Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Capture and Release av Levedyktige Sirkulasjonstumorceller fra Blood

doi: 10.3791/54435 Published: October 28, 2016

Summary

En protokoll for å utnytte en poly (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) belagt mikrofilter for effektiv fangst og thermoresponsive utgivelsen av levedyktige sirkulerende tumorceller (CTC) er presentert. Denne metoden gjør fangst av CTC fra pasientenes blod og påfølgende frigjøring av levedyktig CTC for nedstrøms off-chip kultur, analyser og karakterisering.

Abstract

Vi viser en metode for størrelse basert fangst av levedyktige sirkulerende tumorceller (CTC) fra helt blod, sammen med utgivelsen av disse cellene fra brikken for genetisk analyse og / eller kultur. Strategien sysselsetter bruk av en roman Parylene C membran slot pore mikrofilter for å fange CTC og et belegg av poly (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) for thermoresponsive levedyktig utgivelsen av den fangede CTC. Fangst av levende celler er aktivert ved å utnytte konstruksjonen av en spalte poregeometri med bestemte dimensjoner for å redusere skjærspenning typisk assosiert med filtreringsprosessen. Mens mikrofilter viser en høy fangsteffektivitet, er utgivelsen av disse cellene ikke-triviell. Vanligvis er bare en liten prosentandel av celler som frigjøres når teknikker slik som omvendt strøm eller celle skraping blir brukt. Den sterke adhesjon av disse epiteliale kreftceller til Parylene C membranen er knyttet til ikke-spesifikk elektrostatisk interaksjon. For å motvirke ther effekt, benyttet vi bruk av PIPAAm belegg og utnyttet sine termiske responsgrenseflateegenskaper for å frigjøre cellene fra filteret. Blod blir først filtrert ved romtemperatur. Under 32 ° C, er PIPAAm hydrofil. Deretter blir filteret plasseres enten i dyrkningsmedier eller en buffer holdt ved 37 ° C, noe som resulterer i PIPAAm snu hydrofobe, og deretter frigjøring av elektrostatisk bundne celler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Metastatisk sykdom er ansvarlig for de fleste kreftdødsfall. Utvikling prognostisk og følges diagnostisk biomarkør for metastasering er viktig i kreft ledelse og behandling. Sirkulerende tumorceller (CTC) spiller en sentral rolle i tumorspredning og metastasering. Videre er lett tilgjengelig som en "flytende biopsi 'biomarkør, CTC i kreftpasienters har perifert blod vært økende som en" arnested "for kreft biomarkør forskning. CTC har blitt godt validert som en prognostisk biomarkør i ulike kreft innstillinger, inkludert bryst, prostata og tykktarmskreft 1-3. Imidlertid har nylige fremskritt i CTC felt indikerte at bare bestemmelse av disse sjeldne cellene har begrenset klinisk nytte, slik som vist i intervensjons kliniske forsøk 4. Dermed er det et voksende behov for teknologi som gjør det mulig for molekylær og funksjonell karakterisering av CTC. Foreløpig bare få teknologier eksisterer som tillater for ikke-antigen partisk, levedyktig fangst og frigjøring av CTC, slik robust nedstrøms molekylær og funksjonell analyse 5,6. Flertallet av disse microfabricated enhetene er koblet til microfluidic plattformer og dermed ha en begrensende faktor i mengden blod som som kan behandles, som spenner 2-4 ml 7-10. CTC er sjeldne hendelser i et enkelt rør for blodprøvetaking (7,5 ml), og derfor ytterligere å redusere mengden av blod som kan behandles, i stor grad hindrer muligheten til å fange og å isolere disse cellene av interesse.

Vi har utviklet to typer Parylene C membran mikrofilter enheter for fangst av CTC som utnytter størrelsesforskjeller mellom større tumorceller og de mindre normale blodceller 11,12. Vi har tidligere rapportert på den runde pore opplistingen filter og sammenlignet den med et FDA-godkjent plattform, hvor mikro ble vist å være overlegen i CTC fangsteffektivitetfor kreftpasient blodprøver 13,14. Imidlertid er en begrensning av runden filteret er nødvendigheten av å bruke en formaldehydbaserte fikseringsmiddel før filtrering. Denne prosessen bevarer cellene morfologi samtidig som de kan motstå den skjærspenning og trykk under filtreringsprosessen. Mens opplisting og molekylære studier kan utføres på brikken 13, svekker fiksativ evnen til å utføre funksjonell karakterisering. For å møte denne begrensningen, har vi utviklet et spor pore filter som fornekter nødvendigheten av å fikse cellene før filtrering (figur 1). Spalten poregeometri (6 um bredde x 40 um lengde spille porer) gjør det mulig for tumorceller til å bli fanget mens bare delvis okkludering av en pore, og således fremdeles tillater fri passasje for andre blodceller og lindre økningen i trykk som ville føre til celleskade og eventuell sprengning 15,16 sporet pore patronen består av 2 akryl stykker som smørbrødslissen pore-filter mellom den øverste og nederste stykke med polydimetylsiloksan (PDMS) som virker som en pakning for å tilveiebringe en lekkasjesikker tetning 14,15 (figur 1).

Mens fange effektiviteten av sporet pore-filter er høy, (tabell 1), det oppfangede CTC bundet til Parylene C membranen av sterke ikke-spesifikke elektrostatiske interaksjoner i stedet for ekstracellulær matriks (ECM) mediert adhesjon 15. Metoder som omvendt strøm eller bruk av celle skrapere mislykkes i å effektivt frigjøre cellene fra filteret, eller resultere i celleskade og celledød. Vi utforsket en ukonvensjonell bruk av PIPAAm å formulere en utgivelse strategi 15. PIPAAm er en polymer som gjennomgår en reversibel lavere kritisk oppløsningstemperatur (LCST) faseomvandling ved en løsningstemperatur på 32 ° C 17. Tradisjonelt har denne egenskapen PIPAAm blitt mye utforsket for tissue engineering applikasjoner. Typisk celler erdyrket på PIPAAm belagte overflater ved 37 ° C når PIPAAm er hydrofobe. Cellene kan deretter tas av som en plate når dyrkningstemperaturen er forskjøvet til under 32 ° C, hvor den PIPAAm belagte overflaten blir hydrert 17,18. Vi å utnytte dette termiske egenskapen ved å utføre filtreringen ved romtemperatur (under 32 ° C), og deretter muliggjøre celle frigivelse ved å plassere filteret i kulturmedier holdt ved 37 ° C. Ved denne temperatur blir det PIPAAm hydrofob polymerlaget, for derved å frigjøre det elektrostatisk bundne celler 15 (figur 1).

Selv om temperaturen responsive metode samt andre metoder har blitt iverksatt for å oppnå levedyktig CTC-fangst og slipp 19-21, en nøkkel potensielle ulempen deles av disse teknologiene er rapportert, er at de alle ansette en antigen-avhengig prinsipp for CTC-fangst. Antigen basert CTC-fangst, som vist previously, kan føre til partisk CTC analyse 11,14. For eksempel, mange affinitet-baserte teknologier ansette antistoff som binder EpCAM for CTC-fangst. Imidlertid CTC er blitt vist å uttrykke forskjellige nivåer av EpCAM, som fører til utelatelse av EpCAM lav og EpCAM negativ CTC av disse teknologiene. Dessuten kan det oppstå begrensninger når CTC fra ikke-epitelial opprinnelse er av interesse, slik som CTC i melanom og sarkom innstillinger. Dermed vil en teknologi som gjør det mulig for levedyktig CTC-fangst og slipp uten potensiell skjevhet introdusert av antigen basert fangst er svært ønskelig.

Viktigere er mikro fangst enheten rent størrelse basert og utgivelsen strategi er agnostiker til tilstedeværelsen av visse overflatemarkører. Vi mener at ansettelse av PIPAAm belagt mikrofilter vil bidra til å utvide vår forståelse av metastatisk prosess, gjennom å gi muligheten til å effektivt fange og slipp CTC for nedstrøms analyser. Dette kan potentially avsløre nye molekyler som nye målrettet systemisk behandling kan være rettet, samt gi en biomarkør som kan overvåkes enkelt og hjelpemiddel i kreftpasient ledelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etikk Uttalelse: For å beskytte rettighetene til mennesker, ble blodprøver innhentet etter et informert samtykke i henhold til protokoller godkjent av University of Miami institusjonell gjennomgang styrene etter IRB 20150020.
MERK: Blood som skal filtreres for CTC-fangst skal samles i en EDTA rør for å hindre koagulasjon.

1. Coating Pollen med Poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)

  1. Vei opp PIPAAm for å fremstille en 10% vekt / volum løsning i butanol. Bland ved hjelp av en vortex inntil løsningen er klar.
  2. Cut plast objektglass til omtrent 12 mm x 12 mm ruter enten med en saks eller skarp kniv. Alternativt kan du bruke en giljotin.
    MERK: Disse rutene vil tjene som en holder for filtrene under spin coating prosess.
  3. Ved hjelp av en skarp to straight edge saks, klippe sporet pore mikro wafer til 8 mm x 8 mm firkanter.
  4. Ved hjelp av en polyimide film tape sikre kuttfilter på plast firres tidligere kutt i trinn 1.3. Anvende filmen bare til kant og hjørnet av filteret slik at minst 7 mm x 7 mm fra filterareal er un-dekkes av båndet.

Figur 2
Figur 2:. Representant Illustrasjon av Pollen Set-up for PIPAAm Coating 8 mm x 8 mm mikrofilter er plassert på 12 mm x 12 mm plast firkantet kutt fra en plast objektglass. Polyimide tape brukes til å feste mikrofilter i stedet for å spinne belegge PIPAAm.Reproduced med tillatelse fra referanse 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Plasser mikrofilter som er sikret på plast torget, på vakuum chuck av spin-coater.
  2. Programmere spin-belegger til følgende oppskrift: Start, 500 rpm i 10 sek, 6000 rpm for 60 sek, 500 rpm i 10 sek, Stop.
  3. Dispensere nok 10% vekt / volum PIPAAm oppløsning (fremstilt i 1,1) for fullstendig å dekke mikro overflaten ved hjelp av en standard plast overføring pipette og starte spinnbeleggeren.
  4. Fjern det PIPAAm belagte mikro fra spin-beleggeren etter at belegningsprosessen er ferdig. La filter som er festet til plast firkantet under lagring.
    NB: Det belagte-filter kan bli lagret ved romtemperatur i opptil 3 måneder.

2. Montering av Filtrering kassett med PIPAAm Coated Pollen

  1. Rehydrere PIPAAm belagt mikrofilter ved romtemperatur ved å plassere mikro fortsatt festet på plast torget i en petriskål. Legg 1x PBS til mikrofilteret er helt nedsenket og la stå i 5 min.
  2. Etter hydrering trinnet, slipper filteret ut av plast plassen ved å kutte polyimide film båndet med et par saks.
    MERK: Legg merke til hvilken side av filteretden PIPAAm belegg.
  3. Montere mikrofilter inn i filtreringskassetten, ved sandwiching mikro mellom toppen og bunnen akryl stykke sammen med to polydimetylsiloksan (PDMS) biter som virker som en pakning / tetning. Klem akryl kassett med klips for å feste filteret og gir en tett forsegling.
    MERK: PIPAAm belegget bør være vendt oppover, slik at prøven filtreres gjennom, vil cellene bli fanget på PIPAAm belagte overflaten av filteret (figur 1).

3. Filtrering av Blood Sample med Capture and Release av CTC fra Pollen

  1. Som hver sprøyte pumpe merke har sin egen brukergrensesnittet, se bruksanvisningen til pumpen og programmere sprøytepumpen til å flyte med en hastighet på 75 ml / t og angi volumet til 20 ml.
  2. Varme 3 ml McCoys (kommersielt tilgjengelig) cellekulturmedium (fremstilt ved tilsetning av 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin og streptomycin) til 37 ° C.
  3. Legg 7,5 ml kommersielt tilgjengelig Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) til 7,5 ml av blodprøven og suge dette fortynnet blod inn i en 25 ml sprøyte.
    MERK: Juster volumet av HBSS slik at blodprøven er fortynnet med like stort volum av 1: 1 med HBSS For eksempel dersom 10 ml blod blir brukt, og bland med like stort volum av 10 ml HBSS for å oppnå en.: 1 fortynning.
  4. Engasjere filtrering kassett med sprøyten og plasser det i sprøytepumpe. Plassere et 50 ml rør ved bunnen for å samle strømningen gjennom og starte pumpen.
    MERK: filtrering bør ta omtrent 10- 12 min. Alle filtreringstrinn blir gjennomførtved normal romtemperatur (20-25 ° C) inkludert trinn 3.8
  5. Etter filtrering er fullført, løsne filtrering kassett ta note hvilken side som er toppen som har cellene fanget på PIPAAm belagt overflate. Sug 1 ml av den varme kulturen media inn i en ny sprøyte.
  6. Re-engasjere filtreringskassetten med sprøyte inneholdende mediet, men på dette tidspunkt i inngrep med nedre ende av kassetten, slik at den belagte PIPAAm-overflate av filteret som vender bort fra sprøyten.
    MERK: Dette vil være å slippe noen celler som kan være innebygd i spille porene ved å bruke milde tilbakestrømning.
  7. Plasser sprøyten tilbake på sprøytepumpen og holde en liten petriskål eller seks-brønns plate rett under filtrering kassett. Angi strømningshastigheten til 100 ml / time og starte pumpen.
  8. Passere alle media gjennom filteret og samle gjennomstrømnings i petriskål. Vent til alle media for å passere gjennom, og deretter stoppe pumpen og fjern sprøyten ennd filtrering kassett fra pumpen.
  9. Løsne filtrering kassett fra sprøyten og åpne den for å hente filteret fra kassetten. Plasser filteret med PIPAAm overflate som vender ned i det samme petriskål som brukes til å samle returstrømmen når frigjøre cellene fra porene. Tilsett resten av den varme media og plasser petriskål inn i en kultur inkubator innstilt på 37 ° C.
  10. Etter 30 min alle cellene vil bli utgitt fra filteret. Imidlertid lar filter i petriskålen i opptil 24 timer for å sikre at alle cellene løsner.
    MERK: Alternativt kan de frigjorte celler samles i et mikrosentrifugerør for å utføre ytterligere nedstrøms analyse, slik som PCR, ELISA, Western Blot for å nevne noen eksempler.
  11. Etter 24 timer i kultur, forsiktig fjerne mikro bruker tang.
    MERK: Filteret kan kastes på dette tidspunktet som cellene har blitt løslatt fra den.
  12. Forsiktig pipette kulturmediet opp og ned ved hjelp av en 1000 & #181; l pipette, for å re-suspendere erytrocytter og perifert blod mononukleære celle (PBMC) som er fanget på filteret og sluppet inn platen med CTC. Utfør denne handlingen nøye og forsiktig for å unngå å demontere løst festet kreftceller. Fjern forsiktig hele medium inneholdende de re-suspenderes erytrocytter og PBMC mens etterlater de vedlagte-kreftceller og erstatning med friskt medium forvarmet til 37 ° C.
    MERK: Dette trinnet kan bli gjentatt en gang hvis overdreven erytrocytter er tilstede etter en vask.

4. CTC Livskraftig Evaluering

  1. Vurdere kultivert CTC levedyktighet ved hjelp av en Live / Død Assay 8.
    MERK: Mange Levende / Døde analyser er kommersielt tilgjengelig. Etter produsentens protokoll er sterkt anbefalt. Vennligst referer til listen materialer / reagenser for kommersiell analyse kit brukes for dette eksperimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ved hjelp av friske givere 'blod (oppnådd under en protokoll godkjent av University of Miami IRB 20150020 etter et informert samtykke) tilsatt kultiverte kreftceller, den thermoresponsive teknikk for frigjøring av levedyktige sirkulerende tumorceller (CTC), oppnådde fangst, utslipp og gjenfinning effektivitet på 94% ± 9%, 82% ± 5% og 77% henholdsvis ± 5% (tabell 1) 15. Til sammenligning, utsetting og innhenting effektivitet av ubelagte filter var signifikant lavere (7% ± 1% frigjøring virkningsgrad og 6% ± 1% gjenfinning effektivitet) (Tabell 1) 15. For å vurdere levedyktigheten til CTCs frigjøres fra filteret, ~ 1000 SK-BR-3-celler ble tilsatt i 7,5 ml av frisk donor blod, filtrert gjennom PIPAAm belagte sporet filter og frigjøres ved hjelp av metoden som er beskrevet ovenfor. A Live / Død analysen ble utført for å evaluere celleviabilitet før pigg i blodetog etter løslatelsen. Den pre-spike levedyktighet var 98% (592 av 602 celler telles) og levedyktighet av celler fanget og sluppet fra blodet var 95% (540 ut 567 celler telles) 15 (figur 3A). Parallelt cellene fanget og frigjort etter filtrering fra blodprøven ble dyrket i McCoys 5A dyrkingsmedium. Bilder ble tatt på dag 3 og dag 10. Som vist i figur 3B, celler frigjort fra filteret ikke bare forble levedyktige, men ekspanderte raskt i kultur, og dermed etablere deres levedyktighet stolpe filtrering.

Figur 1
Figur 1:. PIPAAm Coated Slot Filter til Capture and Release Sirkulasjonstumorceller fra Blood (Top panel) (A) Lysfelt bilde av PIPAAm belagt sporet filter; (B) Filtrering av fullblod for CTC-fangst. (C) Skjematisk fremstilling av tHan mikrofilter kassett der, PIPAAm belagt slot filter er klemt mellom topp og bunn kassett. (Nedre panel) (D) Skjematisk av prosessen for å frigjøre fanget CTC fra PIPAAm belagt spille filtre. Gjengitt med tillatelse fra referanse 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Capture, Release og kultur Levedyktige tumorceller brystkreftceller (SKBr-3) tilsatt i normal donor blod ble tatt og gitt ut ved hjelp av en PIPAAm belagt mikrofilter. Cellene forble levedyktig post utgivelse og utvidet i kultur raskt. (A) Direkte-dead-analyse utført på cellene frigjøres fra filteret. 95% (540 av 567 celler telles) av cellene viste seg å være realistiske(Grønn) etter utgivelsen. Døde celler er merket med rødt. (B) Dag 3 til dag 10 kulturen av cellene frigjøres fra PIPAAm belagt sporet filter. Cellene forble levedyktig og ekspandert i kultur. Scale bar = 100 μm.Reproduced med tillatelse fra referanse 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Måling av Pore Parametere Pre- og Post- PIPAAm Coating Lysfelt bilder av sporet filter (A) før og (B) post- PIPAAm belegg.. (C) Pore lengde ble redusert med 7,3% ± 2,1% etter PIPAAm belegg og pore bredde ble redusert med 15,3% ± 5,6% etter PIPAAm belegg. Gjengitt med tillatelse fra referanse 15.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: forurensende erytrocytter og leukocytter er fjernet ved forsiktig Vasker Cirka 1000 SKBr-3 celler ble hentet fra blodet ved PIPAAm belagt sporet filter og ble belagt på en 48-brønns plate.. (A) på 16 timer i kultur, ble SKBr-tre kreftceller følges kultur plate (grønne piler), mens apoptotiske erytrocytter og leukocytter også settling på bunnen av platen (røde piler). (B) Ettervask, ikke-adherente celler ble fjernet, og etterlater adherente tumorceller på plate (grønne piler). Gjengitt med tillatelse fra referanse 15. VennligstKlikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1:. Capture, Release og henting Effektivitet av PIPAAm Coated Slot Filters Capture effektivitet = celle tall fanget på filteret før release / celle tall tilsatt i blodet. Slipp effektivitet = celle tall løslatt fra filter / celle tall fanget på filteret før utgivelsen. Retrieval effektivitet = celle tall løslatt fra filter / celle tall tilsatt i blood.Reproduced med tillatelse fra referanse 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Prosessen med å fange levedyktig CTC fra fullblod og slippe dem ut av mikrofilteret er relativt enkel; imidlertid noen kritiske punkter er verdt å nevne. Det er viktig, som med alle cellekultur som en steril tilstand opprettholdes gjennom hele prosessen. Det første trinnet av å belegge filteret med PIPAAm er kritisk, som grunnlag for teknikken for å frigjøre cellene fra filteret er basert på å utnytte PIPAAm største temperaturfølsomme grenseflateegenskaper. For å sikre at filteret er blitt belagt effektivt, måle størrelsen på en pore (bredde og lengde av en spalte pore) på filteret under et mikroskop før maling, og deretter på nytt måle en porestørrelse post belegg. Porestørrelsen bør være redusert med 1 pm på både bredden og lengden (figur 4). Som nevnt i sporet filteret, mens fange CTC effektivt fanger også noen store PMBC-celler, men disse cellene er ikke-adhererende celler og således during trinnet 3.13 blir fjernet fra kulturen etterlater de adherente kreftceller (figur 5).

Mindre modifikasjoner av protokollen kan være nødvendig dersom forskjellige volumer av blod som skal filtreres, eller i tilfeller når viskositeten er ekstremt høy. Som nevnt i protokollen, er det viktig å fortynne blodet 1: 1 med HBSS. Viskositeten av blod varierer fra pasient til pasient, men for det meste vil dette ikke påvirke filtreringen. Det vil være visse tilfeller når viskositeten er meget høy eller store klumper er til stede, i hvilket tilfelle sprøytepumpen ikke vil være i stand til å presse blodet gjennom filteret. Det anbefales i slike tilfeller å stoppe sprøytepumpe, løsne kassetten fra sprøyten, åpne den øverste delen av kassett, men la filteret fortsatt festet til den nederste delen. Store blodpropp vil være lett synlig på filteret. Forsiktig pipette 1 ml HBSS på filteret mens du holder kassetten på en liten angle slik at blodpropp å vaske av. Når blodpropp er fjernet, lukke kassett, re-engasjere den til sprøyten og fortsette filtrering.

Mens PIPAAm belagte filtre kan fremstilles i porsjoner og lagres for senere bruk, er det funnet at holdbarheten av disse forhåndsbelagt filter er ca 3 måneder. Den effektive fangst og frigjøring av cellene kan reduseres delvis på grunn av PIPAAm nedverdigende over tid.

En av de begrensende faktorer for å etablere en kultur fra pasient CTC vil ligge i antall CTC som er tilstede i blodprøven. Lave tall vil sannsynligvis gjøre muligheten til å utvide cellene ekstremt vanskelig, om ikke umulig. Imidlertid avsette en prøve med lav celletellinger i mindre dyrkningsområder kan hjelpe, så som i en enkelt brønn i 96 brønners plate i stedet for en 6-brønn plate. Identifiseringen av kultur media, eller endring av kommersielt tilgjengelige medier, vil det gi den optimale miljø for disse cellene til å vokse er en annen utfordring som må overvinnes.

Molekylære og cellulære analyser av CTC gi verdifull informasjon for kreft prognose og kan bidra til å drive presisjon medisin 15. Den levedyktighet av cellene frigjøres fra fangst filter er en viktig utvikling mot evnen til kultur pasient CTC for narkotika følsomhet og screening tester. Det har vært lenge kjent at CTC har en tendens til å avvike fra den primære tumor og således nødvendigheten av å behandle både deretter. Som et eksempel, Schneeweiss et al. rapporterte at i metastatisk brystkreft (MBC), antigen profiler av metastatisk vev og primær tumor skiller seg i opp til 20% av pasientene. Revurdering av prediktive markører, inkludert human epidermal vekstfaktor reseptor 2 (HER2) uttrykk, kan bidra til å optimalisere MBC behandling. Mens vevsprøver er invasiv og ofte vanskelig å gjenta, CTC analyse krever bare en blodprøve og kan gi en lett-å-repeat, real-time & #34, flytende biopsi "tilnærming 22.

En stor betydning av teknikken ligger i det faktum at mens flere plattformer som vanligvis anvendes i CTC fangst og analyser er begrenset i molekylære og cellulære analyser som et fikseringsmiddel er nødvendig for å behandle prøven, eller den CTC er immobilisert på plattformen. Videre kan affinitet-baserte systemer, som gir mulighet for levedyktig CTC fangst og slipp, potensielt være partisk ved valg av målantigenet 15. Alternativt sporet filter med PIPAAm belegg gir en etikett gratis plattform som er effektiv i fangst og frigjøring av levedyktig CTC fra fullblod. Denne metoden gir mulighet for ytterligere karakterisering av levedyktig CTC, inkludert enkelt celle fenotypiske og genomisk analyse samt ex vivo CTC kultur.

Arbeidet er nå i gang for å bruke denne teknologien for kliniske applikasjoner. Evnen til å effektivt kultur CTC fra patienT prøvene vil føre til utformingen av effektive terapi regimenter på en pasient til pasient basis, avslører nye narkotika mål, og føre til utvikling av effektive kjemoterapeutika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slot Filter Circulogix Inc. MSF-01 Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)  Ploysciences Inc. 21458 Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol Sigma Aldrich B7906 Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides Cole-Parmer 48510-30 Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater Specialty Coating Systems SCS G3 Spin Coater Instrument
Polyimide Tape Uline S-7595 Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
1x PBS Gibco 10010-023
Falcon Petri dishes 35 x 10 mm VWR 25373-041
Microfilter Cassette Circulogix Inc. FC-01 Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine 
Syringe 20 ml BD Scientific 302830
Syringe Pump KD scientific  78-0100V Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used
Cellstar 50 ml Centrifuge tube VWR 82050-322
Greiner Bio One 6 well plate VWR 89131-688 Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells ATCC HTB-30
Live Dead Assay Life Technologies L3224 Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator VWR 98000-368 Any incubator that can be used for cell culture will suffice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351, (8), 781-791 (2004).
  2. de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, (19), 6302-6309 (2008).
  3. Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20, (7), 1223-1229 (2009).
  4. Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500. J. Clin. Oncol. 32, (31), 3483-3490 (2014).
  5. Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip. Lab chip. 11, (17), 2827-2834 (2011).
  6. Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci. Transl. Med. 5, (179), 179 (2013).
  7. Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450, (7173), 1235-1239 (2007).
  8. Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System. PLoS ONE. 8, (6), (2013).
  9. Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation. Lab on a chip. 11, (11), 1870-1878 (2011).
  10. Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients. Biosens. Bioelectron. 26, (4), 1701-1705 (2010).
  11. Vona, G., Sabile, A., et al. Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am. J. Pathol. 156, (1), 57-63 (2000).
  12. Marrinucci, D., Bethel, K., et al. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Human pathology. 38, (3), 514-519 (2007).
  13. Lin, H. K., Zheng, S., et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin. Cancer Res. 16, (20), 5011-5018 (2010).
  14. Williams, A., Rawal, S., et al. Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells. PHT. 220-223 (2013).
  15. Ao, Z., Parasido, E., et al. Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications. Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).
  16. Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter. Cancer Res. 70, (16), 6420-6426 (2010).
  17. Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. J. Control. Release. 11, (1-3), 255-265 (1990).
  18. Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11, (11), 571-576 (1990).
  19. Deng, Y., Zhang, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci. Rep. 4, 7499 (2014).
  20. Hou, S., Zhao, H., et al. Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures. Adv. Mater. 25, (11), 1547-1551 (2013).
  21. Xiao, Y., Zhou, H., et al. Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6, (23), 20804-20811 (2014).
  22. Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients. BMC cancer. 15, (1), 403 (2015).
Capture and Release av Levedyktige Sirkulasjonstumorceller fra Blood
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).More

Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter