Abstract
Wir beschreiben eine kostengünstige, konfigurierbar morbidostat für den Evolutionsweges der Antibiotikaresistenz zu charakterisieren. Die morbidostat ist eine bakterielle Kulturvorrichtung, die kontinuierlich das Bakterienwachstum überwacht und reguliert dynamisch die Arzneimittelkonzentration, die Bakterien ständig herausfordern, wie sie Arzneimittelresistenz zu erwerben entwickeln. Das Gerät verfügt über ein Arbeitsvolumen von ca. 10 ml und ist voll automatisiert und mit Messung der optischen Dichte und Mikropumpen für mittlere und Medikamentenabgabe ausgestattet. Um die Plattform zu validieren, maßen wir die schrittweise Übernahme von Trimethoprim Resistenz in Escherichia coli MG 1655 und integriert , um die Vorrichtung mit einer Mikrofluidik - Multiplex - Plattform Zellmorphologie und Antibiotikaempfindlichkeit zu untersuchen. Der Ansatz kann auf Laboruntersuchungen von Antibiotika-Resistenzen hochskaliert werden, und ist verlängerbar Evolution für Stamm Verbesserungen in Metabolic Engineering und andere Bakterienkultur Experimente adaptiv.
Introduction
Seit der Einführung des ersten Antibiotikums Penicillin hat mikrobielle Antibiotika - Resistenz in ein Problem der globalen Gesundheit entwickelt 1. Obwohl der Erwerb von Antibiotika - Resistenzen können nachträglich in vivo untersucht werden, werden die Bedingungen dieser Versuche häufig nicht während der gesamten Evolution 2 gesteuert. Alternativ können adaptive gerichtete Evolution offenbaren die molekulare Evolution einer mikrobiellen Spezies unter Umweltbelastungen oder Selektionsdruck aus einem Antibiotikum 3. In jüngster Zeit haben viele gut kontrollierten evolutionäre Experimente von Antibiotika-Resistenzen, die Entstehung von Antibiotika-Resistenzen aufgeklärt. Zum Beispiel zeigte Austin Gruppe rasche Entwicklung in einem richtig entwickelt mikrofluidische compartmented Umwelt 4. Die neu entwickelte morbidostat induziert systematische Mutationen unter Drogenselektionsdruck 5,6. Die morbidostat, eine mikrobielle selecGerät werden , die die Antibiotika - Konzentration kontinuierlich einstellt eine nahezu konstante Bevölkerung zu erhalten, ist ein großer Fortschritt von der Fluktuationstest in der Mikrobiologie verwendeten 7,8. Im Fluktuationstest, ein Antibiotikum Medikament wird in hoher Konzentration injiziert, und die überlebenden Mutanten werden gesiebt und gezählt. Stattdessen Mikroben in einem morbidostat werden ständig in Frage gestellt und mehrere Mutationen erwerben.
Die morbidostat arbeitet ähnlich der Chemostat, eine Kulturvorrichtung von Novick und Szliard 1950 erfunden , die Nährstoffe durch kontinuierliche Zufuhr während Verdünnen der Mikrobenpopulation 9 eine konstante Population aufrecht erhält. Seit seiner Einführung hat sich die Chemostat wurde weiterentwickelt und verbessert. Aktuelle mikrofluidischen Chemostate haben Nano- und Einzelzellen-Kapazitäten erreicht. Jedoch sind diese Vorrichtungen nicht für adaptive Evolutionsexperimenten, die eine große Zellpopulation mit vielen Mutationsereignisse 10,11 erfordern. Vor kurzem Mini-Chemostate mit einem Arbeitsvolumen von ca. 10 ml wurden ebenfalls entwickelt in den Spalt zwischen Liter Bioreaktoren und der mikrofluidischen chemostat 12,13 zu füllen.
Hier präsentieren wir das Design und die Verwendung eines Low-Cost, automatisierte morbidostat für ein Antibiotikum drug resistance Studie. Das vorgeschlagene Modul kann mit minimalen Hardware-Anforderungen in einem Schüttelinkubator in einem mikrobiologischen Labor eingesetzt werden. Die Open-Source - Firmware auch leicht an spezifische Anwendungen der adaptiven Evolution zugeschnitten, wie Metabolic Engineering 3. Schließlich wird die morbidostat in ein Multiplex - Mikrofluidik - Plattform integriert für die Antibiotika - Resistenzprüfung 14.
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Protocol
1. Montage und Vortests des Morbidostat Geräte
- Die Montage des Morbidostat
- Lochen 3 Löcher auf der Kappe des Kulturfläschchen mit einer 18 G Spritzennadel. Schneiden drei Stück Polyethylenschlauch ~ 7 cm in der Länge. Legen Sie diese drei Stücke aus Polyethylenschlauch auf der Kappe.
- Verwenden Sie Klebeband den Rand der Kappe zu wickeln, wie die Besetzung für das Polydimethylsiloxan (PDMS) Mischung zu dienen. Mischungs 5 g A-Komponente und 0,5 g B-Komponente der PDMS in einem 150 ml Kunststoffbehälter durch manuelles Rühren mit einem Zahnstocher. Laden des Gemischs in eine 10 ml Spritze.
- Gießen Sie die PDMS-Mischung auf der Kappe mit der Spritze. Backen Sie die gesamte Kappe die PDMS für 8 Stunden im Ofen bei 70 ° C zu heilen.
- Löten Sie die LED-Anode mit dem 24-Gauge-Kabel und LED-Kathode mit dem Kohlewiderstand mit einem Lötkolben. Dazu wird ein 680 Ω Kohlewiderstand mit 24 G Draht. Isolieren Sie die Drahtverbindung mit Isolierband.
- Damitlder dem Kollektor des Photodetektors mit dem 24 G Draht und dem Emitter des Photodetektors mit einem 100 k & OHgr Kohlewiderstand. Isolieren Sie die Drahtverbindung mit Isolierband.
- Setzen Sie die Leuchtdiode in der Kulturflaschenhalter. Durch Anschluss an das Schaltbild in Abbildung 2 Ergänzungs, schließen Sie die Leuchtdiode und schalten Sie es mit einer Stromversorgung von 5 V Stellen Sie sicher , dass die LED arbeitet mit einer Digitalkamera , die IR (zB ein Handy-Kamera) erkennen kann.
- Setzen Sie den Photodetektor in der Kulturflaschenhalter. Durch Anschluss an das Schaltbild in Abbildung 2 Ergänzungs, schließen Sie den Photodetektor und schalten Sie es mit einer Stromversorgung von 5 V Schließen Sie das Kabel an beiden Seiten der Photowiderstände , die Spannung über die elektronische Steuerkarte zu messen.
- Kleben Sie einen Magneten an der Welle des Lüfters, der als Magnetrührer Einheit dient. Beachten Sie, dass die alignment der Welle des Gebläses zu dem Kulturfläschchen, und der Abstand zwischen der Phiole der Kultur und dem Magneten ist für die ordnungsgemäße Funktion der magnetischen Rühreinheit sehr kritisch.
- Schließen Sie jedes Stück Polyethylenschlauch des Kulturfläschchen in das entsprechende Stück Silikonschlauch für die Mikropumpen, mittlere Flaschen und Abfallflasche. Schalten Sie die Pumpe für 1 Stunde und messen das Gesamtvolumen der Mittelflasche in die Kulturfläschchen, die Pumprate zu bestimmen, gepumpt wird. Beachten Sie, dass die typische Pumprate sollte ~ 4 ml / h, die D = 0,33 h dem Verdünnungsrate entspricht -1 für eine 12 ml Arbeitsvolumen der Kulturfläschchen.
- Legen Sie die gesamte Baugruppe auf einem mittelgroßen (34 cm x 34 cm x 43,5 cm) Schüttelinkubator.
- Vortests die Morbidostat
- Set Versorgungsspannung von kühlem Ventilator bis 5 V seinen Motor zu starten, die magnetischen Rührstab zu testen. Beachten Sie, dass die Rührwirkung visuell inspiziert werden kann. Die Spannung, die fahrens der Lüftermotor wird durch Pulsweitenmodulation (PWM) präzise gesteuert werden.
- Bereiten Sie eine Reihe von Wildtyp E. coli Proben mit optischen Dichten bei 600 nm typischerweise im Bereich von 0,07 bis 0,3 für die Kalibrierung. Legen Sie einen Test E. coli Probe in der Kulturfläschchen und notieren Sie die Photospannung.
- Platz ~ 100 & mgr; l der gleichen Probe in dem Plattenleser und notieren Sie die optische Dichte. Verwenden Sie die Photospannung gegenüber der optischen Dichtedaten der Eichkurve zu zeichnen. Beachten Sie, dass typischerweise in der optischen Dichte einer Einheitsänderung mit dem Bias-Schema hier verwendet, um ~ 7,6 V Änderung der Photodetektor entspricht.
2. Ausführen des Morbidostat
- Vorbereitung vor dem täglichen Experiment starten
- Bereiten Sie die Kulturfläschchen mit drei extrem chemikalienbeständige Tygon Schläuche mit Innendurchmesser 1/32 Zoll und Außendurchmesser 3/32 Zoll für Einlässe, wie in Abschnitt der Vorrichtung zu bilden1.1 und in Ergänzungs 1.
- Bereiten Sie die M9-Minimalmedium (0,2% Glucose) und Trimethoprim (TMP) Arzneimittel enthaltenden Medium. Sterilisieren des Mediums, das Medium Flasche, das Medikament Mittelflasche, die Abfallflasche, und die Kulturfläschchen in einem Autoklaven bei 121 ° C.
HINWEIS: Der TMP ist eine Stammlösung , die später verwendet wird , um die Konzentrationen in Tabelle 1 und das Medikament dem Medium autoklaviert wird enthaltende TMP erreichen nicht.
- Das Ausführen des Morbidostat
- Am ersten Tag des Experiments, tauen 1 ml der gefrorenen Wildtyp E. coli MG1655 - Zellen für 5 min bei Raumtemperatur und Übertragung 120 ul der Zellen zu dem Kultur Durchstechflasche mit ~ 12 ml M9 Nährmedium. Nach dem ersten Tag auftauen 1 ml der gefrorenen E. coli - Zellen aus dem vorherigen Tag für 5 min und Übertragung 120 ul der Zellen zu einer neuen Kultur Fläschchen mit ~ 12 ml M9 Nährmedium.
- Schalten Sie den Schüttelinkubator und stellen Sie die tempe rature bis 30 ° C ohne Schütteln inkubiert.
- Starten Sie die morbidostat Operation durch auf der Mikropumpe dreht, die magnetische Rühreinheit und der optische Dichtemessung.
HINWEIS: Während des Betriebs wird ein Rückkopplungs Schwellwert-Algorithmus wird verwendet, um die Arzneimittelinjektion zu steuern. Wenn die gemessene optische Dichte einen voreingestellten Schwellenwert überschreitet, würde die Arzneimittelinjektionspumpe eingeschaltet und der Mittelpumpe ausgeschaltet werden würde. Andernfalls bleibt die Droge Einspritzpumpe ab und die Mittelpumpe eingeschaltet ist. - Überwachen der Spannung von Zeit zu Zeit, um sicherzustellen, dass das mikrobielle Wachstum ist.
Hinweis: Wegen der Frost-Tau - Zyklus, E. coli - Zellen zeigen eine Verzögerung von ca. 4 h während jedes Wachstum des Tages. - Nach ca. 23 h, stoppen Sie die Mikropumpe durch seine Versorgungsspannung ausgeschaltet und die Kulturfläschchen herausnehmen. Hinzufügen 15% Glycerin in die Kulturfläschchen und gefrier die Probe bei -80 ° C zur Lagerung.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 bis 2.2.5.
HINWEIS: Führen Sie die Wachstumsrate Messung in einem Plattenlesegerät mit einer 96-Well-Format, um die Antibiotikaresistenz Ebene zu bestimmen.
- Auftauen die tägliche gefrorenen Probe bei Raumtemperatur für 5 min und übertragen 15 ul der Zelle in das Kulturfläschchen ~ 15 ml M9-Medium enthält. Es ihnen ermöglichen, bis die optische Dichte bei 600 nm wachsen ~ 0,1 erreicht. Teilen Sie die 15 ml in 1 ml Flaschen und fügen Sie die TMP - Medikament bei diesem Schritt die gewünschten Arzneimittelkonzentrationen zu erhalten , wie in Tabelle 1 gezeigt.
- Nehmen Sie 200 ul der Probe aus Schritt 3.1 und Platz in jede Vertiefung in dem Plattenleser und es ihnen ermöglichen, für 12 Stunden 5 zu wachsen. Die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm wird automatisch während der Messung aufgezeichnet.
HINWEIS: Für jeden Datenpunkt werden drei Messungen aufgezeichnet und gemittelt, um die Konsistenz der Daten zu gewährleisten. Die Daten auf der optischen Dichte gegen die Zeit kann be verwendet, um die Wachstumsrate zu erhalten. - Zeichnen Sie die Wachstumsrate Daten in Abhängigkeit von der Wirkstoffkonzentration IC 50 zu erhalten. Beachten Sie, dass IC 50 als die Arzneimittelkonzentration definiert , bei der die Wachstumsrate fünfzig Prozent der maximalen Wachstumsrate beträgt 5.
4. Einzelzellmorphologie und Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika Messung in Mikrofluidiksysteme
- Führen Sie die Herstellung der mikrofluidischen Geräte über mehrschichtige weiche Lithographie von PDMS wie an anderer Stelle 15 beschrieben.
- Verwenden photolithographischen der Photoresistform für die Steuer- und Strömungsschichten zu machen. Beachten Sie, dass für die Steuerschicht, haben negative Photoresist (~ 15 & mgr; m Höhe) und positive Photoresist (~ 8 & mgr; m Höhe) eine Form auf einer blanken Siliziumwafer herzustellen.
- Bereiten PDMS-Mischungen mit Vernetzungsverhältnisse von 5: 1 und 20: 1 für die Steuerschicht und die Strömungsschicht. Setzen Sie die Mischungen in einem Exsikkator unter Vakuum keine Luftblasen zu entfernenFür 1 Std.
- Setzen Sie die Steuerschicht Photoresist Formen auf Siliziumwafer Trimethylchlorsilan (TMCS) Dampf. Sprechen Sie die Kontrollschicht von ca. 6 mm Dicke, die durch die PDMS-Mischung Gießen (mit Vernetzungs Verhältnis 5: 1) auf dem Siliziumwafer auf der Steuerschicht Photoresist-Form. Backen Sie die Steuerschicht für 40 min bei 80 ° C für 1 Stunde in den Ofen.
- Bilden die Strömungsschicht durch Rotationsbeschichtung eines PDMS-Mischung (mit Vernetzungsverhältnis 20: 1, Schleuderdrehzahl 3000 Upm für 60 sec) auf eine Strömungsschicht Photoresistform. Backen Sie die Strömungsschicht für 30 min bei 80 ° C für 1 Stunde in den Ofen.
- Verwenden Sie eine Rasierklinge die Steuerschicht in die gewünschte Chipgröße zu schneiden (in der Regel 3 cm x 2 cm) und abziehen manuell die Steuerschicht. Legen Sie die Steuerschicht auf der Oberseite der Strömungsschicht und richten sie unter einem Stereomikroskop. Cure die ausgerichtete Montage bei 80 ° C im Ofen über Nacht. Danach 5 h die Montage in 250 ml entionisiertem Wasser in einem Kunststoffbehälter tränken das Rest TMCS auflösen.
- Anschließend werden die Einlaßlöcher mit 20 G Nadeln stanzen und das gesamte Elastomer an einem Glasobjektträger mit einer leeren PDMS-Schicht (PDMS Quer Verhältnis Verknüpfung 5: 1, 2,000 Schleuderdrehzahl rpm für 30 sec) beschichtet bonden für 40 sec durch Luftplasmabehandlung bei 1,2 Torr Luftdruck.
- Durchführung umfassende Backen für 36 h bei 80 ° C, um die zytotoxischen Wirkungen von PDMS zu reduzieren. Beachten Sie, dass diese Backschritt kritisch ist die Toxizität für die Bakterienzellen zu minimieren.
- On Chip Growth Experiment
- Bevor in die Mikrofluidik-Vorrichtung geladen wird, spülen Sie es mit entsalztem Wasser für 1 Stunde und M9-Medium für 1 Stunde.
- Auftauen die tägliche gefrorenen Probe bei Raumtemperatur für 5 min und inokulieren Medium ein neues Reagenzglas mit frischem M9. Die Probe wird in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C über Nacht.
- Verdünnen Sie die mikrobielle Probe 10-fach mit M9-Medium und laden Sie es in die Mikrofluidik-Vorrichtung durch die mikrobielle Probenbehälter bei 5 psi Druck zu setzen. Dann laden Sie die TMP-DrogeMedium in den Chip durch das Medikament Mittelbehälter bei 5 psi Druck zu setzen. Führen Sie die Vermischung zwischen der Mikrobe und Drogen durch Betätigung des mikromechanischen Ventil zwischen den beiden Kammern auf dem mikrofluidischen Chip für 15 min.
- Platzieren Sie den Mikrofluidik-Chip im Mikroskop-Inkubator auf dem inversen Mikroskop angebracht. Erwerben das Zellbild in der Wachstumskammer auf dem umgekehrten Mikroskop jede hr für 8 h mit der CCD-Kamera angebracht ist.
- Verwenden Sie das benutzerdefinierte Programm Skript , um die Zellzahlen über einen Schwellenwert - Algorithmus auf den Zellenbilddaten 18 zu berechnen. Beachten Sie, dass die Zellzahldaten werden gemittelt, typischerweise über drei mikrofluidischen Kammern.
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Representative Results
Die oben beschriebene morbidostat ist in 1. Die gemeinsamen morbidostat Operationen, einschließlich der experimentellen Entwicklung, antibiotische Empfindlichkeitstest und Zellmorphologie Prüfung, validiert wurden in einem E. schematisierte coli MG1655 Kultur Trimethoprim (TMP) ausgesetzt, ein häufig verwendetes Antibiotikum 5,6. TMP induziert sehr ausgeprägte schrittweise Erhöhungen der Arzneimittelresistenz und die Mutationen sind um die Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) -Gen geclustert. Daher ist TMP ein hochwirksames Medikament Standard der morbidostat Betrieb für die Validierung. Jeden Tag wird die Mikrobe erwartet oberhalb der voreingestellten optischen Dichteschwelle und lösen die Arzneimittelinjektion zu wachsen , wie in 2a gezeigt. Die Arzneimittelinjektion wird erwartet, dass das Wachstum zu hemmen, und als Ergebnis, Abnahme der optischen Dichte. Mehrere Testläufe kann die optimale Wirkstoffkonzentration zu bestimmen, benötigt werden. Als Faustregel gilt: wir zunehe die Konzentration des Arzneimittelmediums durch 5-fache nach der Feststellung, dass das Medikament Medium, das Wachstum zu unterdrücken, schlägt fehl. Nach dem gesamten Verlauf des Experiments werden täglich gefrorenen Proben aufgetaut und verwendet IC 50 zu bestimmen, ein quantitatives Maß für die Widerstandsniveau Arzneimittels. Das Grundstück in 2b zeigt die zeitliche Zunahme der Antibiotika - Resistenzen. Die Medikamentenresistenz erhöht ca. 1.500-fach bis ~ 1000 ug / ml über ~ 12 Tage im Einklang mit früheren Erkenntnissen in Labor Evolution 5 und klinischen Isolaten 19. Die DHFR Punktmutationen in der letzten Tages Mutante wurden durch Sanger - Sequenzierung gemessen und sind in Tabelle 2 aufgeführt. Eine Mutation auf dem Promotor - Region gefunden wird , und zeigt an, dass einzelne Punktmutation in der Promotorregion signifikant die Expressionsniveau des DHFR ändern Enzym 20. Eine andere Mutation an Position 49.910 in der Genregion von DHFR und in der Nähe zu dem Aktive Website des DHFR - Enzym - 21. Der Erwerb von Medikamentenresistenz mit mehreren Mutationen beweist die Nützlichkeit der morbidostat, wie die Auswahl auf Arzneimittel enthält, Agar-Platte nur die einzige Mutation zu verleihen neigt.
Als empfindlicher Auslesen der Zellmorphologie, die Prüfung Einzelzellmorphologie mit antibiotischen Empfänglichkeit 14 in einer parallelen, gemultiplexten mikrofluidischen Plattform durchgeführt wird . 3 zeigt den Aufbau des gemultiplexten mikrofluidischen Chip. Mikroskopische Aufnahmen der Bakterienzellen (Abbildung 5) Morphologie Veränderungen sowohl Wildtyp und mutierten Stämmen unter subinhibitorischen Konzentrationen von TMP offenbaren. Wildtyp-Stämme zeigen signifikante filamentation während der mutierte Stamm keine signifikante filamentation zeigt. Diese Morphologie Änderung an einer einzelnen Zelle Ebene kann in der schnellen Diagnose von Antibiotikaresistenzen. 4 verwendet werden Anzeigen Abbildung der on-chip Wachstumskurven bei verschiedenen Konzentrationen von TMP. Das mutierte Probe zeigt eine signifikante Zunahme der Antibiotika-Resistenzen. Der On-Chip - Wachstumsdaten in Figur 4 ist auch im Einklang mit dem IC 50 -Wert aus dem Plattenlesegerät in 2b dargestellt.
Abb . 1: Schematische Darstellung des morbidostat Die morbidostat ist eine kontinuierliche Kulturvorrichtung, die die optische Dichte der mikrobiellen Population misst und stellt dementsprechend die Arzneimittelkonzentration. Das Gerät läuft in Drogen-Injektion - Modus und medikamentenVerdünnungsModus. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Wachstumskurve und Steigerung des Antibiotikums Resistenzniveau (a) Repräsentative Wachstumskurve unter Feedback.. Das mikrobielle Wachstum wird durch das Antibiotikum gehemmt wird, deren Einspritzung durch eine Schwellenalgorithmus ausgelöst. Wenn die positive Wachstumsrate erhöht die optische Dichte über dem eingestellten Schwellwert (OD TH = 0,086), schaltet das Gerät auf Drogen-Injektion - Modus. Andernfalls wird das Gerät in der Wirkstoff-Verdünnungsmodus. Rote und lila Pfeile zeigen die Umschaltung in Injektion von Medikamenten und Arzneimittelverdünnung Modi sind. (B) Widerstandsniveau der Zellen innerhalb von 12 Tagen nach der Exposition gegen Trimethoprim. Der IC 50 zeigt eine deutliche schrittweise Erhöhung der Antibiotika - Resistenzen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3: Mikrofluidik - Geräte für Zellmorphologie zu untersuchen und On-Chip - Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika (a) Mikroskopische Aufnahme des Chiplayouts.. Grüne und blaue Fächer sind die Wachstums und Drogenmittelkammern sind, und die rote Layout bezeichnet die Steuerschicht. Die Abmessungen der Wachstumskammer sind 450 & mgr; m (l) x 400 um (w) x 8 & mgr; m (h). Die Wachstumskammer wird mit den Bakterien geladen und der Arzneimittelkammer ist mit TMP geladen. Maßstabsbalken ist 1 cm. (B) vergrößerte Ansicht des gleichen Chip. Maßstabsbalken = 500 & mgr; m. (C) Vergrößerte Ansicht beider Kammern vor und nach dem Mischen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 4: On-Chip - Wachstumskurven von E. coli ausgesetzt verschiedenen Konzentrationen von TMP: (a) Wildtyp - Ursprungsstamm und (b) Mutantenstamm (am Tag 12). Das mutierte Probe zeigt einen signifikanten Anstieg der Antibiotika - Resistenzen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Einzellige Morphologien (a - d) Hellfeldbilder der Zelle nach der Behandlung mit subinhibitorischen Ebenen von TMP. Man beachte die signifikante filamentation der Wildtypzellen in (b), die in den Mutanten fehlt (d (e - h) sind digitalisierter Bilder von (a - d). Alle Bakterien Bilder von einer CCD - Kamera mit einem 40 - fach vergrößerndes Objektiv aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ergänzende Abb . 1: Die Abmessungen und die Montage des Kulturfläschchen Halter Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2:. Das Schaltbild für die LED und Photodetektor Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Code:. Benutzerdefinierte Skript , um die Zellzahl aus den gewonnenen Zellbilder von den Mikrofluidik - Chips zu zählen Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
| Sample | TMP Drug (ug / ml) | |||||||||||
| Tag 1-3 | 0 | 0,06 | 0,12 | 0,25 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | |
| Tag 4 | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 | |
| Tag 5-7 | 0 | 2 | 4 | 8 | <td> 1530 | 60 | 120 | 240 | 480 | 960 | ||
| Tag 8-12 | 0 | 3 | 7 | 15 | 30 | 60 | 125 | 250 | 500 | 1000 | 2000 | |
Tabelle 1:. Drug Konzentration verwendet IC zu bestimmen , 50 in den Plattenleser Messung Arzneimittelkonzentrationen in der Einheit & mgr; g / ml für die tägliche gefrorene Probe angezeigt. Da die Zellen höherer Medikamentenresistenz entwickeln, werden die Wirkstoffkonzentrationen verwendet entsprechend erhöht.
| Nein | Ort | SNP | Hinweis |
| 1 | 49894 | C-> T | |
| 2 | 49910 | T-> A | DHFR-Gen |
| 3 | 49795 | C-> T | DHFR-Promotor |
Tabelle 2:. Die Mutation in DHFR identifiziert durch Sanger - Sequenzierung Die repräsentativen Sequenzdaten zeigen die drei DHFR Punktmutationen in der letzten Tage - Mutante (Tag 12). Dem Promotor und Gen-Regionen enthalten ein und 2 SNPs, respectively. Die Vorwärts- und Rückwärts-Primer in der PCR verwendet wurden, waren 3'TCTAGAGAGATCATTACCGA GGACCGCGAACATCTGTCAT5 'und 3'ACTAGT TTACCGCCGCTC CAGAATCTCAA AGCAATAGCTG5'.
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Discussion
Ein Low-Fußabdruck morbidostat Gerät von Low-Cost-Komponenten demonstriert. Der Anstieg der Widerstandsniveau Medikament vom Gerät registriert sind konsistent mit denen früherer Berichte 5. Entwickelt für evolutionäre Studien der Arzneimittelresistenz ist das Gerät möglicherweise auf viele andere Experimente. Zunächst wird eine umfassende Datenbank von Medikamenten-induzierten Mutationen können für einen großen Satz von klinisch relevanten Antibiotika hergestellt werden. Zum Beispiel kann die evolutionäre Weg der multiple drug resistance durch einfaches Erhöhen der Anzahl von Medikamenten in dem Experiment verwendet sucht werden. Der Hauptvorteil des Moduls hier berichtet wird, ist die flexible Konfigurierbarkeit, wodurch großflächige, parallel Experimente unter unterschiedlichen Versuchsbedingungen.
Obwohl das Konzept in den Mikrofluidik - Messungen nachgewiesen wurde, kann die Ermittlungsbefugnisse 23 durch die Kombination von Mikrofluidik mit Fluidik - Technologie verbessert werden. Die Kosten proMessung (economy of scale) wird durch die abgesenkte Reagenzienverbrauch und reduzierte Arbeits drastisch reduziert. Hier können einzelne Zellmorphologie Daten aus der mikrofluidischen Plattform extrahiert werden. Kürzlich wurde mikrofluidischen Tests Morphologie einzelner Zellen erfolgreich in der klinischen Mikrobiologie - Laboratorien durchgeführt und führt zu vergleichsweise Standard broth Reihenverdünnungstests 24. Mit der zunehmenden Verfügbarkeit von mikrofluidischen Systemen, werden kombiniert Technologien ermöglichen groß angelegte, Hochdurchsatz-Laborexperimente Evolution.
Mehrere Schritte sind entscheidend für den morbidostat zu laufen. Erstens, weil die magnetische Rühreinheit von Magneten und einem Kühlgebläse ausgebildet ist, ist es wichtig, die Welle des Gebläses zu dem Kulturfläschchen auszurichten. Auch ist der Abstand zwischen dem Kulturfläschchen und dem Magneten ist sehr wichtig, einen stabilen Betrieb zu gewährleisten. Zweitens, am Anfang zu einer neuen Kultur Fläschchen Schalt Experiment eines jeden Tages ist auch wichtig,vermeiden die Bildung von Biofilmen. Andernfalls kann die Biofilmbildung innerhalb von 2 oder 3 Tagen erfolgen. Drittens , weil E. coli Proben , die während jeden Tag des Experiments täglich von einer gefrorenen Probe auftauen Konsistenz zu gewährleisten, ist es wichtig , eine Verzögerungszeit von mindestens 4 Stunden einzustellen insgesamt Auswaschen der Mikroben zu vermeiden. Alternativ kann man wählen , nicht E. einzufrieren coli - Proben und verwenden Sie die Probe direkt eine neue Kultur Fläschchen zu impfen , eine neue Kultur zu starten.
In einer praktischen Einstellung muss die aktuelle System-Design mehrere Einschränkungen zu überwinden, um ihr Potenzial Nutzungen erweitern. Das Volumen des gesamten Systems wird gegenwärtig von dem Medium pro Tag verbraucht begrenzt (bei Chemostaten Betrieb verbraucht einem Kulturfläschchen etwa 0,5 l Medium pro Tag bei der typischen Verdünnungsrate von 0,33 h -1). Um das Arbeitsvolumen, eine weitere Optimierung reduzieren kann durch sorgfältige Simulation auf die Drogengehemmten Populationsdynamik mit plumbi erreicht werdenng - Parameter 25.
Schließlich ist die morbidostat leicht an eine Vielzahl von Bakterienkulturexperimenten. Beispielsweise durch eine Leuchtdiode angebracht, könnte das System als Photobioreaktor rekonfiguriert werden, so dass die evolutionäre Überwachung von Cyanobakterien oder Mikroalgen 26. Das Modul kann durch drahtlos Betreiben der Vorrichtung in einem Batteriepack mit Adsorbentien in einem gasdichten Behälter zum anaeroben und mikroaeroben Kultivierung verlängert werden. Als ein anderes Beispiel könnte die Konzentration eines Toxins nach und nach erhöht werden Stämme zu konstruieren , die 27 zu der Zielchemikalie resistent sind.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5 V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5 V supply voltage and 80 mA; available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure > 3 kPa; Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4 mm | |
| Glass scintillation 20 ml vial | DGS | Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500 mA, 40 V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10 μF, 25 V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
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- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
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