القبض على وإطلاق قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية من الدم
Summary
بروتوكول للاستفادة بولي (N–iso propylacrylamide) (PIPAAm) ميكروفلتر المغلفة لالتقاط فعالة وإطلاق thermoresponsive من قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية (CTC) وتقدم. هذا الأسلوب يسمح القبض على رابع كلوريد الكربون من الدم المرضى والإفراج لاحقا من لجنة مكافحة الإرهاب قابلة للثقافة المصب خارج رقاقة وتحليل وتوصيف.
Abstract
ونحن لشرح طريقة لالتقاط أساس حجم قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية (CTC) من الدم الكامل، جنبا إلى جنب مع الافراج عن هذه الخلايا من رقاقة لتحليل و / أو ثقافة المصب. وتوظف استراتيجية استخدام رواية Parylene C فتحة غشاء المسام ميكروفلتر للقبض على لجنة مكافحة الإرهاب وطلاء بولي (N–iso propylacrylamide) (PIPAAm) لthermoresponsive الإفراج قابلة للحياة من لجنة مكافحة الإرهاب التي تم التقاطها. يتم تمكين القبض على الخلايا الحية من خلال الاستفادة من تصميم هندسة فتحة المسام مع أبعاد محددة للحد من إجهاد القص التي ترتبط عادة مع عملية الترشيح. في حين أن ميكروفلتر يسلك كفاءة التقاط عالية، وإطلاق سراح من هذه الخلايا غير تافهة. عادة، يتم الافراج سوى نسبة صغيرة من الخلايا عندما يتم استخدام تقنيات مثل التدفق العكسي أو كشط الخلايا. التصاق قوي من هذه الخلايا السرطانية الظهارية للغشاء Parylene C يعزى إلى تفاعل كهرباء غير محددة. لمواجهة الهو الواقع، قمنا بتوظيف استخدام PIPAAm الطلاء واستغلال خصائصه استجابة الحرارية بينية للافراج عن الخلايا من مرشح. يتم تصفية الدم لأول مرة في درجة حرارة الغرفة. أقل من 32 درجة مئوية، PIPAAm هو ماء. بعد ذلك، يتم وضع فلتر في أي من وسائل الإعلام ثقافة أو منطقة عازلة الحفاظ على 37 درجة مئوية، مما يؤدي في PIPAAm تحول مسعور، وبالتالي الإفراج عن الخلايا المربوطة كهربية.
Introduction
المرض المنتشر هو المسؤول عن معظم وفيات السرطان. تطوير النذير ورفيق العلامات البيولوجية لتشخيص ورم خبيث أمر بالغ الأهمية في إدارة مرض السرطان وعلاجه. تعميم الخلايا السرطانية (CTC) تلعب دورا رئيسيا في نشر الورم والانبثاث. وعلاوة على ذلك، التي يمكن الوصول إليها بسهولة ك "السائل خزعة" العلامات البيولوجية، لجنة مكافحة الإرهاب في مرضى السرطان الدم المحيطي قد ارتفع ك "معقل" لأبحاث السرطان العلامات البيولوجية. لجنة مكافحة الإرهاب تم التحقق من صحتها فضلا عن العلامات البيولوجية النذير في إعدادات السرطان المختلفة، بما في ذلك الثدي والبروستات وسرطان القولون والمستقيم 1-3. ومع ذلك، التطورات الحديثة في مجال مكافحة الإرهاب وأشارت إلى أن مجرد تعداد هذه الخلايا النادرة محدودة فائدة سريرية، كما هو مبين في التجارب السريرية التدخلية 4. وبالتالي، هناك حاجة الناشئة عن التقنيات التي تسمح للالتوصيف الجزيئي وظيفي لجنة مكافحة الإرهاب. حاليا، قليل من التكنولوجيات فقط توجد تسمح FOص غير مستضد منحازة، القبض قابلة للحياة، والإفراج عن لجنة مكافحة الإرهاب، تمكن قوي المصب الجزيئية والوظيفية 5،6 التحليل. تقترن معظم هذه الأجهزة microfabricated إلى منصات ميكروفلويديك وبالتالي يكون عاملا يحد من كمية الدم التي يمكن معالجتها، والتي تتراوح 2-4 مل 7-10. لجنة مكافحة الإرهاب هي الأحداث النادرة في أنبوب واحد من سحب الدم (7.5 مل)، وبالتالي الحد من زيادة كمية الدم التي يمكن معالجتها، يعيق كثيرا من فرص التقاط وعزل هذه الخلايا من الفائدة.
لقد قمنا بتطوير نوعين من الأجهزة غشاء ميكروفلتر Parylene C للقبض على لجنة مكافحة الإرهاب التي تستغل حجم الخلافات بين خلايا الورم أكبر وأصغر خلايا الدم العادية 11،12. لقد ذكرت سابقا في جولة التصفية المسام التعداد ومقارنة ذلك مع منصة وافقت ادارة الاغذية والعقاقير، حيث أظهرت ميكروفلتر لتكون متفوقة في لجنة مكافحة الإرهاب كفاءة التقاطلعينات سرطان الدم المريض 13،14. ومع ذلك، وجود قيود على مرشح الجولة هو ضرورة لاستخدام مثبت القائم على الفورمالديهايد قبل الترشيح. هذه العملية تحافظ على مورفولوجيا الخلايا مع السماح لهم لتحمل إجهاد القص والضغط أثناء عملية الترشيح. بينما التعداد والدراسات الجزيئية يمكن أن يؤديها على رقاقة 13، تثبيتي يضعف القدرة على أداء توصيف وظيفي. لمعالجة هذا القيد، وضعنا المسام مرشح الفتحة التي ينفي ضرورة إصلاح الخلايا السابقة للترشيح (الشكل 1). هندسة فتحة المسام (6 ميكرومتر عرض × 40 ميكرون فتحة طول المسام) تسمح للخلايا الورم ليتم القبض على حين تسد جزئيا فقط المسام، وبالتالي لا يزال السماح بالمرور الحر للخلايا الدم الأخرى والتخفيف من ارتفاع في الضغط من شأنه أن يؤدي إلى تلف الخلايا وانفجار في نهاية المطاف 15،16 يتكون خرطوشة فتحة المسام من 2 قطعة الاكريليك التي شطيرةمرشح فتحة المسام بين قطعة أعلى وأسفل مع ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) بصفتها طوقا لتوفير مانعة للتسرب ختم 14،15 (الشكل 1).
في حين أن الكفاءة القبض على مرشح فتحة المسام عالية، لا بد (الجدول 1)، لجنة مكافحة الإرهاب القبض على الغشاء Parylene C بواسطة تفاعلات قوية غير محددة كهرباء بدلا من المصفوفة خارج الخلية (ECM) بوساطة الالتصاق 15. أساليب مثل التدفق العكسي أو استخدام كاشطات خلية تفشل في إطلاق سراح نحو فعال الخلايا من مرشح، أو تؤدي إلى تلف الخلايا وموت الخلايا. بحثنا الاستخدام غير تقليدية من PIPAAm إلى صياغة استراتيجية الافراج عن 15. PIPAAm هو بوليمر أن يخضع لعكسها أقل حرجة درجة حرارة المحلول (LCST) المرحلة الانتقالية في درجة حرارة المحلول من 32 درجة مئوية (17). تقليديا، وقد تم اكتشاف نطاق واسع هذا العقار من PIPAAm لتطبيقات هندسة الأنسجة. عادة، الخلاياالسطوح مثقف على PIPAAm المغلفة عند 37 درجة مئوية عندما PIPAAm هو مسعور. ويمكن بعد ذلك الخلايا يمكن فصل كورقة عندما يتم إزاحة درجة حرارة الثقافة إلى أقل من 32 درجة مئوية، حيث يصبح سطح PIPAAm المغلفة رطب 17،18. نحن استغلال هذه الخاصية الحرارية عن طريق إجراء عملية الترشيح في درجة حرارة الغرفة (أقل من 32 درجة مئوية)، ومن ثم تمكينه الافراج عن خلية عن طريق وضع مرشح في وسائل الإعلام ثقافة الحفاظ على 37 درجة مئوية. عند هذه الدرجة، وطبقة البوليمر PIPAAm يصبح مسعور، وبالتالي الإفراج عن خلايا ملزمة كهربية 15 (الشكل 1).
على الرغم من أن طريقة استجابة درجة الحرارة فضلا عن أساليب أخرى تم تنفيذها بنجاح لتحقيق القبض على رابع كلوريد الكربون قابلة للحياة والافراج 19-21، عيب واحد محتمل رئيسي تتقاسمها هذه التكنولوجيات المبلغ هو أنهم جميعا في توظيف مبدأ تعتمد على مستضد لالتقاط جنة مكافحة الإرهاب. مستضد مقرها القبض على رابع كلوريد الكربون، ص كما هو مبينreviously، قد يؤدي إلى منحاز لجنة مكافحة الإرهاب تحليل 11،14. على سبيل المثال، العديد من التكنولوجيات القائمة على تقارب تستخدم الأجسام المضادة التي تربط EpCAM لالتقاط جنة مكافحة الإرهاب. ومع ذلك، فقد ثبت أن لجنة مكافحة الإرهاب في التعبير عن مستويات مختلفة من EpCAM، مما يؤدي إلى إغفال EpCAM منخفضة وEpCAM السلبية لجنة مكافحة الإرهاب من خلال هذه التقنيات. أيضا، قد يحدث القيود عند لجنة مكافحة الإرهاب من أصل غير الظهارية هو من مصلحة، مثل لجنة مكافحة الإرهاب في إعدادات سرطان الجلد وساركوما. وهكذا، فإن التكنولوجيا التي تسمح لالتقاط CTC قابلة للحياة والإفراج، دون التحيز المحتمل الذي عرضته التقاط مستضد أساس مرغوب فيه للغاية.
الأهم من ذلك، هو حجم جهاز الالتقاط ميكروفلتر بحتة على أساس واستراتيجية الإصدار هو الملحد إلى وجود بعض علامات سطح. ونحن نعتقد أن العمل من ميكروفلتر المغلفة PIPAAm سيساعد على توسيع فهمنا للعملية المتنقل، من خلال توفير القدرة على التقاط الصور والافراج عن لجنة مكافحة الإرهاب لتحليل المصب بفعالية وكفاءة. وهذا قد قويةially كشف الجزيئات الجديدة التي قد تكون موجهة رواية المستهدفة العلاجات الشاملة فضلا عن توفير العلامات البيولوجية التي يمكن رصدها بسهولة والمساعدة في سرطان التعامل مع المرضى.
Protocol
Representative Results
Discussion
عملية التقاط قابلة للحياة رابع كلوريد الكربون من الدم الكامل والإفراج عنهم من ميكروفلتر هي بسيطة نسبيا. لكن بعض النقاط الهامة التي تستحق الذكر. ومن الضروري، كما هو الحال مع كل ثقافة الخلية التي حافظت على حالة معقمة من خلال العملية برمتها. الخطوة الأولى من طلاء فلتر م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank all the patients who have donated blood samples to support this work. We thank Drs. Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli, and Marc E. Lippman for their assistance in clinical sample acquirement, and Drs. Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Züchner, Toumy Guettouche, Diana Lopez for their insightful discussions. Zheng Ao thanks partial support and assistance from the Sheila and David Fuente Graduate Program in Cancer Biology, Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
| poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
| Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1XPBS | Gibco | 10010-023 | |
| McCoy's | Gibco | 16600-082 | Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case |
| Falcon Petri dishes 35×10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
| Syringe 20mL | BD Scientific | 302830 | |
| Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used |
| Cellstar 50mL Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
| Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |
References
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Punt, C. J. a., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500. J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).
- Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip. Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).
- Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci. Transl. Med. 5 (179), 179 (2013).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System. PLoS ONE. 8 (6), (2013).
- Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation. Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).
- Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -. T., Yobas, L., Lim, C. T. Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients. Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).
- Vona, G., Sabile, A., et al. Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).
- Marrinucci, D., Bethel, K., et al. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).
- Lin, H. K., Zheng, S., et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).
- Williams, A., Rawal, S., et al. Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells. PHT. , 220-223 (2013).
- Ao, Z., Parasido, E., et al. Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications. Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).
- Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter. Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).
- Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).
- Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).
- Deng, Y., Zhang, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci. Rep. 4, 7499 (2014).
- Hou, S., Zhao, H., et al. Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures. Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).
- Xiao, Y., Zhou, H., et al. Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).
- Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients. BMC cancer. 15 (1), 403 (2015).
