fotodetektoren og makt den med en strømforsyning på 5 V. Koble ledningen til begge sider av fotodetektor motstander å måle spenningen over den elektroniske kontrollkortet.
- Lim en magnet på akselen av kjøleviften, som fungerer som den magnetiske røreenheten. Merk at alignment av akselen av den vifte til kulturen ampulle, og rommet mellom kultur hetteglasset og magneten er meget viktig for riktig funksjon av den magnetiske røreenheten.
- Koble hver bit av polyetylen rør av kulturen hetteglasset til den tilsvarende del av silikonslanger for mikro-pumper, mellom flasker, og avfallsflaske. Skru på pumpen i 1 time og måle det totale volum som pumpes fra mediet flasken til kulturflaske for å bestemme pumpens hastighet. Legg merke til at den typiske pumpehastigheten bør være ~ 4 ml / time, noe som tilsvarer den fortynningshastigheten D = 0,33 t -1 for et 12 ml arbeidsvolum av kulturen ampullen.
- Plasser hele forsamlingen på en mellomstor (34 cm x 34 cm x 43,5 cm) shaker kuvøse.
- PreTesting den Morbidostat
- Sett strømspenning kult fan til 5 V til å starte sin motor for å teste magnetisk rørestav. Merk at røring handlingen kan inspiseres visuelt. Spenningen som kjørers kjøleviftemotoren er nettopp kontrollert av pulsbreddemodulering (PWM).
- Forbered en serie av vill type E. coli-prøver med optiske densiteter ved 600 nm typisk i området 0,07 til 0,3 for kalibrering. Plasser en test E. coli prøven i kultur hetteglasset og registrere fotodetektoren spenning.
- Stedet ~ 100 ul av den samme prøven i plateavleseren og registrere den optiske tetthet. Bruk fotodetektoren spenning mot data optisk tetthet å plotte kalibreringskurven. Legg merke til at vanligvis en enhet endring i optisk tetthet svarer til ~ 7,6 V endring i fotodetektoren med skjevhet ordningen brukes her.
2. Kjøre Morbidostat
- Forberedelser Før start Daily Experiment
- Klargjør kulturen hetteglasset med tre ultrakjemikaliebestandige Tygon-rør med indre diameter 1/32 tomme og en ytre diameter på 3/32 tomme for innløpene for å danne Anordning i seksjon1,1 og i Tilleggs figur 1.
- Klargjør M9 minimal medium (0,2% glukose) og trimetoprim (TMP) legemiddel som inneholder medium. Sterilisere medium, mediet flasken, stoffet medium flasken, avfallsflasken, og kulturen hetteglasset i en autoklav ved 121 ° C.
MERK: TMP er en stamoppløsning som brukes for senere å oppnå konsentrasjonene i tabell 1 og TMP-medikamentholdige medium er ikke autoklaveres.
- Kjøre Morbidostat
- På den første dag av eksperimentet, tine 1 ml av frossen villtype E. coli-celler MG1655 i 5 min ved romtemperatur og overføre 120 ul av cellene til kulturen ampulle inneholdende ~ 12 ml M9 vekstmedium. Etter den første dag, tiner 1 ml av frossen E. coli-celler fra den foregående dag i 5 minutter og overføre 120 ul av cellene til en ny kultur rør inneholdende ~ 12 ml M9 vekstmedium.
- Slå på shaker inkubator og sette tempe ratur til 30 ° C uten risting.
- Start morbidostat operasjon ved å slå på mikropumpe, den magnetiske røreenheten, og den optiske tetthet måling.
NB: Under drift blir en tilbake terskel algoritme som brukes til å styre sprøyte. Når den målte optisk tetthet skrider en forhåndsinnstilt terskel, ville sprøytepumpen slås på og bærerpumpen vil bli slått av. Ellers forblir injeksjonspumpen av og mediet pumpen er på. - Overvåke spenningen fra tid til annen for å sikre at det er mikrobiell vekst.
Merk: På grunn av fryse og tine syklus, E. coli-celler utviser en forsinkelse på ~ 4 timer i løpet av hver dag vekst. - Etter ~ 23 timer, stoppe mikro-pumpen ved å skru av forsyningsspenningen og ta ut kulturen hetteglasset. Tilsett 15% glycerol i kulturen hetteglasset fryse og prøven ved -80 ° C for lagring.
- Gjenta trinn 2.2.1 til 2.2.5.
MERK: Utfør veksten måling i en plateleser med en 96 brønn format for å bestemme antibiotisk motstandsnivå.
- Tine den daglige frosne prøve ved romtemperatur i 5 min og overfør 15 pl av celle til kulturen ampulle inneholdende ~ 15 ml M9-medium. Tillate dem å vokse inntil den optiske tettheten ved 600 nm har nådd ~ 0,1. Fordel de 15 ml i 1 ml flasker og tilsett TMP narkotika på dette trinnet for å oppnå de ønskede medikamentkonsentrasjoner som vist i tabell 1.
- Ta 200 mL av prøven fra trinn 3,1 og legg i hver brønn i plateleser og tillate dem å vokse i 12 timer 5. Den optiske densitet ved bølgelengden 600 nm blir registrert automatisk under målingen.
MERK: For hvert datapunkt, er tredoble målinger registreres og gjennomsnitt for å sikre konsistens av dataene. Dataene på optisk tetthet versus tid kan be anvendt for å oppnå veksttakten. - Plott vekstraten data versus medikamentkonsentrasjonen for å få IC 50. Legg merke til at IC50 er definert som den medikamentkonsentrasjonen ved hvilken veksthastigheten er femti prosent av den maksimale veksthastighet 5.
4. enkelt celle morfologi og Antibiotika Følsomhet Måling i microfluidic enheter
- Utfør fabrikasjon av microfluidic enheter via flerlags myk litografi fra PDMS som beskrevet andre steder 15.
- Benytte fotolitografi for å lage det fotoresistente støpeform for styre- og strømnings lag. Legg merke til at for kontroll lag, bruker negative fotoresist-(~ 15 mikrometer høyde) og positiv fotoresist (~ 8 mikrometer høyde) for å fremstille en støpeform på en naken silisiumskive.
- Forbered PDMS blandinger med tverr linking-forhold på 5: 1 og 20: 1 for kontrollaget og strømningssjiktet, henholdsvis. Sette blandingen inn i en eksikator under vakuum for å fjerne eventuelle bobler, I 1 time.
- Expose kontroll lag fotoresist muggsopp på silisium wafer til trimetylklorsilan (TMCS) damp. Gjøre kontrollen lag av ~ 6 mm tykkelse ved støping av PDMS-blanding (med tverrbindingsforholdet 5: 1) på silikonplaten på kontroll lag fotoresist mugg. Bake styresjiktet i 40 minutter ved 80 ° C i 1 time i ovnen.
- Gjøre strømn lag ved spinnbelegging en PDMS blanding (med tverrbindingsforholdet 20: 1, sentrifugehastighet 3000 rpm i 60 sek) på en strømnings lag fotoresist mugg. Bake strømnings lag i 30 minutter ved 80 ° C i 1 time i ovnen.
- Bruk et barberblad for å kutte styrings lag i ønsket chip størrelse (typisk 3 cm x 2 cm) og manuelt skrelle av kontroll lag. Plassere kontroll lag på toppen av strømnings lag og justere dem under et stereomikroskop. Kurere den innrettede sammenstillingen ved 80 ° C i ovnen over natten. Etterpå kan suge sammenstillingen i 250 ml deionisert vann i en plastbeholder i 5 timer for å oppløse det gjenværende TMCS.
- Deretter slag innløpshullene med 20 g nåler og binde hele elastomeren til en glassplate belagt med en blank PDMS lag (PDMS kryssbindingsforhold 5: 1, sentrifugehastighet 2000 rpm i 30 sek) ved luft plasmabehandling i 40 sekunder ved 1,2 Torr lufttrykk.
- Gjennomføre omfattende baking for 36 timer ved 80 ° C for å redusere de cytotoksiske effekter fra PDMS. Merk at dette baketrinn er kritisk for å redusere toksisiteten til de bakterielle celler.
- På Chip Vekst Experiment
- Før du legger inn i microfluidic enhet, skylle den med avionisert vann i 1 time og M9 medium for en time.
- Tine den daglige frosne prøve ved romtemperatur i 5 min og inokulere et nytt reagensrør med frisk M9 medium. Plasser prøven i en risteinkubator ved 37 ° C over natten.
- Fortynn den mikrobielle prøven 10 ganger med M9 medium og legger det inn i microfluidic enheten ved å presse den mikrobielle prøvebeholderen ved 5 psi. Deretter laster TMP narkotikamedium inn i brikken ved å presse de medikamentmediet beholderen ved 5 kPa. Utføre blande mellom mikroben og medikament ved betjening av mikromekanisk ventil mellom de to kammere på den mikrofluid brikken i 15 min.
- Plasser microfluidic brikken i mikroskopet inkubator montert på invertert mikroskop. Erverve cellen bildet i vekstkammeret hver time i 8 timer med CCD-kamera montert på invertert mikroskop.
- Bruk tilpassede program skript for å beregne celle tall gjennom en terskel algoritme på mobilbildedata 18. Merk at celletalldata gjennomsnitt vanligvis over tre microfluidic kamre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ovenfor beskrevne morbidostat er skjematisert i figur 1. De felles morbidostat operasjoner, deriblant eksperimentell utvikling, antibiotika resistenstesten og cellemorfologi kontroll, ble validert i et E. coli MG1655 kultur utsettes for trimetoprim (TMP), en vanlig brukt antibiotisk medikament 5,6. TMP induserer svært karakteristiske trinnvise økninger i legemiddelresistens, og mutasjonene er gruppert rundt dihydrofolatreduktase (DHFR) gen. Derfor er TMP en svært effektiv standard medikament for validering av morbidostat operasjonen. Hver dag, blir mikroben ventet å vokse over den innstilte terskeltettheten optisk og utløse sprøyte som vist i figur 2a. Stoffet injeksjon er ventet å inhibere veksten og som et resultat redusere den optiske tetthet. Flere prøvekjøringer kan være nødvendig for å fastslå den optimale legemiddelkonsentrasjon. Som en tommelfingerregel, increas vie konsentrasjonen av medikamentet medium med 5 ganger etter å finne at stoffet mediet ikke klarer å undertrykke veksten. Etter at hele forløpet av eksperimentet, er daglige frosne prøvene ble tint og anvendt for å bestemme IC50, et kvantitativt mål på legemiddelresistens nivå. Plottet i Figur 2b viser det tidsmessige økningen i antibiotisk resistens. Stoffet motstand økt ca 1500 ganger til ~ 1000 mikrogram / ml i løpet av ~ 12 dager, i samsvar med tidligere funn i laboratorium evolusjon 5 og klinisk isolater 19. DHFR-punktmutasjoner i den siste dagen mutant ble målt ved hjelp av Sanger-sekvensering og er oppført i tabell 2. En mutasjon er funnet ligger på promotorområdet og viser at enkeltpunktmutasjon i promotorområdet kan i betydelig grad endre ekspresjonsnivået av DHFR enzym 20. En annen mutasjon ved plassering 49910 ligger i genet regionen DHFR og er nær handlingenive stedet av DHFR enzym 21. Oppkjøpet av legemiddelresistens med flere mutasjoner beviser nytten av morbidostat, som utvalget på stoffet inneholder agar plate har en tendens til å gi bare enkelt mutasjon.
Som et mer følsomt avlesning av cellemorfologi, blir enkelt-celle-morfologi sjekk med antibiotisk resistens utført i et parallelt, multiplekset mikrofluid plattformen 14 Fig. 3 viser utformingen av den multipleksfordelte mikrofluid chip. Mikrografer av bakterieceller (figur 5) avsløre morfologi endringer i både villtype og mutant stammer henhold sub-hemmende konsentrasjoner av TMP. Villtype stammer vise betydelig fila mens mutantstammen ikke viser fila. Denne morfologi endring av celle-nivå kan brukes i rask diagnostisk av antibiotikaresistens. Figur 4 viser den på-chip vekstkurver ved forskjellige konsentrasjoner av TMP. Mutanten Prøven viser en betydelig økning i antibiotisk resistens. Den på brikken vekst av data i figur 4 er også i overensstemmelse med IC50-verdien fra den plateavleseren som vises i figur 2b.
Fig. 1: Skjematisk av morbidostat Den morbidostat er en kontinuerlig dyrkingsanordning som måler den optiske tetthet av tarmfloraen, og følgelig regulerer medikamentkonsentrasjonen. Enheten kjører i narkotika-injeksjon modus og narkotika-fortynning modus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Vekst kurve og økning av antibiotika resistens nivå (a) representant vekstkurve etter tilbakemeldinger.. Den mikrobielle veksten hemmes av det antibiotiske stoff, hvis injeksjon utløses av en terskel algoritme. Når den positive veksten øker optisk tetthet over innstilt terskel (OD TH = 0,086), bytter enheten til narkotika-injeksjon modus. Ellers går enheten i narkotika-fortynning modus. Rød og lilla piler indikerer bytte til sprøyterom og legemiddelfortynning moduser, henholdsvis. (B) Bestandighet nivå av cellene i løpet av 12 dager med eksponering til trimetoprim. IC 50 viser en tydelig trinnvis økning av antibiotika resistens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
t = "Figur 3" src = "/ files / ftp_upload / 54426 / 54426fig3.jpg" />
Figur 3: mikrofluid anordninger for å undersøke cellemorfologi og on-chip antibiotika resistens (a) Micrograph av brikken layout.. Grønne og blå kamrene er vekst- og medikament mellomkamrene, henholdsvis, og den røde oppsettet betegner kontrollaget. Dimensjonene av vekstkammeret er 450 um (l) x 400 um (w) x 8 um (h). Vekstkammeret er lastet med bakterier, og medisinkammeret er lastet med TMP. Scale bar er 1 cm. (B) Forstørret riss av den samme brikke. Scale bar = 500 mikrometer. (C) Forstørret visning av begge kamre før og etter blanding. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
"Src =" / files / ftp_upload / 54426 / 54426fig4.jpg "/>
Figur 4: On-chip vekstkurver av E. coli eksponert for forskjellige konsentrasjoner av TMP: (a) vill-type anen strekk og (b) mutantstamme (på dag 12). Mutant utvalg viser en betydelig økning i antibiotika resistens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Single-celle morfologi (a - d) Bright felt bilder av cellen etter behandling med sub-hemmende nivåer av TMP. Legg merke til den betydelige filamentering av villtypeceller i (b), som er fraværende i mutantene (d (e - h) er digitaliserte bilder av (a - d). Alle bakterie bildene ble tatt av en CCD-kamera med 40X forstørrelse objektiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Figur 1:. Dimensjonene og montering av kultur hetteholderen Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Figur 2:. Koblingsskjemaet for LED og fotodetektoren Klikk her for å laste ned denne filen.
tilleggskode. Custom script å telle celle nummer fra de oppkjøpte celle bildene fra microfluidic chips Klikk her for å laste ned denne filen.
| Prøve | TMP Drug (mikrogram / ml) | |||||||||||
| dag 1-3 | 0 | 0,06 | 0,12 | 0,25 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | |
| dag 4 | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | |
| dag 5-7 | 0 | 2 | 4 | 8 | <td> 1530 | 60 | 120 | 240 | 480 | 960 | ||
| dag 8-12 | 0 | 3 | 7 | 15 | 30 | 60 | 125 | 250 | 500 | 1000 | 2000 | |
Tabell 1:. Drug konsentrasjon anvendes for å bestemme IC50 i plateleser måling medikamentkonsentrasjoner i enhet ug / ml er vist for den daglige frosne prøve. Etter hvert som cellene utvikles høyere medikamentresistens, er medikamentkonsentrasjonene som benyttes økes tilsvarende.
| Nei | Plassering | SNP | Notat |
| 1 | 49894 | C-> T | |
| 2 | 49910 | T-> A | DHFR-gen |
| 3 | 49795 | C-> T | DHFR promoter |
Tabell 2:. Mutasjon i DHFR identifiseres ved Sanger-sekvensering De representative sekvensdata viser de tre DHFR punktmutasjoner i den siste dag mutant (dag 12). Promotoren og genområder inneholde ett og 2 SNP'er, respektivt. Forover- og revers primere som brukes i PCR var 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 'og 3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En lav-fotavtrykk morbidostat enheten fra rimelige komponenter er demonstrert. Økningen i narkotikamotstandsnivå er registrert av enheten er i samsvar med tidligere rapporter 5. Designet for evolusjonære studier av legemiddelresistens, er enheten potensielt gjelder for mange andre eksperimenter. Først kan bli etablert en omfattende database over narkotikainduserte mutasjoner for et stort sett med klinisk relevante antibiotika. For eksempel kan den evolusjonære pathway av multippel legemiddelresistens bli studert ved å øke antallet av legemidler som brukes i eksperimentet. Den største fordelen av modulen rapportert her er den fleksible konfigurasjonsmuligheter, slik at store, parallelle eksperimenter under ulike eksperimentelle forhold.
Selv om konseptet ble demonstrert i MicroFluidics målinger, kan den undersøkende effekt forbedres ved å kombinere MicroFluidics med fluidic teknologi 23. Kostnaden permåling (stordriftsfordeler) er dramatisk redusert med senket reagent forbruk og redusert arbeidskraft. Her kan enkelt celle morfologi data hentes ut fra den mikrofluid plattformen. Nylig microfluidic morfologi testing av enkeltceller har blitt implementert i kliniske mikrobiologiske laboratorier, og utfører sammenlign til standard buljong serieutvannings tester 24. Med den økende tilgjengeligheten av microfluidic enheter, vil kombinert teknologi gjør store, high-throughput laboratorium evolusjon eksperimenter.
Flere trinn er avgjørende for å kjøre morbidostat. For det første, fordi den magnetiske røreenheten er dannet av magneter og en kjølevifte, er det viktig å innrette skaftet av viften til kulturen hetteglasset. Dessuten er avstanden mellom kulturen hetteglasset og magneten meget kritisk for å sikre en stabil drift. For det andre, å bytte til en ny kultur hetteglasset i begynnelsen av hver dag eksperiment er også viktig åunngå biofilmdannelse. Ellers kan biofilmdannelse skje i løpet av 2 eller 3 dager. For det tredje, fordi E. coli-prøver blir tint daglig fra en frossen prøve i løpet av hver dags forsøk for å sikre konsistens, er det viktig å sette en forsinkelsesperiode på minst 4 timer for å unngå en total vasking av mikrobene. Alternativt kan man velge ikke å fryse E. coli-prøver og direkte bruke eksempel å vaksinere en ny kultur hetteglasset for å starte en ny kultur.
I en praktisk innstilling, må dagens system design vinne flere begrensninger for å utvide sine potensielle bruksområder. Volumet av hele systemet er for tiden begrenset av det medium som forbrukes per dag (under chemostatic drift, forbruker en kultur hetteglass omtrent 0,5 liter medium per dag på typisk fortynningshastighet på 0,33 h-1). For å redusere arbeidsvolumet, kan ytterligere optimalisering oppnås ved forsiktig simulering på narkotika hemmet populasjonsdynamikk med plumbing parametere 25.
Endelig er det morbidostat enkelt tilpasses et bredt spekter av bakteriekultur eksperimenter. For eksempel ved å feste en lysdiode, systemet kan konfigureres som en foto-bioreaktor, slik at den evolusjonære overvåking av cyanobakterier eller mikroalger 26. Modulen kan utvides til anaerob og microaerobic dyrking i et gasstett beholder med adsorbenter av trådløst bruker enheten i en batteripakke. Som et annet eksempel kan konsentrasjonen av et toksin gradvis økes til ingeniør stammer som er resistente mot målet kjemisk 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
- Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
- Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
- Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
- Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. Digital image using Matlab processing. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).
- Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
- Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
- Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
- Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
- Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
- Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
- Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
- Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
- Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).
