Capture and Release av Levedyktige Sirkulasjonstumorceller fra Blood

Summary

En protokoll for å utnytte en poly (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) belagt mikrofilter for effektiv fangst og thermoresponsive utgivelsen av levedyktige sirkulerende tumorceller (CTC) er presentert. Denne metoden gjør fangst av CTC fra pasientenes blod og påfølgende frigjøring av levedyktig CTC for nedstrøms off-chip kultur, analyser og karakterisering.

Abstract

Vi viser en metode for størrelse basert fangst av levedyktige sirkulerende tumorceller (CTC) fra helt blod, sammen med utgivelsen av disse cellene fra brikken for genetisk analyse og / eller kultur. Strategien sysselsetter bruk av en roman Parylene C membran slot pore mikrofilter for å fange CTC og et belegg av poly (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) for thermoresponsive levedyktig utgivelsen av den fangede CTC. Fangst av levende celler er aktivert ved å utnytte konstruksjonen av en spalte poregeometri med bestemte dimensjoner for å redusere skjærspenning typisk assosiert med filtreringsprosessen. Mens mikrofilter viser en høy fangsteffektivitet, er utgivelsen av disse cellene ikke-triviell. Vanligvis er bare en liten prosentandel av celler som frigjøres når teknikker slik som omvendt strøm eller celle skraping blir brukt. Den sterke adhesjon av disse epiteliale kreftceller til Parylene C membranen er knyttet til ikke-spesifikk elektrostatisk interaksjon. For å motvirke ther effekt, benyttet vi bruk av PIPAAm belegg og utnyttet sine termiske responsgrenseflateegenskaper for å frigjøre cellene fra filteret. Blod blir først filtrert ved romtemperatur. Under 32 ° C, er PIPAAm hydrofil. Deretter blir filteret plasseres enten i dyrkningsmedier eller en buffer holdt ved 37 ° C, noe som resulterer i PIPAAm snu hydrofobe, og deretter frigjøring av elektrostatisk bundne celler.

Introduction

Metastatisk sykdom er ansvarlig for de fleste kreftdødsfall. Utvikling prognostisk og følges diagnostisk biomarkør for metastasering er viktig i kreft ledelse og behandling. Sirkulerende tumorceller (CTC) spiller en sentral rolle i tumorspredning og metastasering. Videre er lett tilgjengelig som en "flytende biopsi 'biomarkør, CTC i kreftpasienters har perifert blod vært økende som en" arnested "for kreft biomarkør forskning. CTC har blitt godt validert som en prognostisk biomarkør i ulike kreft innstillinger, inkludert bryst, prostata og tykktarmskreft ^1-3. Imidlertid har nylige fremskritt i CTC felt indikerte at bare bestemmelse av disse sjeldne cellene har begrenset klinisk nytte, slik som vist i intervensjons kliniske forsøk ^4. Dermed er det et voksende behov for teknologi som gjør det mulig for molekylær og funksjonell karakterisering av CTC. Foreløpig bare få teknologier eksisterer som tillater for ikke-antigen partisk, levedyktig fangst og frigjøring av CTC, slik robust nedstrøms molekylær og funksjonell analyse ^5,6. Flertallet av disse microfabricated enhetene er koblet til microfluidic plattformer og dermed ha en begrensende faktor i mengden blod som som kan behandles, som spenner 2-4 ml ^7-10. CTC er sjeldne hendelser i et enkelt rør for blodprøvetaking (7,5 ml), og derfor ytterligere å redusere mengden av blod som kan behandles, i stor grad hindrer muligheten til å fange og å isolere disse cellene av interesse.

Vi har utviklet to typer Parylene C membran mikrofilter enheter for fangst av CTC som utnytter størrelsesforskjeller mellom større tumorceller og de mindre normale blodceller ^11,12. Vi har tidligere rapportert på den runde pore opplistingen filter og sammenlignet den med et FDA-godkjent plattform, hvor mikro ble vist å være overlegen i CTC fangsteffektivitetfor kreftpasient blodprøver ^13,14. Imidlertid er en begrensning av runden filteret er nødvendigheten av å bruke en formaldehydbaserte fikseringsmiddel før filtrering. Denne prosessen bevarer cellene morfologi samtidig som de kan motstå den skjærspenning og trykk under filtreringsprosessen. Mens opplisting og molekylære studier kan utføres på brikken ^13, svekker fiksativ evnen til å utføre funksjonell karakterisering. For å møte denne begrensningen, har vi utviklet et spor pore filter som fornekter nødvendigheten av å fikse cellene før filtrering (figur 1). Spalten poregeometri (6 um bredde x 40 um lengde spille porer) gjør det mulig for tumorceller til å bli fanget mens bare delvis okkludering av en pore, og således fremdeles tillater fri passasje for andre blodceller og lindre økningen i trykk som ville føre til celleskade og eventuell sprengning ^15,16 sporet pore patronen består av 2 akryl stykker som smørbrødslissen pore-filter mellom den øverste og nederste stykke med polydimetylsiloksan (PDMS) som virker som en pakning for å tilveiebringe en lekkasjesikker tetning ^14,15 (figur 1).

Mens fange effektiviteten av sporet pore-filter er høy, (tabell 1), det oppfangede CTC bundet til Parylene C membranen av sterke ikke-spesifikke elektrostatiske interaksjoner i stedet for ekstracellulær matriks (ECM) mediert adhesjon ^15. Metoder som omvendt strøm eller bruk av celle skrapere mislykkes i å effektivt frigjøre cellene fra filteret, eller resultere i celleskade og celledød. Vi utforsket en ukonvensjonell bruk av PIPAAm å formulere en utgivelse strategi ^15. PIPAAm er en polymer som gjennomgår en reversibel lavere kritisk oppløsningstemperatur (LCST) faseomvandling ved en løsningstemperatur på 32 ° C ^17. Tradisjonelt har denne egenskapen PIPAAm blitt mye utforsket for tissue engineering applikasjoner. Typisk celler erdyrket på PIPAAm belagte overflater ved 37 ° C når PIPAAm er hydrofobe. Cellene kan deretter tas av som en plate når dyrkningstemperaturen er forskjøvet til under 32 ° C, hvor den PIPAAm belagte overflaten blir hydrert ^17,18. Vi å utnytte dette termiske egenskapen ved å utføre filtreringen ved romtemperatur (under 32 ° C), og deretter muliggjøre celle frigivelse ved å plassere filteret i kulturmedier holdt ved 37 ° C. Ved denne temperatur blir det PIPAAm hydrofob polymerlaget, for derved å frigjøre det elektrostatisk bundne celler ¹⁵ (figur 1).

Selv om temperaturen responsive metode samt andre metoder har blitt iverksatt for å oppnå levedyktig CTC-fangst og slipp ^19-21, en nøkkel potensielle ulempen deles av disse teknologiene er rapportert, er at de alle ansette en antigen-avhengig prinsipp for CTC-fangst. Antigen basert CTC-fangst, som vist previously, kan føre til partisk CTC analyse ^11,14. For eksempel, mange affinitet-baserte teknologier ansette antistoff som binder EpCAM for CTC-fangst. Imidlertid CTC er blitt vist å uttrykke forskjellige nivåer av EpCAM, som fører til utelatelse av EpCAM lav og EpCAM negativ CTC av disse teknologiene. Dessuten kan det oppstå begrensninger når CTC fra ikke-epitelial opprinnelse er av interesse, slik som CTC i melanom og sarkom innstillinger. Dermed vil en teknologi som gjør det mulig for levedyktig CTC-fangst og slipp uten potensiell skjevhet introdusert av antigen basert fangst er svært ønskelig.

Viktigere er mikro fangst enheten rent størrelse basert og utgivelsen strategi er agnostiker til tilstedeværelsen av visse overflatemarkører. Vi mener at ansettelse av PIPAAm belagt mikrofilter vil bidra til å utvide vår forståelse av metastatisk prosess, gjennom å gi muligheten til å effektivt fange og slipp CTC for nedstrøms analyser. Dette kan potentially avsløre nye molekyler som nye målrettet systemisk behandling kan være rettet, samt gi en biomarkør som kan overvåkes enkelt og hjelpemiddel i kreftpasient ledelse.

Protocol

Etikk Uttalelse: For å beskytte rettighetene til mennesker, ble blodprøver innhentet etter et informert samtykke i henhold til protokoller godkjent av University of Miami institusjonell gjennomgang styrene etter IRB 20150020. MERK: Blood som skal filtreres for CTC-fangst skal samles i en EDTA rør for å hindre koagulasjon. 1. Coating Pollen med Poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Vei opp PIPAAm for å fremstille en 10% vekt / volum løsning i butanol. Bland ved hjelp av en vortex inntil l…

Representative Results

Ved hjelp av friske givere 'blod (oppnådd under en protokoll godkjent av University of Miami IRB 20150020 etter et informert samtykke) tilsatt kultiverte kreftceller, den thermoresponsive teknikk for frigjøring av levedyktige sirkulerende tumorceller (CTC), oppnådde fangst, utslipp og gjenfinning effektivitet på 94% ± 9%, 82% ± 5% og 77% henholdsvis ± 5% (tabell 1) 15. Til sammenligning, utsetting og innhenting effektivitet av ubelagte filter var si…

Discussion

Prosessen med å fange levedyktig CTC fra fullblod og slippe dem ut av mikrofilteret er relativt enkel; imidlertid noen kritiske punkter er verdt å nevne. Det er viktig, som med alle cellekultur som en steril tilstand opprettholdes gjennom hele prosessen. Det første trinnet av å belegge filteret med PIPAAm er kritisk, som grunnlag for teknikken for å frigjøre cellene fra filteret er basert på å utnytte PIPAAm største temperaturfølsomme grenseflateegenskaper. For å sikre at filteret er blitt belagt effektivt, m…

Materials

Slot Filter	Circulogix Inc.	MSF-01	Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)	Ploysciences Inc.	21458	Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol	Sigma Aldrich	B7906	Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides	Cole-Parmer	48510-30	Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater	Specialty Coating Systems	SCS G3 Spin Coater	Instrument
Polyimide Tape	Uline	S-7595	Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
1XPBS	Gibco	10010-023
McCoy's	Gibco	16600-082	Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case
Falcon Petri dishes 35×10 mm	VWR	25373-041
Microfilter Cassette	Circulogix Inc.	FC-01	Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine
Syringe 20mL	BD Scientific	302830
Syringe Pump	KD scientific	78-0100V	Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used
Cellstar 50mL Centrifuge tube	VWR	82050-322
Greiner Bio One 6 well plate	VWR	89131-688	Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells	ATCC	HTB-30
Live Dead Assay	Life Technologies	L3224	Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator	VWR	98000-368	Any incubator that can be used for cell culture will suffice