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Cancer Research

Captage et sortie de Viable cellules tumorales circulantes du sang

doi: 10.3791/54435 Published: October 28, 2016

Summary

Un protocole d'utiliser un poly (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) microfiltre enduit pour la capture efficace et la libération thermosensible de cellules viables tumorales circulantes (CTC) est présenté. Cette méthode permet la capture de CTC à partir du sang des patients et la libération subséquente de CTC viable pour la culture en aval hors puce, des analyses et de caractérisation.

Abstract

Nous démontrons une méthode pour la taille de capture à base de cellules viables de la tumeur de circulation (CTC) dans le sang total, ainsi que la libération de ces cellules de la puce pour l'analyse et / ou de la culture en aval. La stratégie emploie l'utilisation d'un roman Parylène C fente de la membrane poreuse microfiltre pour capturer CTC et un revêtement de poly (N--iso propylacrylamide) (PIPAAm) pour thermosensible libération viable du CTC capturé. La capture de cellules vivantes est activé en tirant parti de la conception d'une géométrie fente de pores avec des dimensions spécifiques pour réduire la contrainte de cisaillement généralement associé au processus de filtration. Alors que le microfiltre présente une grande efficacité de capture, la libération de ces cellules est non-trivial. Typiquement, seul un faible pourcentage de cellules sont libérées lorsque des techniques telles que l'écoulement inverse ou en grattant les cellules sont utilisées. La forte adhérence de ces cellules cancéreuses epitheliales sur la membrane de parylène C est attribuable à une interaction électrostatique non spécifique. Pour contrecarrer eest l'effet, nous avons utilisé l'utilisation du revêtement PIPAAm et exploité ses propriétés interfaciales sensibles à la chaleur pour libérer les cellules du filtre. Le sang est d'abord filtrée à température ambiante. En dessous de 32 ° C, PIPAAm est hydrophile. Ensuite, le filtre est placé soit dans les milieux de culture ou un tampon maintenue à 37 ° C, ce qui se traduit par la rotation PIPAAm hydrophobe, et en libérant ensuite les cellules liées électrostatiquement.

Introduction

La maladie métastatique est responsable de la plupart des décès par cancer. Développer biomarqueur de diagnostic et de pronostic compagnon pour la métastase est crucial dans la gestion et le traitement du cancer. les cellules tumorales circulantes (CTC) jouent un rôle central dans la diffusion de la tumeur et les métastases. En outre, étant facilement accessible comme une «biopsie liquide» biomarqueur, CTC chez les patients atteints d'un cancer du sang périphérique a augmenté comme un «foyer» pour la recherche sur les biomarqueurs du cancer. CTC ont été bien validé comme un biomarqueur pronostique dans divers milieux de cancer, notamment du sein, de la prostate et le cancer colorectal 1-3. Cependant, les avancées récentes dans le domaine de la CCT a indiqué que la seule énumération de ces cellules rares a limité l' utilité clinique, comme montré dans les essais cliniques interventionnels 4. Ainsi, il existe un besoin émergent pour les technologies qui permettent la caractérisation moléculaire et fonctionnelle de la CCT. Actuellement, seuls quelques technologies existent qui permettent for non-antigène polarisé, la capture viable et la libération de la CCT, ce qui permet robuste aval moléculaire et fonctionnelle analyse 5,6. La majorité de ces dispositifs micro - usinés sont couplées aux plates - formes microfluidiques et ont donc un facteur limitant dans la quantité de sang qui peut être traitée, qui varie de 2 à 4 ml 7-10. CTC sont des événements rares dans un seul tube de prélèvement de sang (7,5 ml), donc de réduire encore la quantité de sang qui peut être traitée, entrave considérablement les chances de capturer et isoler ces cellules d'intérêt.

Nous avons développé deux types de dispositifs Parylène C de la membrane de microfiltration pour la capture du tétrachlorure de carbone qui exploitent les différences de taille entre les plus grandes cellules tumorales et les cellules sanguines normales plus petites 11,12. Nous avons précédemment rapporté sur le filtre poreux de dénombrement rond et comparé avec une plate - forme approuvée par la FDA, où le micro - filtre a été montré supérieur au tétrachlorure de carbone efficacité de capturepour les échantillons de sang des patients du cancer 13,14. Cependant, une limitation du filtre ronde est la nécessité d'utiliser un fixatif à base de formaldéhyde avant la filtration. Ce processus préserve les cellules morphologie tout en leur permettant de résister à la contrainte et la pression de cisaillement pendant le processus de filtration. Alors que le dénombrement et des études moléculaires peuvent être réalisées sur la puce 13, le fixatif altère la capacité d'effectuer la caractérisation fonctionnelle. Pour remédier à cette limitation, nous avons développé un filtre à pores de fente qui nie la nécessité de fixer les cellules avant filtration (Figure 1). La géométrie fente de pores (6 pm largeur x 40 um pores de fente de longueur) permet aux cellules tumorales à capturer tout obstruant partiellement un pore et donc en permettant le passage libre pour d'autres cellules sanguines et atténuer la montée en pression qui conduirait à des dommages cellulaires et une éventuelle rupture 15,16 La fente de cartouche de pores est composé de 2 pièces qui prennent en sandwich acryliquesle filtre fente de pores entre la pièce supérieure et inférieure avec Polydiméthylsiloxane (PDMS) agissant comme un joint d' étanchéité pour fournir une fuite de joint étanche 14,15 (figure 1).

Bien que l'efficacité de capture du filtre fente de pores est élevé, (tableau 1), le CTC capturé sont liés à la membrane de parylène C par de fortes interactions non-spécifiques électrostatiques au lieu de la matrice extracellulaire (ECM) médiée adhérence 15. Des méthodes telles que l'écoulement inverse, ou l'utilisation de racleurs de cellules ne parviennent pas à libérer efficacement les cellules du filtre, ou entraîner des dommages aux cellules et la mort cellulaire. Nous avons exploré une utilisation non conventionnelle de PIPAAm pour formuler une stratégie de libération 15. PIPAAm est un polymère qui est soumis à une température de solution critique inférieure (LCST) la transition de phase réversible à une température de solution de 32 17 ° C. Traditionnellement, cette propriété de PIPAAm a été largement explorée pour les applications d'ingénierie tissulaire. Habituellement, les cellules sontles surfaces cultivées sur PIPAAm enrobé à 37 ° C lorsque PIPAAm est hydrophobe. Les cellules peuvent ensuite être détachées sous forme de feuille quand la température de la culture est déplacée au - dessous de 32 ° C, où la surface revêtue PIPAAm devient hydratée 17,18. Nous avons exploité cette propriété thermique en effectuant le processus de filtration à la température ambiante (inférieure à 32 ° C), puis permettre la libération de cellules en plaçant le filtre dans les milieux de culture maintenue à 37 ° C. A cette température, la couche de polymère devient hydrophobe PIPAAm, libérant ainsi les cellules liées électrostatiquement 15 (figure 1).

Bien que la méthode sensible à la température, ainsi que d' autres méthodes ont été mises en œuvre avec succès pour atteindre viable capture CTC et de libérer 19 - 21, une clé inconvénient potentiel partagé par ces technologies déclarées est qu'ils emploient tous un principe de l' antigène dépendant de la CCT capture. Capture d'antigène CTC sur la base, comme le montre la précédemment, peut conduire à une analyse biaisée CTC 11,14. Par exemple, de nombreuses technologies basées sur l'affinité emploient anticorps qui se lie EpCAM pour le CTC capture. Cependant, la CCT a été montré pour exprimer différents niveaux de EpCAM, conduisant à une omission de EpCAM faible et EpCAM CTC négative par ces technologies. En outre, les limitations peuvent se produire lorsque la CCT d'origine non épithéliale est d'intérêt, tels que la CCT dans les milieux de mélanome et le sarcome. Ainsi, une technologie qui permet la capture et la libération viable CTC sans biais potentiel introduit par l'antigène à base de capture est hautement souhaitable.

Fait important, le dispositif microfiltre de capture est purement dimensionnée sur la base et la stratégie de libération est agnostique à la présence de certains marqueurs de surface. Nous croyons que l'emploi du microfiltre revêtu PIPAAm aidera à élargir notre compréhension du processus métastatique, en fournissant la capacité de capturer et libérer la CCT pour les analyses en aval efficace et efficiente. Cela peut puissanteexposer ially nouvelles molécules pour lesquelles de nouvelles thérapies ciblées systémiques pourraient être dirigés ainsi que de fournir un biomarqueur qui peut être contrôlé facilement et l'aide dans le cancer de gestion des patients.

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Protocol

Déclaration éthique: Pour protéger les droits des sujets humains, des échantillons de sang ont été obtenus suite à un consentement éclairé dans les protocoles approuvés par l'Université de Miami examen institutionnel des conseils en vertu de la CISR 20150020.
NOTE: Le sang à filtrer pour le CTC capture doit être recueillie dans un tube EDTA pour empêcher la coagulation.

1. Le revêtement du Microfilter avec Poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)

  1. Peser PIPAAm pour préparer une solution à 10% p / v dans le butanol. Mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution soit limpide.
  2. Cut plastique microscope glisse dans environ 12 mm x 12 mm carrés, soit avec une paire de ciseaux ou lame tranchante. Vous pouvez également utiliser une guillotine.
    NOTE: Ces carrés serviront de support pour les filtres au cours du processus de revêtement par centrifugation.
  3. En utilisant une paire de ciseaux de bord droit, couper la fente pore microfiltre tranche en 8 mm x 8 mm carrés.
  4. L'utilisation d'une bande de film de polyimide sécuriser les filtres de coupe sur le squa plastiqueres préalablement coupé à l'étape 1.3. Appliquer le film uniquement sur le bord et le coin du filtre de telle sorte qu'au moins 7 mm x 7 mm de la surface du filtre est non-couverte par la bande.

Figure 2
Figure 2:. Illustration représentant du Microfilter Set-up pour PIPAAm Coating 8 mm x 8 mm microfiltre est positionné sur le 12 mm x 12 mm en plastique coupe carrée à partir d' une lame de microscope en plastique. Bande de polyimide est utilisé pour sécuriser le microfiltre en place pour faire tourner le manteau PIPAAm.Reproduced avec la permission de la référence 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Placez le microfiltre qui est fixé sur la place du plastique, sur le mandrin à vide du spin-coater.
  2. Programmer le spin-coater la recette suivante: Démarrer, 500 rpm pendant 10 secondes, 6000 rh pendant 60 s, 500 rpm pendant 10 secondes, Stop.
  3. Puiser une quantité suffisante de 10% p / v solution PIPAAm (préparé en 1.1) pour couvrir complètement la surface du microfiltre à l'aide d'une pipette de transfert en plastique standard et démarrer la tournette.
  4. Retirez le microfiltre enduit PIPAAm du spin-coater après le processus de revêtement est terminé. Laissez le filtre attaché au carré en plastique pendant le stockage.
    NOTE: L'enduit-filtre peut être conservé à température ambiante pendant jusqu'à 3 mois.

2. Assemblée de Filtration Cassette avec Microfilter PIPAAm Coated

  1. Réhydrater PIPAAm microfiltre enduit à la température ambiante en plaçant le microfiltre encore fixé sur la place du plastique dans une boîte de Pétri. Ajouter 1x PBS jusqu'à ce que le microfiltre est complètement immergé et laisser reposer pendant 5 min.
  2. Après l'étape d'hydratation, libérer le filtre de la place en plastique en coupant la bande de film de polyimide en utilisant une paire de ciseaux.
    REMARQUE: Prenez note de quel côté du filtre ale revêtement PIPAAm.
  3. Assembler le microfiltre dans la cassette de filtration, en intercalant le microfiltre entre la pièce en acrylique et en bas, ainsi que les pièces 2 Polydiméthylsiloxane (PDMS) agissant comme un joint / joint. Fixer la cassette acrylique avec clips pour fixer le filtre et fournir un joint étanche.
    NOTE: Le revêtement PIPAAm doit être orientée vers le haut, de sorte que l'échantillon est filtré à travers, les cellules sont capturées sur PIPAAm surface revêtue du filtre (figure 1).

3. Filtration de l'échantillon de sang avec Capture et sortie du CTC de la Microfilter

  1. Comme chaque marque de pompe de seringue a sa propre interface utilisateur, reportez-vous au manuel d'utilisation de la pompe et programmer la pompe seringue à circuler à un débit de 75ml / h et régler le volume à 20 ml.
  2. Chaud 3 ml de milieu (disponible dans le commerce), de culture de cellules de McCoy (préparée en ajoutant 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline et de streptomycine) à 37 ° C.
  3. Ajouter 7,5 ml de solution saline équilibrée disponible dans le commerce de Hank (HBSS) à 7,5 ml de sang échantillon et aspirer ce sang dilué dans une seringue de 25 ml.
    REMARQUE: Réglez le volume de HBSS de sorte que l'échantillon de sang est dilué avec un volume égal de 1: 1 avec HBSS Par exemple , si 10 ml de sang est utilisé, puis mélanger avec un volume égal de 10 ml de HBSS pour obtenir le 1: 1. Dilution.
  4. Engager la cassette de filtration avec la seringue et placez-le sur la pompe à seringue. Placer un tube de 50 ml à fond pour recueillir l'écoulement à travers et démarrer la pompe.
    NOTE: La filtration devrait prendre environ 10 à 12 min. Toutes les étapes de filtration doivent être transportésà température normale ambiante (20-25 ° C), y compris l'étape 3.8
  5. Après filtration est terminée, dégager la cassette de filtration prenant note de quel côté est le sommet qui a les cellules capturées sur la surface PIPAAm revêtu. Aspirer 1 ml de milieu de culture chaud dans une nouvelle seringue.
  6. Réengager la cassette de filtration, avec la seringue contenant le support, mais cette fois-ci engage l'extrémité inférieure de la cassette, de sorte que la surface revêtue de PIPAAm du filtre est tournée à l'opposé de la seringue.
    NOTE: Ce sera pour libérer les cellules qui peuvent être incorporées dans les pores de fente en appliquant le flux inverse douce.
  7. Placez la seringue sur la pompe à seringue et tenir une petite boîte de Pétri ou d'une plaque à 6 puits juste sous la cassette de filtration. Réglez le débit à 100 ml / h débit et démarrer la pompe.
  8. Passez tous les médias à travers le filtre et de recueillir l'écoulement dans la boîte de Pétri. Attendez que tous les médias de passer à travers, puis arrêter la pompe et retirer la seringue une filtration cassette de la pompe.
  9. Dégager la cassette de filtration de la seringue et l'ouvrir pour récupérer le filtre à partir de la cassette. Placer le filtre avec la surface PIPAAm vers le bas dans la même boîte de Pétri utilisé pour recueillir le flux inverse lors de la libération des cellules des pores. Ajouter le reste des médias chauds et placer la boîte de Pétri dans un incubateur de culture fixée à 37 ° C.
  10. Après 30 minutes, toutes les cellules sont libérées du filtre. Cependant, laisser le filtre dans la boîte de Pétri pendant 24 heures pour assurer que toutes les cellules se détachent.
    NOTE: En variante, les cellules libérées peuvent être collectées dans un tube à centrifuger pour effectuer une analyse plus poussée en aval telles que la PCR, ELISA, Western Blot pour ne citer que quelques exemples.
  11. Après 24 heures de culture, retirez délicatement le microfiltre en utilisant une pince.
    REMARQUE: Le filtre peut être jeté à ce moment que les cellules ont été libérés de lui.
  12. pipette doucement le milieu de culture de haut en bas en utilisant un & # 1000181; l pipette, pour remettre en suspension les érythrocytes et les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) qui sont capturés sur le filtre et libéré dans la plaque avec la CCT. Effectuer soigneusement et lentement cette action pour éviter le détachement des cellules cancéreuses faiblement jointes. Retirez délicatement le support ensemble contenant les érythrocytes remises en suspension et PBMC tout en laissant derrière les cellules cancéreuses ci-joint et les remplacer avec un milieu frais préchauffé à 37 ° C.
    REMARQUE: Cette étape peut être répétée une fois si les érythrocytes excessives sont présents après un lavage.

4. CTC évaluation Viabilité

  1. Évaluer la viabilité de culture CTC en utilisant un test en direct / Dead 8.
    NOTE: De nombreux essais en direct / Dead sont disponibles dans le commerce. Après le protocole du fabricant est fortement conseillé. S'il vous plaît se référer à la liste des matières / réactifs pour le kit d'essai commercial utilisé pour cette expérience.

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Representative Results

L'utilisation du sang de donneurs sains (obtenu en vertu d'un protocole approuvé par l'Université de Miami CISR 20.150.020 suite à un consentement éclairé) dopés avec des cellules cancéreuses en culture, la technique thermosensible pour la libération de cellules viables circulant tumorales (CTC), la capture réalisée, la libération et l'efficacité de la récupération de 94% ± 9%, 82% ± 5% et 77% ± 5% , respectivement (tableau 1) 15. Par comparaison, la libération et la récupération efficacité des filtres non enrobés ont été significativement plus faible (7% ± 1% d' efficacité de séparation et 6% ± 1% d' efficacité de récupération) (tableaux 1) 15. Afin d'évaluer la viabilité des CTCs libérés de filtre, ~ 1000 SK-Br-3 cellules ont été injectés dans 7,5 ml de sang de donneur sain, filtré à travers le filtre à sous enduit PIPAAm et libéré en utilisant la méthode décrite ci-dessus. Un essai en direct / Dead a été réalisée pour évaluer la viabilité cellulaire avant pointe dans le sanget après la libération. La viabilité de pré-pic était de 98% (592 sur 602 cellules comptées) et la viabilité des cellules capturées et libérées dans le sang était de 95% (540 sur 567 cellules comptées) 15 (figure 3A). En parallèle, les cellules capturées et libérées après la filtration de l'échantillon de sang ont été cultivées dans du milieu de culture 5A de McCoy. Les images ont été prises au jour 3 et le jour 10. Comme le montre la figure 3B, les cellules libérées par le filtre non seulement sont restées viables, mais une expansion rapide dans la culture, établissant ainsi leur viabilité filtration de poste.

Figure 1
Figure 1:. PIPAAm Coated Filtres à sous pour capturer et Circulating sortie des cellules tumorales du sang (panneau supérieur) (A) l' image Brightfield de PIPAAm filtre à fente revêtu; (B) La filtration du sang total pour la CCT capture. (C) Schéma de la til microfiltre la cassette où le, filtre à fente revêtu PIPAAm est prise en sandwich entre la partie supérieure et de la cassette inférieure. (Panneau inférieur) (D) Schéma du processus pour libérer capturé CTC à partir de filtres à sous enduits PIPAAm. Reproduit avec la permission de la référence 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Cellules de capture, de presse et de la culture de cellules tumorales viables cancer du sein (SKBR-3) dopés dans le sang du donneur normal ont été capturés et libéré en utilisant un microfiltre enduit PIPAAm: Figure 3.. Les cellules sont restées après la libération viables et développées en culture rapidement. (A) Essai direct mort effectué sur les cellules libérées du filtre. 95% (540 sur 567 cellules comptées) des cellules viables a montré(Vert) après la publication. Les cellules mortes sont marqués en rouge. (B) Jour 3 au jour 10 de la culture des cellules libérées du filtre à fente revêtu PIPAAm. Les cellules sont restées viables et élargi dans la culture. Barre d'échelle = 100 μm.Reproduced avec la permission de la référence 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Mesure des paramètres Pore Pré- et Post- PIPAAm Coating images de fond clair filtre à fente (A) avant et (B) post - revêtement PIPAAm.. Longueur (C) Pore a diminué de 7,3% ± 2,1% après PIPAAm revêtement et pores de largeur a été réduite de 15,3% ± 5,6% après le revêtement PIPAAm. Reproduit avec la permission de la référence 15.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: contaminantes érythrocytes et leucocytes sont éliminés par Douces Washes Environ 1000 SKBR-3 cellules ont été récupérées à partir du sang par le filtre à sous enduit PIPAAm et ont été étalées sur une plaque de 48 puits.. (A) A 16 h dans la culture, les cellules SKBR-3 tumorales adhérant à une plaque de culture (flèches vertes), tandis que les érythrocytes et les leucocytes apoptotiques ont également été installent au bas de la plaque (flèches rouges). (B) Post-lavage, les cellules non-adhérentes ont été retirées, laissant les cellules tumorales adhérentes sur la plaque (flèches vertes). Reproduit avec la permission de la référence 15. S'il vous plaîtcliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1
Tableau 1:. Capture, sortie et de recherche Efficacité de PIPAAm Filtres à sous enduit capture efficacité = nombre de cellules capturées sur le filtre avant les numéros de presse / cellulaires injectés dans le sang. Relâchez le nombre de cellules d'efficacité = libérés des numéros de filtre / cellules capturées sur le filtre avant la libération. L' efficacité de récupération = nombre de cellules libérées à partir des numéros de filtre / cellulaires enrichis en blood.Reproduced avec la permission de la référence 15.

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Discussion

Le processus de capture CTC viable à partir du sang total et en les libérant du microfiltre est relativement simple; cependant quelques points critiques méritent d'être mentionnés. Il est impératif, comme avec toute la culture cellulaire qu'une condition stérile est maintenue grâce à l'ensemble du processus. La première étape de revêtement du filtre avec PIPAAm est critique, car la base de la technique de libérer les cellules du filtre est basée sur l'exploitation des propriétés interfaciales de température sensible de PIPAAm. Pour assurer que le filtre a été appliqué de manière efficace, de mesurer la taille d'un pore (largeur et longueur d'un pore de la rainure) sur le filtre sous un microscope avant le revêtement, puis mesurer à nouveau un revêtement taille des pores de poste. La taille des pores doit être diminuée de 1 pm sur la largeur et la longueur (figure 4). Comme mentionné précédemment, le filtre de CTC fente tout en capturant de manière efficace, capte aussi quelques grosses cellules PBMC, toutefois, ces cellules sont des cellules non-adhérentes et, par conséquent duri3,13 ng étape sont éliminés de la culture en laissant les cellules cancéreuses adhérentes (figure 5).

Des modifications mineures au protocole peuvent être nécessaires si différents volumes de sang doivent être filtrés ou dans les cas où la viscosité est extrêmement élevé. Comme mentionné dans le protocole, il est essentiel pour diluer le sang 1: 1 avec HBSS. La viscosité du sang varie d'un patient à l'autre, mais pour la plupart, ce ne sera pas affecter la filtration. Il y aura certains cas où la viscosité est excessivement élevée ou excessivement gros caillots sont présents, auquel cas la pompe à seringue ne sera pas capable de forcer le sang à travers le filtre. Il est conseillé dans ces cas pour arrêter la pompe de seringue, dégager la cassette de la seringue, ouvrir la partie supérieure de la cassette, mais laisser le filtre encore attaché à la partie inférieure. Les grands caillots de sang seront facilement visibles sur le filtre. pipette doucement 1 ml de HBSS sur le filtre tout en maintenant la cassette à un léger angpour permettre le caillot de se laver au large. Une fois le caillot a été enlevé, fermer la cassette, re-engager à la seringue et continuer filtration.

Bien que les filtres revêtus PIPAAm peuvent être réalisés par lots et stockées pour une utilisation ultérieure, nous avons constaté que la durée de vie de ces filtres pré-enduit est d'environ 3 mois. La capture et la libération des cellules efficaces peuvent être diminuées en partie en raison de la dégradation PIPAAm au fil du temps.

L'un des facteurs limitatifs pour établir une culture du patient, la CCT se situera dans le nombre de CTC qui sont présents dans l'échantillon de sang. De faibles effectifs vont probablement faire la possibilité d'étendre les cellules extrêmement difficile, voire impossible. Cependant, séquestrant un échantillon avec une faible numération dans les zones de culture plus petits peut aider, comme dans un seul puits de plaque à 96 puits à la place d'une plaque à 6 puits. L'identification des milieux de culture, ou la modification de disponible dans le commerce des médias, qui fournira un environnement optimal for ces cellules à croître est un autre défi que devra surmonter.

Des analyses moléculaires et cellulaires de la CTC fournissent des informations précieuses pour le pronostic du cancer et peuvent aider à la médecine de précision d'entraînement 15. La viabilité des cellules libérées du filtre de capture est un développement clé vers la capacité du patient à la culture de tétrachlorure de carbone pour les tests de sensibilité aux médicaments et le dépistage. Il est connu depuis longtemps que les CTC ont tendance à différer de la tumeur primaire et donc la nécessité de traiter à la fois en conséquence. A titre d'exemple, Schneeweiss et al. ont rapporté que dans le cancer du sein métastatique (MBC), des profils antigéniques de tissu métastatique et la tumeur primaire varient jusqu'à 20% des patients. Réévaluation des marqueurs prédictifs, y compris le récepteur du facteur de croissance épidermique humain 2 (HER2) expression, pourrait aider à optimiser le traitement MBC. Bien que l'échantillonnage des tissus est invasive et souvent difficile à répéter, l'analyse de la CCT exige seulement un échantillon de sang et pourrait fournir un, en temps réel & # facile à répétition34; liquide biopsie "approche 22.

Une importance majeure de cette technique réside dans le fait que, bien que plusieurs plates-formes communément utilisées dans la CCT capture et les analyses sont limitées dans les analyses moléculaires et cellulaires comme fixatif est nécessaire pour le traitement de l'échantillon ou le tétrachlorure de carbone sont immobilisés sur la plate-forme. En outre, les systèmes basés par affinité, qui permettent la capture et la libération viable CTC, peuvent potentiellement être biaisés par le choix de l' antigène cible 15. En variante, le filtre à fente avec le revêtement PIPAAm fournit une plate-forme libre d'étiquette qui est efficace et efficiente dans la capture et la libération de la CCT viable du sang total. Cette méthode offre la possibilité pour une caractérisation plus poussée de CTC viable, y compris phénotypique d' une cellule unique et de l' analyse génomique, ainsi que la culture ex vivo CTC.

Des travaux sont actuellement en cours pour employer cette technologie pour des applications cliniques. La capacité à efficacement la culture de la CCT de patient échantillons conduiront à la formulation des régiments de thérapie efficace sur un patient à l'autre base, révéler de nouvelles cibles médicamenteuses, et conduire au développement de médicaments chimiothérapeutiques efficaces.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slot Filter Circulogix Inc. MSF-01 Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)  Ploysciences Inc. 21458 Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol Sigma Aldrich B7906 Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides Cole-Parmer 48510-30 Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater Specialty Coating Systems SCS G3 Spin Coater Instrument
Polyimide Tape Uline S-7595 Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
1x PBS Gibco 10010-023
Falcon Petri dishes 35 x 10 mm VWR 25373-041
Microfilter Cassette Circulogix Inc. FC-01 Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine 
Syringe 20 ml BD Scientific 302830
Syringe Pump KD scientific  78-0100V Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used
Cellstar 50 ml Centrifuge tube VWR 82050-322
Greiner Bio One 6 well plate VWR 89131-688 Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells ATCC HTB-30
Live Dead Assay Life Technologies L3224 Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator VWR 98000-368 Any incubator that can be used for cell culture will suffice

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References

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Captage et sortie de Viable cellules tumorales circulantes du sang
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Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).More

Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).

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