Um protocolo para utilizar um poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro revestido para captura e libertação eficaz thermoresponsive de células viáveis tumorais circulantes (CTC) é apresentada. Este método permite a captura de CTC de sangue dos pacientes e posterior liberação dos CTC viável para a cultura off-chip jusante, análises e caracterização.
Nós demonstramos um método para captura com base tamanho de células de tumor circulantes viável (CTC) a partir de sangue total, juntamente com a libertação destas células a partir de chip para análise e / ou a jusante cultura. A estratégia emprega o uso de um novo Parylene C microfiltro ranhura membrana de poros para capturar CTC e um revestimento de poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) para thermoresponsive libertação viável do CTC capturado. A captura de células vivas é activado, aproveitando a concepção de uma geometria de abertura de poros com dimensões específicas para reduzir a tensão de cisalhamento tipicamente associados com o processo de filtração. Enquanto o microfiltro exibe uma elevada eficiência de captura, a libertação destas células não é trivial. Tipicamente, apenas uma pequena percentagem de células são libertadas quando as técnicas tais como o fluxo reverso ou raspagem célula são utilizados. A forte adesão destas células de cancro epitelial da membrana Parylene C é atribuível à interacção electrostática não específica. Para contrariar thé efeito, aplicou-se o uso de revestimento PIPAAm e exploradas as suas propriedades interfaciais responsivos térmica para libertar as células do filtro. O sangue é filtrado em primeiro lugar, à temperatura ambiente. Abaixo de 32 ° C, PIPAAm é hidrofílica. Depois disso, o filtro é colocado em qualquer meio de cultura ou um tampão mantida a 37 ° C, o que resulta na PIPAAm transformando hidrófobo, e, subsequentemente, libertando as células electrostaticamente ligados.
A doença metastática é responsável pela maioria das mortes por câncer. Desenvolvimento de biomarcador de diagnóstico e prognóstico companheiro para metástase é crucial na gestão e tratamento do câncer. As células tumorais em circulação (CTC) desempenham um papel central na disseminação de tumores e metástases. Além disso, sendo facilmente acessível como uma "biópsia líquida" biomarcador, CTC em pacientes com câncer 'sangue periférico tem vindo a aumentar como um "viveiro" para pesquisa com biomarcadores de câncer. CTC têm sido bem validado como um biomarcador prognóstico em várias configurações de câncer, incluindo mama, próstata e cancro colorectal 1-3. No entanto, avanços recentes no campo CTC indicou que a simples enumeração dessas células raras tem utilidade clínica limitada, como demonstrado em ensaios clínicos de intervenção 4. Assim, existe uma necessidade emergente para as tecnologias que permitem a caracterização molecular e funcional do CTC. Atualmente, existem apenas algumas tecnologias que permitem for não-antigénio tendenciosa, captura viável e lançamento do CTC, permitindo robusta 5,6 análise molecular e funcional jusante. A maioria destes dispositivos microfabricados são acoplados às plataformas de microfluidos e, assim, têm um factor limitante na quantidade de sangue que esta pode ser processado, o que varia de 2-4 ml 7-10. CTC são eventos raros em um único tubo de coleta de sangue (7,5 ml), portanto, reduzindo ainda mais a quantidade de sangue que pode ser processado, dificulta enormemente a possibilidade de capturar e isolar estas células de interesse.
Nós desenvolvemos dois tipos de dispositivos microfiltro de membrana Parylene C para a captura de CTC que exploram as diferenças de tamanho entre as células tumorais maiores e as células sanguíneas normais menores 11,12. Temos relatado anteriormente no filtro de poros enumeração rodada e comparou-o com uma plataforma de aprovado pela FDA, onde o micro filtro mostrou-se superior em CTC eficiência de capturapara amostras de cancro do sangue do paciente 13,14. No entanto, uma limitação do filtro redondo é a necessidade de usar um fixador à base de formaldeído antes da filtração. Este processo preserva a morfologia de células, permitindo-lhes resistir a tensão de cisalhamento e a pressão durante o processo de filtração. Enquanto enumeração e estudos moleculares podem ser realizados no chip 13, o fixador prejudica a capacidade de realizar uma caracterização funcional. Para resolver esta limitação, foi desenvolvido um filtro de poro de ranhura que nega a necessidade de fixar as células antes da filtração (Figura 1). A geometria da ranhura de poro (6 uM de largura x 40 ^ m de entalhe comprimento poros) permite que as células tumor a ser capturado quando a oclusão apenas parcialmente uma poro e, portanto, ainda permitindo a passagem livre para outras células de sangue e aliviar o aumento da pressão, que poderia levar a danos nas células e eventual rebentamento 15,16 O cartucho de slot de poros é composto por 2 peças de acrílico que sandwicho filtro de entalhe de poro entre a parte superior e na parte inferior com polidimetilsiloxano (PDMS), que actua como um vedante para proporcionar uma vedação à prova de fugas 14,15 (Figura 1).
Embora a eficiência da captação do filtro de entalhe de poro é alta, (Tabela 1), o CTC capturado estão ligadas à membrana Parylene C por fortes interacções electrostáticas não-específicos, em vez de matriz extracelular (ECM) 15 adesão mediada. Métodos tais como o fluxo inverso ou a utilização de raspadores de células não conseguem libertar eficazmente as células do filtro, ou resultar em danos celulares e a morte celular. Nós exploramos um uso não convencional de PIPAAm para formular uma estratégia de liberação 15. PIPAAm é um polímero que sofre uma transição de fase reversível temperatura crítica inferior de solução (TCIS), a uma temperatura de solução de 32 ° C 17. Tradicionalmente, esta propriedade de PIPAAm tem sido amplamente explorada para aplicações de engenharia de tecidos. Tipicamente, as células sãosuperfícies cultivadas em PIPAAm revestidos a 37 ° C quando PIPAAm é hidrofóbico. As células podem então ser separado como uma folha, quando a temperatura da cultura é deslocada para abaixo de 32 ° C, onde a superfície revestida PIPAAm torna-se hidratado 17,18. Nós explorou essa propriedade térmica através da realização do processo de filtração à temperatura ambiente (inferior a 32 ° C) e, em seguida, permitindo libertação de células, colocando o filtro em meios de cultura mantida a 37 ° C. A esta temperatura, a camada de polímero se torna hidrofóbica PIPAAm, libertando assim a células electrostaticamente ligados 15 (Figura 1).
Embora o método sensível à temperatura, bem como outros métodos têm sido aplicadas com sucesso para atingir captação CTC viável e libertar 19-21, uma desvantagem potencial chave partilhada por estas tecnologias relatados é que todos eles empregam um princípio dependente de antigénio para a captura do CTC. Antigen baseada captura de CTC, p, como mostradoreviously, pode levar a tendenciosa análise 11,14 CTC. Por exemplo, muitas tecnologias baseadas em afinidade empregar anticorpo que se liga EpCAM para a captura do CTC. No entanto, tem sido demonstrado CTC para expressar vários níveis de EpCAM, levando a omissão de EpCAM e EpCAM baixo CTC negativa por estas tecnologias. Além disso, as limitações podem ocorrer quando CTC de origem não epitelial é de interesse, tais como CTC em ambientes de melanoma e sarcoma. Assim, uma tecnologia que permite a captura viável CTC e liberação sem potencial viés introduzido por captura com base antígeno é altamente desejável.
Importantemente, o dispositivo de captura é puramente microfiltro dimensionada com base e a estratégia de liberação é agnóstico à presença de certos marcadores de superfície. Acreditamos que o emprego do microfiltro revestido PIPAAm vai ajudar a expandir a nossa compreensão do processo metastático, através do fornecimento a capacidade de capturar e liberar CTC para as análises a jusante de forma eficaz e eficiente. Isto pode potenteei ra me expor novas moléculas para as quais novas terapias direcionadas sistêmicas pode ser dirigidas, bem como fornecer um biomarcador que pode ser monitorado de forma fácil e ajuda na gestão do paciente com câncer.
O processo de captura CTC viável do sangue total e liberando-os do microfiltro é relativamente simples; no entanto alguns pontos críticos são dignos de menção. É imperativo, como com toda a cultura de células que uma condição estéril é mantido através de todo o processo. O passo inicial de revestimento do filtro com PIPAAm é crítico, como a base para a técnica de libertar as células do filtro se baseia na exploração de temperatura propriedades interfaciais responsivos do PIPAAm. Para assegurar o filtr…
The authors have nothing to disclose.
We thank all the patients who have donated blood samples to support this work. We thank Drs. Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli, and Marc E. Lippman for their assistance in clinical sample acquirement, and Drs. Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Züchner, Toumy Guettouche, Diana Lopez for their insightful discussions. Zheng Ao thanks partial support and assistance from the Sheila and David Fuente Graduate Program in Cancer Biology, Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
1XPBS | Gibco | 10010-023 | |
McCoy's | Gibco | 16600-082 | Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case |
Falcon Petri dishes 35×10 mm | VWR | 25373-041 | |
Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
Syringe 20mL | BD Scientific | 302830 | |
Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used |
Cellstar 50mL Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |