Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Fånga och Release av livsdugliga cirkulerande tumörceller från blod

doi: 10.3791/54435 Published: October 28, 2016

Summary

Ett protokoll för att använda en poly (N -iso-propylakrylamid) (PIPAAm) belagd mikro för effektiv infångning och termoresponsiv frisättning av livsdugliga cirkulerande tumörceller (CTC) presenteras. Denna metod tillåter fångst av CTC från patienternas blod och efterföljande frisättning av livskraftig CTC för nedströms utanför chipset kultur, analyser och karakterisering.

Abstract

Vi visar en metod för storleksbaserad infångning av livsdugliga cirkulerande tumörcell (CTC) från helblod, tillsammans med frisättningen av dessa celler från chip för analys och / eller kultur nedströms. Strategin utnyttjar användning av en ny Parylen C membran slot pore mikrofilter för att fånga CTC och en beläggning av poly (N -iso-propylakrylamid) (PIPAAm) för termoresponsiv livskraftig frisättning av det infångade CTC. Infångandet av levande celler har aktiverats genom att utnyttja utformningen av en slits porgeometrin med specifika dimensioner för att minska skjuvspänningen vanligtvis förknippas med filtreringsprocessen. Medan mikrofiltret uppvisar en hög infångningseffektivitet, är frisättningen av dessa celler icke-trivial. Normalt är endast en liten andel av celler frigörs när tekniker såsom omvänt flöde eller cell skrapning används. Den starka vidhäftningen av dessa epitelceller cancerceller till Parylen C membranet är hänförlig till icke-specifik elektrostatisk växelverkan. Att motverka thär effekt, använde vi användning av PIPAAm beläggning och utnyttjade sina termiska känsliga gräns egenskaper att frigöra cellerna från filtret. Blod filtreras först i rumstemperatur. Under 32 ° C, är PIPAAm hydrofil. Därefter filtret placeras i antingen odlingsmedia eller en buffert som hölls vid 37 ° C, vilket resulterar i att PIPAAm vrida hydrofoba, och därefter frigöra elektrostatiskt bundna celler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Metastatisk sjukdom är ansvarig för de flesta dödsfall i cancer. Utveckla prognostiska och följeslagare diagnostisk biomarkör för metastaser är avgörande för cancervården och behandling. Cirkulerande tumörceller (CTC) spelar en central roll i tumörspridning och metastas. Dessutom är lättillgänglig som en "flytande biopsi" biomarkör, CTC hos cancerpatienter "har perifert blod ökat som en" grogrund "för cancer biomarkör forskning. CTC har väl validerade som en prognostisk biomarkör i olika miljöer cancer, inklusive bröst-, prostata- och tjocktarmscancer 1-3. Emellertid har de senaste framstegen inom CTC fält visade att ren uppräkning av dessa sällsynta celler har begränsad klinisk användbarhet, såsom visas i interventionella kliniska försök 4. Således finns det ett växande behov av tekniker som gör det möjligt för molekylär och funktionell karakterisering av CTC. För närvarande finns det endast ett fåtal tekniker som gör det möjligt for icke-antigen partisk, livskraftig infångning och frisättning av CTC, som möjliggör robust nedströms molekylär och funktionell analys 5,6. Majoriteten av dessa mikrofabricerade enheter är kopplade till mikroflödes plattformar och därmed ha en begränsande faktor i mängden blod som kan behandlas, som sträcker sig från 2-4 ml 7-10. CTC är sällsynta händelser i ett enda rör av blod draw (7,5 ml), således ytterligare minskar mängden blod som kan behandlas, avsevärt hindrar chanserna att fånga och isolering av dessa celler av intresse.

Vi har utvecklat två typer av Parylen C membranmikrofilteranordningar för fångst av CTC som utnyttjar storleksskillnader mellan större tumörceller och de mindre normala blodceller 11,12. Vi har tidigare rapporterat om den runda porer uppräkning filter och jämförde det med en FDA-godkända plattform, där mikro visade sig vara överlägsen i CTC infångningseffektivitetenför cancerpatient blodprov 13,14. Emellertid är en begränsning av den runda filtret nödvändigheten av att använda ett formaldehydbaserat fixativ före filtrering. Denna process bevarar cellerna morfologi samtidigt som de motstå skjuvspänningen och tryck under filtreringsprocessen. Medan uppräkning och molekylära studier kan utföras on-chip 13, försämrar fixativet förmågan att utföra funktionell karakterisering. Att ta itu med denna begränsning, har vi utvecklat en slits porfilter som negerar nödvändigheten att fixera celler före filtrering (figur 1). Spåret porgeometrin (6 um bredd x 40 pm längd slot porer) gör att tumörcellerna fångas medan endast delvis täppa en por och därmed fortfarande tillåter fri passage för andra blodkroppar och lindra tryckökningen som skulle leda till cellskador och eventuell sprängning 15,16 Slits por patron består av 2 stycken som smörgås akrylslitsen porfilter mellan topp- och bottenstycket med Polydimetylsiloxan (PDMS) tjäna som en packning för att åstadkomma en läcksäker tätning 14,15 (Figur 1).

Medan uppsamlingskapacitet av slitsen porfilter är hög, är (tabell 1), den fångade CTC bunden till Parylen C membranet genom starka icke-specifika elektrostatiska interaktioner i stället för extracellulära matrisen (ECM) medierad adhesion 15. Metoder såsom omvänd flöde eller användning av cellskrapor misslyckas med att effektivt frigöra cellerna från filtret, eller resultera i cellskada och celldöd. Vi utforskade en okonventionell användning av PIPAAm att formulera en strategi för att frigöra 15. PIPAAm är en polymer som undergår en reversibel lägre kritisk lösningstemperatur (LCST) fasomvandling vid en lösningstemperatur av 32 ° C 17. Traditionellt har denna egenskap hos PIPAAm varit allmänt utforskas för vävnadstekniska tillämpningar. Typiskt är cellernaodlades på PIPAAm belagda ytor vid 37 ° C när PIPAAm är hydrofob. Cellerna kan sedan lösgöras som ett ark när odlingstemperaturen skiftas till under 32 ° C, där PIPAAm belagda ytan blir hydratiserad 17,18. Vi utnyttjade denna termiska egenskapen genom att utföra filtreringsprocessen vid rumstemperatur (under 32 ° C) och därefter möjliggöra cellfrisättning genom att placera filtret i odlingsmedier som hölls vid 37 ° C. Vid denna temperatur blir PIPAAm polymerskiktet hydrofobt, för att därigenom frigöra det elektrostatiskt bundna celler 15 (figur 1).

Även den temperaturkänsliga metod liksom andra metoder har framgångsrikt genomförts för att uppnå livskraftig CTC fånga och släpp 19-21, en nyckel potentiell nackdel som delas av dessa tekniker som rapporterats är att de alla använder en antigen-beroende princip för CTC fånga. Antigenbaserade CTC fånga, som visas pidigare, kan leda till partiska CTC analys 11,14. Till exempel har många affinitetsbaserade tekniker använder antikropp som binder EpCAM för CTC fånga. Emellertid har CTC visats uttrycka olika nivåer av EpCAM, vilket leder till utelämnandet av EpCAM låg och EpCAM negativ CTC genom denna teknik. Dessutom kan begränsningar uppstå när CTC från icke-epitelial ursprung är av intresse, såsom CTC i melanom och sarkom inställningar. Således, är mycket önskvärt en teknik som gör det möjligt för livskraftig CTC infångning och frisättning utan eventuell bias infördes genom antigenbaserade fånga.

Viktigare, är mikrofiltret infångningsanordningen rent dimensionerad baserat och släppstrategi är agnostic på närvaron av vissa ytmarkörer. Vi tror att anställning av PIPAAm belagda mikro kommer att bidra till vår förståelse av metastatisk process, genom att tillhandahålla möjligheten att på ett effektivt sätt fånga och släpp CTC för analyser nedströms. Detta kan potentaially exponera nya molekyler som nya riktade systemiska behandlingar kan riktas samt ge en biomarkör som kan övervakas enkelt och stöd i cancer patienthantering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik uttalande: För att skydda rättigheterna för försökspersoner togs blodprover efter ett informerat samtycke enligt protokoll som godkänts av University of Miami institutionella prövningsnämnder enligt IRB 20.150.020.
OBS: Blod filtreras för CTC fånga bör samlas i ett EDTA-rör för att förhindra koagulering.

1. Beläggning av mikrofilter med Poly (N-iso-propylakrylamid) (PIPAAm)

  1. Väg upp PIPAAm för framställning av en 10% vikt / volym lösning i butanol. Blanda med hjälp av en virvel tills lösningen är klar.
  2. Cut plastobjektglas i ungefär 12 mm x 12 mm rutor antingen med en sax eller vass kniv. Alternativt kan du använda en giljotin.
    OBS: Dessa kvadrater kommer att fungera som en hållare för filtren under spinnbeläggningsprocessen.
  3. Med hjälp av en vass par raka kant sax, klippa spåret pore mikro skivan i 8 mm x 8 mm rutor.
  4. Med hjälp av en polyimidfilm band fast de skurna filter på plast squares tidigare skära i steg 1,3. Applicera filmen endast till kanten och hörnet av filtret så att åtminstone 7 mm x 7 mm av filterarea är un-täckt av bandet.

figur 2
Figur 2:. Representant Illustration av Mikro set-up för PIPAAm Beläggning 8 mm x 8 mm mikro placeras på 12 mm x 12 mm plast kvadrat snitt från en plastobjektglas. Polyimidtejp används för att fästa mikro på plats för att snurra belägga PIPAAm.Reproduced med tillstånd från referens 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Placera mikro som är fäst på plast torg, på vakuumchuck av spinnbeläggnings.
  2. Programmera spin-coater med följande recept: Start, 500 rpm under 10 sek, 6000 rpm för 60 sek, 500 rpm under 10 sek, stopp.
  3. Dispensera nog 10% vikt / volym PIPAAm-lösning (framställd i 1,1) för att fullständigt täcka mikrofiltret ytan med användning av en standard plast överföringspipett och starta spinnbeläggare.
  4. Avlägsna PIPAAm belagda mikrofiltret från spin-coater efter beläggningsprocessen är klar. Låt filtret fäst plast torget under lagring.
    OBS: Den belagda-filter kan förvaras vid rumstemperatur i upp till 3 månader.

2. Montering av filtreringskassetten med PIPAAm Coated Mikrofilter

  1. Rehydrera PIPAAm belagda mikrofiltret vid rumstemperatur genom att placera mikrofiltret fortfarande fäst på plast kvadrat i en petriskål. Lägga 1x PBS tills mikrofiltret är helt under vatten och låt stå i 5 min.
  2. Efter hydrering steg släpper filtret från plast torget genom att skära polyimidfilmen band med ett par sax.
    OBS: Lägg märke till vilken sida av filtret harden PIPAAm beläggningen.
  3. Montera mikrofiltret in i filtreringskassett, genom sandwiching mikrofiltret mellan toppen och botten akryl tillsammans med de två Polydimetylsiloxan (PDMS) bitar i egenskap av en packning / tätning. Kläm fast akryl kassett med klämmor för att säkra filtret och ger en tät förslutning.
    OBS: PIPAAm beläggningen bör vara vänd uppåt, så som provet filtreras genom, kommer cellerna att infångas på PIPAAm belagda ytan av filtret (Figur 1).

3. Filtrering av blodprov med Capture and Release av CTC från Mikrofilter

  1. Eftersom varje sprutpump varumärke har sin egen användargränssnitt, se bruksanvisningen för pumpen och programmera sprutpump att flyta med en hastighet av 75 ml / h och ställ in volymen på 20 ml.
  2. Varma 3 ml McCoys (kommersiellt tillgänglig) cellodlingsmedium (framställt genom att tillsätta i 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin och streptomycin) till 37 ° C.
  3. Lägga 7,5 ml av kommersiellt tillgänglig Hanks balanserade saltlösning (HBSS) till 7,5 ml blod prov och aspirera denna utspädda blod till en 25 ml spruta.
    OBS: Justera volymen HBSS så att blodprovet späds med lika stor volym av 1: 1 med HBSS T.ex. om 10 ml blod används, blanda sedan med lika stor volym av 10 ml HBSS för att uppnå ett. 1 utspädning.
  4. Engagera filtreringskassett med sprutan och placera den på sprutpumpen. Placera ett 50 ml rör vid botten för att samla flödet genom och starta pumpen.
    OBS: Filtreringen bör ta ungefär 10 12 min. Alla filtreringssteg ska utförasvid normal rumstemperatur (20-25 ° C), inklusive steg 3,8
  5. Efter filtrering är klar, koppla ur filtreringskassett ta notera vilken sida är toppen som har cellerna som fångats på PIPAAm belagda ytan. Sug 1 ml av den varma odlingsmedium i en ny spruta.
  6. Re-ingrepp med filtreringskassett med sprutan innehållande media, men vid denna tidpunkt ingriper den nedre änden av kassetten så att PIPAAm belagd-ytan av filtret är vänd bort från sprutan.
    OBS: Detta kommer att vara att släppa några celler som kan bäddas in i spel porerna genom ett lätt omvänt flöde.
  7. Placera sprutan tillbaka på sprutpumpen och hålla en liten petriskål eller 6-brunnar rätt under filtreringskassett. Ställa in flödeshastigheten till 100 ml / h och starta pumpen.
  8. Passera alla medier genom filtret och samla genomflödet i petriskålen. Vänta tills alla medier att passera och sedan stoppa pumpen och ta bort sprutan ennd filtreringskassett från pumpen.
  9. Frikoppla filtreringskassett från sprutan och öppna den för att hämta filtret från kassetten. Placera filtret med PIPAAm ytan riktad nedåt i samma petriskål som används för att samla in det omvända flödet när frigöra cellerna från porerna. Tillsätt resten av det varma mediet och placera petriskålen i en odlingsinkubator inställd på 37 ° C.
  10. Efter 30 min alla celler kommer att frigöras från filtret. Men lämna filter i petriskålen i upp till 24 timmar för att säkerställa att alla celler lossnar.
    OBS: Alternativt kan de frigjorda cellerna samlas i ett mikrocentrifugrör för att utföra ytterligare analys nedströms såsom PCR, ELISA, Western Blöt för att nämna några exempel.
  11. Efter 24 timmar i kultur, försiktigt bort mikro med pincett.
    OBS! Filtret kan kastas vid denna tid som cellerna har släppts från den.
  12. pipett försiktigt odlingsmediet upp och ner med en 1000 & #181; l pipett för att återsuspendera erytrocyter och perifert blod mononukleära celler (PBMC) som fångas på filtret och släpps ut i plattan med CTC. Utföra den här åtgärden noggrant och försiktigt för att undvika att lossa löst lösa cancerceller. Försiktigt bort hela mediet innehållande resuspenderas erytrocyter och PBMC medan bakom fäst-cancerceller och ersätta med färskt medium förvärmas till 37 ° C.
    OBS: Detta steg kan upprepas en gång om alltför erytrocyter är närvarande efter en tvätt.

4. CTC Viabilitet Utvärdering

  1. Utvärdera odlade CTC lönsamhet med hjälp av en Live / Dead Assay 8.
    NOT: Numerous Live / Dead analyser är kommersiellt tillgängliga. Att följa tillverkarens protokoll är mycket rekommenderas. Hänvisas till listan med material / reagens för den kommersiella analyskit användes för detta experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med friska donatorer blod (som erhållits enligt ett protokoll som godkänts av University of Miami IRB 20.150.020 efter ett informerat samtycke) spetsad med odlade cancerceller, den termoresponsiva teknik för frisläppande av livsdugliga cirkulerande tumörceller (CTC), uppnådde infångning, utsättningen och hämtning effektivitet av 94% ± 9%, 82% ± 5% och 77% ± 5% (tabell 1) 15. Som jämförelse, var frisättningen och hämtning effektivitet obelagda filter betydligt lägre (7% ± 1% frisättning effektivitet och 6% ± 1% hämtning effektivitet) (tabell 1) 15. För att utvärdera viabiliteten hos CTCs frigörs från filtret, ~ 1000 SK-Br-3-celler spikades i 7,5 ml av friska givarens blod, filtreras genom PIPAAm belagda slitsfilter och släpptes med användning av förfarandet som beskrivits ovan. En Live / Dead analys utfördes för att utvärdera cellviabiliteten före spik i blodetoch efter frigivningen. Pre-spik livskraft var 98% (592 av 602 räknade celler) och livskraft celler infångade och frigörs från blodet var 95% (540 567 celler räknade) 15 (figur 3A). Parallellt cellerna fångas och frigöras efter filtrering från blodprovet odlades i McCoys 5A-odlingsmedium. Bilder togs vid dag 3 och dag 10. Såsom visas i figur 3B, celler som frigörs från filtret inte bara förblev viabla, men expanderade snabbt i kultur, vilket sålunda upprättandet deras viabilitet postfiltrering.

Figur 1
Figur 1:. PIPAAm Coated Slot filter för att fånga och Release cirkulerande tumörceller från blod (Top panel) (A) Brightfield bild av PIPAAm belagd slot filter; (B) Filtrering av helblod för CTC fånga. (C) Schematisk bild av than mikrofilterkassetten där, PIPAAm belagda slot filter är inklämt mellan den övre och undre kassett. (Botten) (D) Schematisk bild av processen för att släppa fångade CTC från PIPAAm belagda slot filter. Återges med tillstånd från referens 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Capture, utsläpp och kultur av livsdugliga tumörceller celler bröstcancer (SKBR-3) spetsade i normal givarblod fångades och släpptes med hjälp av en PIPAAm belagd mikro. Cellerna förblev livskraftiga efter release och expanderas i odling snabbt. (A) Live-dead analys utförd på cellerna frigörs från filtret. 95% (540 av 567 räknade celler) av cellerna visade sig vara livskraftiga(Grön) efter lanseringen. Döda celler är märkta med rött. (B) Dag 3 till dag 10 kultur av celler som frigörs från PIPAAm belagd slot filter. Cellerna förblev livskraftiga och expanderas i odling. Skalstreck = 100 μm.Reproduced med tillstånd från referens 15. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Mätning av Pore parametrar före och efter PIPAAm Coating bright bilder av slitsfilter (A) före och (B) efter PIPAAm beläggning.. (C) Pore längd minskades med 7,3% ± 2,1% efter PIPAAm beläggning och por bredd minskade med 15,3% ± 5,6% efter PIPAAm beläggning. Återges med tillstånd från referens 15.Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Kontaminerande erytrocyter och leukocyter avlägsnas genom Gentle Tvättar Cirka 1000 SKBR-3-celler hämtades från blod genom PIPAAm belagda slitsfilter och utströks på en 48-brunnars platta.. (A) Vid 16 h i odling, var SKBR-3-tumörceller vidhäftade odlingsplatta (gröna pilar), medan apoptotiska erytrocyter och leukocyter även lösa vid botten av plattan (röda pilarna). (B) Post-wash, icke-vidhäftande celler avlägsnades, vilket lämnar vidhäftande tumörceller på plattan (gröna pilar). Återges med tillstånd från referens 15. Vänligenklicka här för att se en större version av denna siffra.

bord 1
Tabell 1:. Capture, utsläpp och hämtning Effektivitet av PIPAAm Coated Slot Filter Fånga effektivitet = cell nummer fångat på filtret före siffror release / cell spetsade i blodet. Släpp effektivitet = cellantal frigörs från filter / cell nummer fångas på filtret innan release. Hämtning effektivitet = cellantal som frigörs från nummer filter / cell spetsade in blood.Reproduced med tillstånd från referens 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Processen att fånga livskraftig CTC från helblod och frigöra dem från mikro är relativt enkelt; men några kritiska punkter är värda att nämna. Det är absolut nödvändigt, som vid all cellkultur som ett sterilt tillstånd upprätthålls genom hela processen. Det initiala steget att belägga filtret med PIPAAm är kritisk, som grund för den teknik för att frigöra cellerna från filtret baseras på att utnyttja PIPAAm s temperaturkänsliga gränsegenskaper. För att säkerställa att filtret har belagts effektivt mäta storleken på en por (bredd och längd på en slits por) på filtret under ett mikroskop före beläggning och sedan återigen mäta en porstorlek post beläggning. Porstorleken bör minskas med 1 ^ m på både bredden och längden (Figur 4). Som nämnts, facket filtret samtidigt fånga CTC effektivt fångar också några stora PBMC-celler, men dessa celler är icke-vidhäftande celler och därmed During steg 3,13 avlägsnas från kulturen lämnar bakom vidhäftande cancerceller (Figur 5).

Mindre ändringar i protokollet kan behövas om olika volymer av blod ska filtreras eller i de fall när viskositeten är extremt hög. Som nämnts i protokollet, är det viktigt att späda blod 1: 1 med HBSS. Viskositeten för blod varierar från patient till patient, men för det mesta kommer detta inte att påverka filtrering. Det kommer att finnas vissa tillfällen när viskositeten är extremt hög eller stora blodproppar är närvarande, i vilket fall sprutpumpen inte kommer att kunna tvinga blodet genom filtret. Det rekommenderas i dessa fall för att stoppa sprutpumpen, frigöra kassetten från sprutan, öppna den övre delen av kassetten, men lämnar filtret fortfarande sitter i nedre delen. Stora blodproppar kommer att vara väl synlig på filtret. pipett försiktigt 1 ml HBSS på filtret medan du håller kassetten på en liten angle för att medge att proppen att tvätta bort. När proppen har tagits bort, stänga kassett, åter engagera den på sprutan och fortsätta filtrering.

Medan PIPAAm belagda filter kan göras i omgångar och lagras för senare användning, har vi funnit att hållbarhetstiden för dessa förbelagda filter är ungefär 3 månader. Den effektiva infångning och frisättning av cellerna kan minskas delvis på grund av PIPAAm förnedrande över tiden.

En av de begränsande faktorerna för att etablera en kultur från patient CTC kommer att ligga i antalet CTC som är närvarande i blodprovet. Låga siffror kommer sannolikt att förmågan att expandera cellerna extremt svårt om inte omöjligt. Emellertid kan sekvestrering av ett prov med låga celltal i mindre kulturområden hjälp med, såsom i en enda brunn av 96-brunnsplatta i stället för en 6-brunnsplatta. Identifieringen av odlingsmedier, eller modifiering av kommersiellt tillgängliga medier, kommer att ge en optimal miljö for dessa celler att växa är en annan utmaning som måste övervinnas.

Molekylära och cellulära analyser av CTC ger värdefull information för cancer prognos och kan bidra till att driva precision medicin 15. Viabiliteten hos cellerna frigörs från inspelnings filtret är en viktig utveckling mot möjligheten att odla patienten CTC för läkemedelskänslighet och screeningtest. Det har länge känt till att CTC tenderar att skilja sig från den primära tumören och därmed nödvändigheten att behandla både i enlighet därmed. Som ett exempel, Schneeweiss et al. rapporterade att i metastaserad bröstcancer (MBC), antigen profiler på metastaserad vävnad och primärtumör skiljer sig upp till 20% av patienterna. Omvärdering av prediktiva markörer, inklusive human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 (HER2) uttryck, kan bidra till att optimera MBC behandling. Medan vävnadsprovtagning är invasiv och ofta svårt att upprepa, kräver CTC analys bara ett blodprov och kan ge en enkel att upprepa realtid & #34, flytande biopsi "tillvägagångssätt 22.

En stor betydelse för tekniken ligger i det faktum att medan flera plattformar som vanligen används i CTC avskiljning och analyser är begränsade i molekylära och cellulära analyser som fixeringsmedel är nödvändig för att bearbeta provet, eller CTC immobiliseras på plattformen. Vidare kan affinitetsbaserade system, som möjliggör livskraftig CTC fånga och släpp, potentiellt påverkas av valet av målantigen 15. Alternativt spåret filter med PIPAAm beläggningen ger en etikett fri plattform som är effektivt och ändamålsenligt att fånga och frisättning av livskraftig CTC från helblod. Denna metod ger möjlighet för ytterligare karakterisering av livskraftig CTC, inklusive encelliga fenotypisk och genomanalys samt ex vivo CTC kultur.

Arbete pågår för att använda denna teknik för kliniska tillämpningar. Förmågan att effektivt kultur CTC från patient prover kommer att leda till utformningen av effektiva terapi regementen på en patient till patient, avslöjar nya läkemedelsmål och leda till utveckling av effektiva kemoterapeutiska.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slot Filter Circulogix Inc. MSF-01 Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)  Ploysciences Inc. 21458 Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol Sigma Aldrich B7906 Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides Cole-Parmer 48510-30 Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater Specialty Coating Systems SCS G3 Spin Coater Instrument
Polyimide Tape Uline S-7595 Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
1x PBS Gibco 10010-023
Falcon Petri dishes 35 x 10 mm VWR 25373-041
Microfilter Cassette Circulogix Inc. FC-01 Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine 
Syringe 20 ml BD Scientific 302830
Syringe Pump KD scientific  78-0100V Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used
Cellstar 50 ml Centrifuge tube VWR 82050-322
Greiner Bio One 6 well plate VWR 89131-688 Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells ATCC HTB-30
Live Dead Assay Life Technologies L3224 Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator VWR 98000-368 Any incubator that can be used for cell culture will suffice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351, (8), 781-791 (2004).
  2. de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, (19), 6302-6309 (2008).
  3. Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20, (7), 1223-1229 (2009).
  4. Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500. J. Clin. Oncol. 32, (31), 3483-3490 (2014).
  5. Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip. Lab chip. 11, (17), 2827-2834 (2011).
  6. Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci. Transl. Med. 5, (179), 179 (2013).
  7. Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450, (7173), 1235-1239 (2007).
  8. Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System. PLoS ONE. 8, (6), (2013).
  9. Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation. Lab on a chip. 11, (11), 1870-1878 (2011).
  10. Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients. Biosens. Bioelectron. 26, (4), 1701-1705 (2010).
  11. Vona, G., Sabile, A., et al. Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am. J. Pathol. 156, (1), 57-63 (2000).
  12. Marrinucci, D., Bethel, K., et al. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Human pathology. 38, (3), 514-519 (2007).
  13. Lin, H. K., Zheng, S., et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin. Cancer Res. 16, (20), 5011-5018 (2010).
  14. Williams, A., Rawal, S., et al. Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells. PHT. 220-223 (2013).
  15. Ao, Z., Parasido, E., et al. Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications. Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).
  16. Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter. Cancer Res. 70, (16), 6420-6426 (2010).
  17. Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. J. Control. Release. 11, (1-3), 255-265 (1990).
  18. Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11, (11), 571-576 (1990).
  19. Deng, Y., Zhang, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci. Rep. 4, 7499 (2014).
  20. Hou, S., Zhao, H., et al. Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures. Adv. Mater. 25, (11), 1547-1551 (2013).
  21. Xiao, Y., Zhou, H., et al. Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6, (23), 20804-20811 (2014).
  22. Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients. BMC cancer. 15, (1), 403 (2015).
Fånga och Release av livsdugliga cirkulerande tumörceller från blod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).More

Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter