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Cancer Research

캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스

doi: 10.3791/54435 Published: October 28, 2016

Summary

프로토콜은 폴리 (N -iso - 프로필 아크릴) 효과적인 캡처 및 가능한 순환 종양 세포 (CTC)의 thermoresponsive 릴리스 (PIPAAm) 코팅 된 마이크로 제시를 활용합니다. 이 방법은 분석 및 특성, 하류 오프 - 칩 문화에 대한 환자의 혈액과 가능한 CTC의 후속 릴리스에서 CTC를 캡처 할 수 있습니다.

Abstract

우리는 다운 스트림 분석 및 / 또는 문화 칩에서 이러한 세포의 출시와 함께, 전체 혈액에서 가능한 순환 종양 세포 (CTC)의 크기를 기반으로 캡처하는 방법을 보여줍니다. 전략은 CTC CTC 및 캡처의 thermoresponsive 가능한 릴리스 코팅 폴리 (N--iso 프로필 아크릴) (PIPAAm)를 캡처하는 신규 파릴 렌 C 막 슬롯 마이크로 기공의 사용을 이용한다. 생균의 촬영은 일반적으로 여과 공정과 관련된 전단 응력을 줄이기 위해 특정 치수를 갖는 슬롯이 기공 구조의 설계를 활용하여 사용할 수있다. 마이크로 필터는 높은 포집 효율을 나타내는 반면,이 세포의 방출이 아닌 사소한입니다. 이러한 역류 또는 세포 스크랩과 같은 기술을 사용하는 경우 일반적으로 세포의 작은 비율은 해제된다. 파릴 렌 C 막 이러한 상피 암세포의 강한 접착력 비특이적 정전 기적 상호 작용에 기인한다. 일을 방해하기효과 우리 PIPAAm 코팅의 사용을 사용하여 필터로부터 세포를 분리하는 열적 반응 형 계면 성질을 이용. 혈액 제 실온에서 여과 하였다. 32 ° C 아래 PIPAAm는 친수성이다. 그 후, 필터는 배양 배지 또는 소수성을 회전시키고,이어서 세포 정전기 결합 해제 PIPAAm 결과 37 ° C로 유지 된 버퍼 하나에 배치된다.

Introduction

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전이성 질환은 대부분의 암 사망에 대한 책임이 있습니다. 전이에 대한 예후 및 동반자 진단 바이오 마커의 개발은 암 관리 및 치료에 매우 중요하다. 순환 성 종양 세포 (CTC)를 보급 종양 및 전이에 중요한 역할을 담당한다. 또한, '액체 생검'바이오 마커로 쉽게 접근 할 수있는, 암 환자에서 CTC 암 바이오 마커 연구를위한 온상 ''말초 혈액은으로 증가하고있다 '. 3 - CTC 잘 유방암, 전립선 암과 대장 암 1 등 다양한 암 설정에서 예후 바이오 마커로 확인되었다. 그러나, CTC 분야에서 최근의 발전은 중재 임상 4에 도시 된 바와 같이, 이러한 희귀 세포의 단순한 열거, 임상 적 유용성을 제한 것을 지시 하였다. 따라서, CTC의 분자 및 기능 특성 수 있도록 기술에 대한 신흥 필요가있다. 현재, 몇 가지 기술은 fo를 허용하는 존재R 비 항원 바이어스, 가능한 캡처 및 CTC의 방출, 강력한 다운 스트림 분자 및 기능 분석 5,6을 가능하게한다. 이러한 미세 소자의 대부분은 마이크로 유체 플랫폼에 결합되고, 따라서 2-4 ml의 7 내지 그 처리 할 수있는 혈액의 양에 제한 요소가있다 - 10. CTC 크게 캡처 관심이 세포 분리의 가능성을 방해하므로 상기 피 처리 수의 양을 줄일 채혈 (7.5 ㎖)의 단일 튜브 희귀 이벤트이다.

우리는 더 큰 종양 세포와 작은 정상 혈구 세포 (11, 12) 사이의 크기 차이를 이용 CTC의 캡처 파릴 렌 C 막 마이크로 디바이스의 두 가지 유형을 개발 하였다. 우리는 이전에 둥근 구멍 열거 필터보고 및 마이크로은 CTC 포착 효율이 우수한 것으로 도시 된 FDA 승인 플랫폼과 비교 한암 환자의 혈액 샘플 13, 14합니다. 다만, 원형 필터의 한계를 여과 전에 포름 알데히드 계 고정 제를 사용할 필요가있다. 이 프로세스는이를 여과 과정 전단 응력 및 압력을 견딜 수 있도록하면서 세포 형태를 보존한다. 열거 분자 연구가 온 - 칩 (13)을 수행 할 수 있지만, 정착액 기능적 특성화를 수행하는 능력을 손상시킨다. 이러한 한계를 해결하기 위해 여과 전에 셀 (도 1)를 고정 할 필요성을 부정 슬롯 기공 필터를 개발했다. 슬롯 구멍 형상 (6 μm의 폭 × 40 μm의 길이 슬롯 구멍)은 단지 부분적으로 또 다른 혈액 세포 자유로운 통과를 허용하고 세포 손상을 초래할 것이다 압력 상승을 완화 따라서 세공 폐색하면서, 종양 세포를 포착 할 수 있도록 및 최종 버스트 15,16 슬롯 기공 카트리지는 샌드위치 2 아크릴 조각으로 구성된다개스킷 등의 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 작용과 상부 및 하부 부분들 사이의 슬롯 기공 필터는 누수 방지 시일 (14, 15) (도 1)를 제공한다.

슬롯 구멍 필터의 포집 효율이 높은 반면, (표 1), 촬상 CTC 대신 접착 15 매개 된 세포 외 기질 (ECM)의 강한 비특이적 정전 기적 상호 작용에 의해 파릴 렌 C 막에 결합된다. 이러한 역류 또는 세포 스크레이퍼를 사용하는 등의 방법 효과적으로 필터에서 세포를 분리, 또는 세포 손상 및 세포 사망을 초래할 실패합니다. 우리는 릴리스 전략 (15)을 수립하는 PIPAAm의 자유로운 사용을 탐험했다. PIPAAm 32 °의 용액 온도 17 C 가역적 낮은 임계 용액 온도 (LCST) 상전이 중합체이다. 전통적으로, PIPAAm의이 속성을 널리 조직 공학 응용 프로그램에 대해 탐구하고있다. 일반적으로 세포는PIPAAm에서 배양 PIPAAm은 소수성 인 경우 37 ℃에서 표면을 코팅. 배양 온도는 PIPAAm 코팅면 (17, 18)이된다 수화 32 ° C, 아래로 시프트 될 때 세포를 시트로 분리 될 수있다. 우리는 실온 (아래 32 ° C)에서 여과 공정을 수행 한 후 37 ° C로 유지 배지에 필터를 배치하여 세포 분리를 가능하게함으로써 열 특성을 이용. 이 온도에서, PIPAAm 중합체 층함으로써 정전 결합 된 셀 (15) (도 1)를 개방, 소수성이된다.

온도 감응 방법뿐만 아니라 다른 방법들이 성공적 19 생존 CTC 캡처를 달성하고 방출하도록 구현하였으나 -보고 된 이러한 기술이 공유 21 번 키 잠재적 인 결점들은 모두 CTC 캡쳐 항원 - 의존적 원리를 채용한다는 것이다. 항원 기반 CTC 캡처, 그림과 같이 페이지reviously, 바이어스 CTC 분석 11,14 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 선호도 기반 기술은 CTC 캡쳐는 EpCAM 결합 된 항체를 사용한다. 그러나, CTC는 이러한 기술로는 EpCAM 저와는 EpCAM 부정적인 CTC의 누락에지도는 EpCAM의 다양한 수준을 표현하는 것으로 나타났다. 비 상피 기원에서 CTC는 흑색 종 및 육종 설정에서 같은 CTC 같은 관심의 경우 또한 제한이 발생할 수 있습니다. 따라서, 항원 기반 캡처에 의해 도입 된 잠재적 인 편견없이 실행 가능한 CTC 캡처 및 출시 할 수있는 기술은 매우 바람직하다.

중요하게는, 마이크로 캡쳐 디바이스는 순수 기초 크기 및 분리 전략은 특정 표면 마커의 존재에 무관하다. 우리는 PIPAAm 코팅 된 마이크로의 고용 효과적이고 효율적으로 캡처 및 다운 스트림 분석을 위해 CTC를 해제 할 수있는 기능을 제공함으로써, 전이성 과정에 대한 우리의 이해를 확장하는 데 도움이 될 것입니다 믿습니다. 강력한이 5 월ially 쉽게 모니터링하고 암 환자 관리에 도움 될 수있는 바이오 마커를 제공하기 때문에 새로운 타겟 전신 치료가 아니라 감독 할 수있는 새로운 분자를 노출합니다.

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Protocol

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윤리 정책 : 인체의 권리를 보호하기는 혈액 샘플은 IRB 20,150,020 아래 마이애미 기관 생명 윤리위원회의 대학 승인 프로토콜 아래에 동의 다음 얻었다.
주 : CTC 캡쳐 필터링 혈액 응고를 방지하기 위해 EDTA 튜브에 수집한다.

1. 폴리 (N-이소 프로필 아크릴) (PIPAAm)와 마이크로 필터 코팅

  1. 부탄올 10 % w / V 수용액을 제조 PIPAAm을 단다. 용액이 깨끗해질 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다.
  2. 컷 플라스틱 현미경은 가위 또는 날카로운 블레이드 한 쌍의 대략 12mm X 12mm 사각형 하나에 슬라이드. 또는 단두대를 사용합니다.
    주의 : 이러한 사각형 스핀 코팅 과정 동안 필터 홀더로서 기능한다.
  3. 직선 가위의 날카로운 쌍을 사용하여, 8mm X 8mm 사각형으로 슬롯 기공 마이크로 웨이퍼를 잘라.
  4. 플라스틱 SQUA에 컷 필터를 확보 폴리이 미드 필름 테이프를 사용하여입술 이전 단계 1.3에서 잘라. 필터 영역의 최소 7mm X 7mm가되지 않은 덮인 테이프가되도록 단지 가장자리와 필터의 코너로 필름을 적용합니다.

그림 2
그림 2 :. PIPAAm 코팅 8mm × 8 밀리 마이크로위한 마이크로 필터 세트 업의 대표적인 그림은 플라스틱 현미경 슬라이드에서 12mm X 12mm 플라스틱 사각 컷에 위치한다. 폴리이 미드 테이프를 참조 (15)의 허가 코트에게 PIPAAm.Reproduced 스핀 장소에서 마이크로을 확보하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 스핀 코터의 진공 척에, 플라스틱 광장에 고정 된 마이크로 놓습니다.
  2. 시작, 10 초 동안 500 rpm으로, 6000 R : 다음 조리법에 스핀 코터 프로그램60 초, 10 초, 정지 500 RPM에 대한시.
  3. PIPAAm 용액 V 완전히 표준 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 마이크로 표면을 커버하고, 스핀 코터를 시작 (1.1 제조) / w 10 %만큼을 분배.
  4. 코팅 처리 종료 후, 스핀 코터에서 코팅 PIPAAm 마이크로 제거. 보관시 플라스틱 광장에 부착 된 필터를 둡니다.
    주 : 코팅 된 필터는 최대 3 개월 동안 실온에서 저장 될 수있다.

PIPAAm 코팅 마이크로 필터 여과 카세트 2. 총회

  1. 여전히 페트리 접시에 플라스틱 광장에 고정 된 마이크로 필터를 배치하여 실온에서 PIPAAm 코팅 된 마이크로을 재수. 마이크로 필터가 완전히 침수 될 때까지 1X PBS를 추가하고 5 분 동안 서 보자.
  2. 수화 공정 후에, 가위의 쌍을 사용하여 폴리이 미드 필름 테이프를 절단하여 사각형의 플라스틱 필터를 해제.
    참고 :이 필터의 어느 쪽을 기록해 둡니다PIPAAm 코팅.
  3. 2 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 개는 개스킷 / 밀봉 역할과 함께 상하 아크릴 부재 사이의 마이크로 필터를 개재하여, 여과 카세트에 마이크로 필터를 조립한다. 필터를 확보하고 꽉 밀봉을 제공하는 클립 아크릴 카세트를 클램프.
    주의 : 샘플을 통해 여과 될 때, 세포 필터 (도 1)의 표면에 도포 PIPAAm 캡처한다 있도록 PIPAAm 코팅을 위쪽으로 향하게한다.

마이크로 필터에서 캡처 및 CTC의 출시와 혈액 샘플 3. 여과

  1. 각 주사기 펌프 브랜드가 자신의 사용자 인터페이스를 가지므로, 펌프의 사용자 매뉴얼을 참조 75ml / 시간의 속도로 유동하고 20 ㎖의 부피를 설정 주사기 펌프를 프로그래밍.
  2. 맥코이 (상업적으로 입수 할 수 있음) 세포 배양액의 따뜻한 3 ㎖를 37 ℃까지 (10 % 태아 소 혈청 및 1 % 페니실린 스트렙토 마이신에 첨가하여 제조 됨).
  3. 7.5 ml의 혈액 샘플에 시판 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 7.5 ML을 추가하고 25 ML의 주사기에이 희석 된 혈액을 대기음.
    1 희석 혈액 10 ml를 사용하는 경우, 하나를 달성하기 위해 10 ㎖의 HBSS의 동량 혼합 HBSS 1 :. 주 : 혈액 샘플 (1)의 동일 부피로 희석되도록 HBSS의 볼륨을 조정한다.
  4. 주사기와 여과 카세트를 참여하고 주사기 펌프에 배치합니다. 을 통해 흐름을 수집하고 펌프를 시작하기 위해 바닥에 50 ML 튜브를 놓습니다.
    참고 : 여과 대략 10 - 12 분 소요됩니다. 모든 여과 단계를 수행하여야단계 3.8를 포함하여 상온 (20 ~ 25 °에 C)에서 아웃
  5. 여과가 완료되면, 어느 측 PIPAAm 코팅 표면에 잡힌 셀이 상위 인 여과 카세트 촬영 주 분리. 기음 새로운 주사기에 따뜻한 배양 배지 1 ㎖.
  6. 매체를 포함하는 주사기 여과 카세트를 다시 결합하는 -하지만, 필터의 PIPAAm 도포면이 얻어 주사기에서 향하도록이 때 카세트의 하단부를 결합.
    주 :이 완만 역방향 흐름을 적용하여 슬롯 구멍에 삽입 될 수있는 셀을 분리하는 것이다.
  7. 다시 주사기 펌프 위에 주사기를 놓고 오른쪽 여과 카세트에서 작은 페트리 접시 또는 6 웰 플레이트를 개최합니다. 100 ㎖ / 시간의 유량을 설정하고 펌프를 시작한다.
  8. 필터를 통해 모든 미디어에 전달하고 플로우를 통해 배양 접시를 수집합니다. 모든 미디어가 통과하는 기다린 후 펌프를 중지하고 주사기 a를 제거펌프에서 차 여과 카세트.
  9. 주사기에서 여과 카세트를 분리하고 카세트에서 필터를 검색 할 수 엽니 다. PIPAAm 표면이 구멍에서 세포를 해제 할 때 역류를 수집하는 데 사용되는 동일한 배양 접시에 아래를 향 필터를 놓습니다. 따뜻한 매체의 나머지 부분을 추가하고 37 ° C로 설정 문화 인큐베이터로 배양 접시를 놓습니다.
  10. 30 분 후 모든 셀 필터에서 발표 될 예정이다. 그러나, 모든 세포는 분리하기 위해 최대 24 시간 동안 배양 접시에 필터를 둡니다.
    참고 : 또는 방출 된 세포가 microcentrifuge 관에 수집되는 몇 가지 예를 이름을 같은 PCR, ELISA, 웨스턴 블롯으로 더 하류 분석을 수행 할 수 있습니다.
  11. 문화 24 시간 후, 신중하게 집게를 사용하여 마이크로를 제거합니다.
    참고 : 필터는이 시점에서 폐기 될 수 세포가 그것에서 출시 된있다.
  12. 부드럽게과 1000 & #을 사용하여 아래로 배지를 피펫(181), 리터 피펫, 적혈구와 다시 중단에 말초 혈액 단핵 세포 필터에 포착하고 CTC와 함께 접시에 출시 (PBMC). 느슨하게 연결된 암 세포를 분리하지 않도록 신중하고 조심스럽게이 작업을 수행합니다. 조심스럽게 새로운 배지 예열을 37 ° C로 부착 된 암 세포와 대체 남기고 중에 재현 탁 적혈구와 PBMC를 포함하는 모든 매체를 제거한다.
    참고 : 과도한 적혈구 하나의 세척 후 존재하는 경우이 단계를 한 번 반복 할 수 있습니다.

4. CTC 생존 능력 평가

  1. 라이브 / 죽은 분석 (8)을 사용하여 배양 CTC의 생존 능력을 평가합니다.
    참고 : 다수의 라이브 / 죽은 분석은 시판되고있다. 제조 업체의 프로토콜에 따라하는 것이 매우 좋습니다. 이 실험에 사용 된 상업 분석 키트에 대한 자료 / 시약 목록을 참조하십시오.

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Representative Results

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건강한 기증자의 혈액을 사용하여 (정보통 동의 다음 마이애미 IRB 20,150,020 대학에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 획득) 배양 된 암세포, 가능한 순환 종양 세포 (CTC), 달성 캡처, 릴리스 및 검색 효율의 릴리스에 대한 thermoresponsive 기술로 아군 94 % ± 9 %, 82 % ± 5 % 및 77 % ± 5 %의 각각 (표 1) 15. 이에 비해, 필터 코팅의 박리 및 회수 효율이 상당히 낮은 (7 % ± 1 %의 분리 효율은 6 % ± 1 %의 검색 효율) (표 1) 15이었다. 필터로부터 방출 CTCS의 실행 가능성을 평가하기 위해서, ~ 1000 SK-브롬-3 세포는 PIPAAm 코팅 슬롯 필터를 통해 여과하고, 전술 한 방법을 이용하여 풀어 건강한 공여자의 혈액 7.5 ㎖ 중에 급증 하였다. 라이브 / 죽은 분석은 혈액에 스파이크 전에 세포 생존 능력을 평가하기 위해 수행되었다그리고 출시 된 이후. 사전 스파이크 가능성은 98 % (592 (602) 계산 세포 밖으로)와 촬영과 혈액에서 분리 세포의 생존 능력 95 % (계산 540 567 아웃 셀) (15) (그림 3A)이었다. 병행하여, 세포를 포착 맥코이의 5A 배지에서 배양 한 혈액 샘플로부터 후 여과를 발표했다. 그림 (b)에 나타낸 바와 같이 이미지가 주 3 일 10에서 찍은, 필터에서 방출 셀은 가능한 유지 아니지만, 따라서 그들의 생존 게시물 여과을 수립, 문화에 빠른 속도로 확대했다.

그림 1
그림 1 :. PIPAAm 캡처 슬롯 필터 코팅 및 릴리스는 혈액에서 종양 세포를 순환 (상위 패널) (A) PIPAAm 코팅 슬롯 필터의 시야 이미지; CTC 캡처를위한 전체 혈액의 (B) 여과. t의 (C) 도식그는, PIPAAm 코팅 슬롯 필터 상단 및 하단 카세트 끼워 카세트 마이크로. 프로세스의 (하단 패널) (D) 도식은 PIPAAm 코팅 슬롯 필터에서 CTC를 캡처 놓습니다. 참조 (15)로부터 허가를 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 :. 캡처, 실행 가능한 종양 세포의 출시와 문화 유방암 세포 (SKBR-3) 캡처 된 정상 기증자의 혈액에서 아군과 PIPAAm 코팅 된 마이크로를 사용하여 발표했다. 세포는 가능한 포스트 릴리스를 유지하고 신속하게 문화를 확대했다. (A) 라이브 죽은 분석은 필터에서 방출 된 세포에서 수행. 세포를 95 % (계산 567 셀 540 아웃)이 가능한 것으로 나타났다릴리스 다음 (녹색). 죽은 세포는 빨간색으로 표시되어 있습니다. (B) PIPAAm 코팅 슬롯 필터에서 방출 된 세포의 날 (10) 문화를 통해 3 일. 세포 생존과 문화에 확장 남아 있었다. 스케일 바 = 100 기준 15의 허가를 μm.Reproduced. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 기공 매개 변수 전후 PIPAAm 코팅의 측정 슬롯 필터 (A) 사전 및 (B) 포스트 PIPAAm 코팅의 브라이트 이미지.. PIPAAm 코팅 공극 폭 PIPAAm 도포 후 5.6 %, ± 15.3 %로 감소 된 후 (C) 기공의 길이는 2.1 % ± 7.3 %로 감소 하였다. 참조 (15)로부터 허가를 재현.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 적혈구와 백혈구의 오염은 부드러운 세척하여 제거하는 약 1,000 SKBR-3 세포 PIPAAm 코팅 슬롯 필터에 의해 혈액에서 검색하고, 48 웰 플레이트에 도금했다.. (A) 16 시간 배양시 세포 자멸 적혈구 및 백혈구 반면 배양 플레이트 (초록색 화살표)에 부착 SKBR-3 종양 세포는 또한 플레이트 (적색 화살표)의 바닥에 침강 하였다. (B) 후 세척, 비 - 부착 세포는 플레이트 (초록색 화살표)에 부착 된 종양 세포를 남기고 제거 하였다. 참조 (15)로부터 허가를 재현. 하십시오이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 번 테이블
표 1 :. 캡처, 릴리스 및 PIPAAm 코팅 슬롯 필터의 검색 효율 효율을 캡처 = 릴리스 / 세포 수 전에 필터에 포착 세포 수는 혈액으로 아군. 릴리스하기 전에 필터에 포착 된 필터 / 세포 수에서 방출 효율 = 세포 수를 놓습니다. 검색 효율 = 필터 / 세포 수에서 방출 셀 번호는 참조 (15)의 허가 blood.Reproduced로 아군.

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Discussion

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전혈에서 가능한 CTC 캡처 및 마이크로 그들을 해제 과정은 비교적 간단하다; 그러나 몇 가지 중요한 점은 언급 할 가치가있다. 이 멸균 상태가 전체 프로세스를 통해 유지되는 모든 세포 배양과 마찬가지로 필수적이다. 필터로부터 세포를 해제하는 방법의 기초가 PIPAAm의 온도 감응 계면 성질을 이용을 기반으로 PIPAAm으로 필터를 코팅의 초기 단계는 매우 중요하다. 필터는 효과적으로 피복되어 있도록 코팅 전에 현미경 필터상의 구멍 (슬롯 구멍의 폭과 길이)의 크기를 측정 후, 다시 공경 포스트 코팅을 측정합니다. 기공 크기는 폭과 길이 (도 4)에 모두 1 ㎛로 감소되어야한다. 언급 한 바와 같이, 효율적으로 캡처하면서 CTC 슬롯 필터도 있지만 이들 세포 비 접착 세포 따라서 두리 있으며, 일부 큰 PBMC 세포를 포착NG 단계 3.13는 부착 암 세포의 뒤에 떠나는 문화 (그림 5)에서 제거됩니다.

점도가 매우 높은 경우에는 혈액의 다른 볼륨 또는 경우에 필터링 될 경우 프로토콜에 약간의 수정을 필요로 할 수있다. HBSS로 1 : 프로토콜에서 설명한 바와 같이, 혈액 희석 한 중요하다. 혈액의 점도는 그러나 대부분이 여과에 영향을 미치지 않습니다, 환자에게 환자에 따라 다릅니다. 점도가 매우 높거나 큰 혈전이 경우, 시린지 펌프는 필터를 통해 피로를 강제 할 수없고 존재하는 경우 특정한 경우가있을 것이다. 또, 주사기 펌프를 정지 주사기로부터 카세트를 분리 카세트의 상부를 열고, 여전히 바닥 부에 부착 된 필터를두고 이러한 경우에 의뢰한다. 대형 혈전은 필터에 쉽게 볼 수 있습니다. 약간의 중앙에 카세트를 잡고 조심스럽게 필터에 HBSS 1 ㎖를 피펫제작은 응고가 씻어 수 있습니다. 혈전이 제거되면, 카세트를 닫습니다 주사기로 재 ​​- 참여 및 여과를 계속합니다.

PIPAAm 코팅 필터가 일괄 적으로 만들어지고 나중에 사용하기 위해 저장 될 수 있지만, 우리는 이러한 프레 코트 필터의 수명은 약 3 개월 것을 발견 하였다. 효과적인 캡처 및 세포의 방출로 인해 시간이 지남에 따라 분해 PIPAAm의 부분적으로 감소 될 수있다.

제한 요인 중 하나는 혈액 샘플 내에 존재 CTC의 수가 존재할 것이다 CTC 환자로부터 배양을 설정한다. 낮은 숫자는 가능성이 불가능하지는 않지만 매우 어려운 세포를 확장 할 수있는 기능을 만들 것입니다. 그러나, 작은 배양 영역으로 저 세포 수로 샘플을 침적하는 것은 예 96 웰 플레이트 대신 6- 웰 플레이트 중 하나의 웰과, 도움이 될 수있다. 배양 배지, 또는 상업적으로 이용 가능한 매체의 변형의 ID, 즉 fo를 최적의 환경을 제공하는 것이다성장이 세포 r에하는 것은 극복되어야 할 것이다 또 다른 도전이다.

CTC의 분자 및 세포 분석은 암의 예후에 대한 유용한 정보를 제공하고 드라이브 정밀 의학 (15) 도움이 될 수 있습니다. 포획 필터로부터 방출 된 세포의 생존 능력은 약물 감도 및 스크리닝 시험 배양 환자 CTC하는 능력을 향해 키 개발이다. 긴 CTC 따라서 적절 모두 처리 할 필요성을 일차 종양 다르며 경향이 알려져있다. 일례로서이 Schneeweiss 외. 전이성 유방암 (MBC)에서, 전이성 조직 및 기본 종양의 항원 프로필 환자의 20 %까지의 차이가 보도했다. 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 식을 포함한 예측 마커의 재평가 MBC 처리를 최적화 할 수 있습니다. 조직 샘플은 침습적 자주 반복 어렵지만, CTC 분석는 혈액 샘플을 필요로하기 쉬운 반복 실시간 및 #를 제공 할 수도34 액체 생검 "접근 22.

이 기술의 주요 의미는 여러 가지 플랫폼이 일반적 CTC 캡처 사용하면서 정착 샘플을 처리하는 데 필요하므로 분석은 분자 세포 분석으로 한정하거나, CTC 플랫폼에 고정된다는 사실에있다. 또한, 실행 가능한 CTC 포획 및 해제를 허용 선호도 기반 시스템은 잠재적 표적 항원 (15)의 선택에 의해 바이어스 될 수있다. 대안 적으로, PIPAAm 코팅 슬롯 필터는 전혈에서 포집 가능한 CTC 방출의 효과적이고 효율적인 라벨없는 플랫폼을 제공한다. 이 방법은 단일 세포 표현형 및 게놈 분석뿐만 아니라 생체 외에서 배양 CTC CTC 포함한 가능한 더 특성화하기위한 기능을 제공한다.

작업 임상 응용 프로그램에이 기술을 사용하는 것이 현재 진행 중입니다. 능력 patien에서 효과적으로 문화 CTC에t의 샘플은 기초를 환자 신약 목표를 공개하고, 효과적인 화학 요법의 발전으로 이어질 환자에서 효과적인 치료 연대의 수립으로 이어질 것입니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slot Filter Circulogix Inc. MSF-01 Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)  Ploysciences Inc. 21458 Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol Sigma Aldrich B7906 Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides Cole-Parmer 48510-30 Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater Specialty Coating Systems SCS G3 Spin Coater Instrument
Polyimide Tape Uline S-7595 Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
1x PBS Gibco 10010-023
Falcon Petri dishes 35 x 10 mm VWR 25373-041
Microfilter Cassette Circulogix Inc. FC-01 Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine 
Syringe 20 ml BD Scientific 302830
Syringe Pump KD scientific  78-0100V Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used
Cellstar 50 ml Centrifuge tube VWR 82050-322
Greiner Bio One 6 well plate VWR 89131-688 Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells ATCC HTB-30
Live Dead Assay Life Technologies L3224 Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator VWR 98000-368 Any incubator that can be used for cell culture will suffice

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References

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캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스
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Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).More

Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).

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