Protocol
Das folgende Verfahren wird 7,8 angepasst Wettbewerber Stämme mit Inhibitor-produzierenden Stämmen getestet werden .
Hinweis: Dieses Protokoll beinhaltet Aerosolerzeugung mit Bakterienkulturen. Dies kann nur in einem geschlossenen Raum mit der Umsetzung von lokal zugelassenen Sicherheitsüberlegungen durchgeführt werden. Sprühen der Kultur auf die Agar-Platten innerhalb eines Level 2 Sicherheitsschrank wird eine Verschmutzung der Agar-Platten und die Umgebung zu minimieren. Dadurch wird auch die Forscher von Aerosol-Inhalation der versprühten Bakterien zu schützen, ist dies ein wichtiges Anliegen, wenn die Forscher Stufe 2 Organismen verwendet. Geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Die Fläche der Petrischale umgibt, wird am besten mit saugfähigen Wegwerfgewebe bedeckt. Post-Spray Dekontaminations UV-Licht wird empfohlen.
1. Vorbereitung der Agarplatten
- Bereiten Hirn-Herz-Infusion (BHI) -Agar gemäß der manulers Anweisungen.
- Autoklaviert die BHI-Agar bei 121 ° C, 15 psi für 20 min oder entsprechend Autoklaven Empfehlungen des Herstellers, zu sterilisieren.
- Gießen Sie 15 ml Aliquots von sterilisierten BHI-Agar in sterile Petrischalen und lassen Sie es zu setzen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, jeder Agarplatte verwendet werden innerhalb der Test aus dem gleichen Bestand an Agar stammt und dass es die gleiche Menge an Agar in jeder Platte. Dies schränkt die Variabilität in verfügbaren Nährstoffe und Inhibitor Diffusion zwischen den Platten ermöglicht die Vergleichbarkeit.
2. Vorbereitung Sterile Broth
- Bereiten Sie BHI-Brühe gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- 10 ml Aliquots von BHI bis 28 ml Glas Universal-Flaschen.
- Autoklaviert die BHI broth bei 121 ° C, 15 psi für 20 min oder entsprechend Autoklaven Empfehlungen des Herstellers, zu sterilisieren.
HINWEIS: Sicherstellen, dass alle im Test verwendeten Brühe stammt aus der gleichen Charge von Brühe autoclaved Variation in Nährstoffe zur gleichen Zeit zu begrenzen, die Variation in den Ergebnissen führen könnte.
3. Vorbereitung Sterile Vaporizer Flasche (n)
- Bauen Sie die Verdampfer Flasche.
- Spray 5% oberflächenaktive Reinigungsmittel durch den Verdampfer interne Verunreinigungen zu beseitigen, genießen Sie die Verdampfer Flasche, Deckel und Verdampfer in der 5% oberflächenaktive Reinigungsmittel über Nacht.
HINWEIS: Handschuhe und geeignete persönliche Schutzausrüstung zu verwenden, wenn oberflächenaktive Reinigungsmittel behandeln. - Trocknen Sie den Verdampfer, Deckel und Flaschen unter sterilen Luftstrom Haube.
- Füllen Sie die Flasche mit 70% Ethanol, wieder anbringen und Verdampfer Teil des Ethanols durch den Verdampfer sprühen.
- Setzen Sie den Deckel auf dem Verdampfer und speichern mit dem Ethanol im Inneren bis zur Verwendung.
- Unmittelbar vor aseptisch spülen Sie die Flasche mit steriler BHI-Brühe zu verwenden und die Brühe durch den Verdampfer sprühen.
ANMERKUNG: Dies verhindert, dass das Ethanol affektierender die in die Flasche gegeben Inokulum in Abschnitt 6.3.
4. Vorbereitung der bakteriellen Übernachtkultur (en)
- Streak der Wettbewerber und Inhibitor-Stämme auf eine sterile BHI-Agar-Platte und Inkubation bei 37 ° C aerob für etwa 18 Stunden (über Nacht).
ANMERKUNG: Diese Platte erzeugt einen Vorrat von Bakterien, die für mehrere Wiederholungen innerhalb derselben Woche verwendet werden können, wenn sie bei 4 ° C gelagert. - Impfen 10 ml steriler BHI-Brühe mit einer Einzelkolonie des erforderlichen Wettbewerber Bakterienstamm in einem 28 ml Universal-Flasche.
- Inkubieren Sie die Universal-Flasche bei 37 ° C aerob über Nacht in einem Schüttler bei 250 Umdrehungen pro Minute schütteln.
5. Spot-Kultur des Inhibitors produzierenden Isolate
- Bereiten Sie die Nacht-Kultur (en), wie in Abschnitt 4 beschrieben.
- Stellen Sie sicher , Agar - Platten sind vollständig trocken, ohne Kondensation auf dem Deckel, vor der Impfung (zB durch pla Inkubationte für 60 min bei 37 ° C); Dies verhindert, dass der Impfstoff von der Impfstelle über die Platte zu verbreiten.
- Je 25 ul der Übernachtkultur auf die Mitte der Agarplatten. Vermeiden Sie vollständig die Pipette Hineindrücken des Kolbens Luftblasen zu verhindern, dass die Kultur in den Agar sprühen.
- Erlauben die Kultur bei Raumtemperatur trocknen Ausbreitung der Kultur zu begrenzen. Inkubieren der Agarplatten bei 37 ° C über Nacht unter aeroben Bedingungen.
6. Vorbereitung der Spray Inokulum des Test-Competitor-Stamm (n)
- Bereiten Sie die Nacht - Kultur , wie in Kapitel 4. Verdünnen Sie die Nacht - Kultur 10 - fach in BHI - Bouillon beschrieben auf etwa 4 x 10 6 CFU ml -1 und eine Suspension von OD 600 0,3 ± 0,05 erhalten.
HINWEIS: Eine 10 - fache Verdünnung geben nicht 4 x 10 6 CFU ml -1 für alle Bakterienarten, die Berechnung der notwendigen Verdünnungsfaktor durch Ausbreitung Plattierung Reihenverdünnungen zwischen 1 x 10 - Gießen Sie die verdünnte Kultur in einen sterilen Plastik Parfüm Verdampfer Flasche.
HINWEIS: Das Gesamtvolumen muss mehr sein als notwendig ist für die Anzahl der Agar-Platten gesprüht wird. Ungefähr 250 & mgr; l pro Platte ist für einen Durchmesser von 9 cm Petrischale geeignet.
7. Latente Growth Inhibition Assay
- Sprühen der Kultur durch jeden der Verdampfer Flaschen zu gewährleisten, dass die Kultur in der Spritzmechanismus geladen wird, bevor auf den Agar Aufsprühen.
- Aus einer Entfernung von etwa 15 cm über dem Agar, Spray etwa 250 & mgr; l der verdünnten Kultur (3 Sprays eines typischen 50 ml Verdampfer) über die gesamte Agaroberfläche. Inkubieren der Agarplatten bei 37 ° C über Nacht unter aeroben Bedingungen. Wiederholen für andere Platten mit der gleichen Anzahl von Sprays.
8. Interpretieren Latente Growth Inhibition Assay Ergebnisse
- Messen Sie die Wachstumshemmung Zone des versprühten Wettbetor - Stamm (1A - C, "X" zu "X") in mm, der Durchmesser der zentralen Stelle des Inhibitors-Produzent Subtrahieren (1A - C, "Y" auf "Y").
HINWEIS: Figur 1E zeigt , wie diese Daten dargestellt werden könnten - Notieren Sie sich die Klarheit Punktzahl für die Zonen der Hemmung.
Hinweis: Dies zeigt den Grad der Hemmung beobachtet. Beispiele sind in 1A gezeigt - D - Stämme , die für die Standardisierung verwendet werden können , sind in den repräsentativen Ergebnissen Abschnitt vorgeschlagen. Die folgende Skala kann für Klarheit Scoring verwendet werden: eine Klarheit Score von 0 eine Zone der vollständigen Hemmung des Konkurrenten Stamm Wachstum zu beschreiben. Eine Punktzahl von 1 eine Zone fast vollständige Hemmung des Wachstums zu beschreiben, mit nur einzelnen Kolonien in der Zone der Lichtung. Eine Punktzahl von 2 eine sichtbare Zone mit reduziertem Wachstum zu beschreiben, das Wachstum innerhalb dieser Zone ist confließend oder nahezu konfluenten aber in der Dichte von> 50% reduziert. Eine Punktzahl von 3 nur eine minimale Wachstumsreduktion zu beschreiben, ist das Wachstum konfluent und vermindert um weniger als 50%, ist eine Zone noch sichtbar und messbar. Eine Punktzahl von 4 keine sichtbare Hemmung des Wachstums zu beschreiben. Eine Punktzahl von 5 zu beschreiben, dass das Wachstum des Kompetitors Stamm wurde in der Nähe des Test inhibitor-produzierenden Stammes erhöht. Siehe Abbildung 1 für Beispiele. Diese Werte sind subjektiv zu den Experimentator.
9. Replikate
- Wiederholungsassays mindestens in dreifacher Ausfertigung biologischen die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Ergebnisse zu bestimmen.
HINWEIS: Wenn Replikate an verschiedenen Tagen durchgeführt werden, Messungen und punkten Platten unmittelbar nach der Entnahme aus der Inkubation dann entweder speichern Platten bei 4 ° C oder qualitativ hochwertigen Fotos von Platten, bevor sie zu verwerfen. Lagerung oder Fotos von Platten ermöglicht einen einfachen Vergleich der Ergebnisse zwischen den verschiedenen Tagen, tsein ist besonders wichtig für reproduzierbare Scoring über Tage / Experimente bestätigt. Beachten Sie, dass die Lagerung der Platten, die das Potential Ergebnisse zu ändern hat.
HINWEIS: Für klare Fotografien Ort Platten aufrecht, ohne ihre Deckel auf einem matten schwarzen Hintergrund in einem Bereich von diffusem Licht, verwenden Sie eine hochauflösende Kamera (≥8 MP), der auf Gegenstände in der Nähe der Linse (Makro-Modus) zu konzentrieren. Alternativ können einige Gel-Imager mit trans-Illuminator mit weißem Licht setzen hohe Qualität zu produzieren, eine hohe Reproduzierbarkeit der Bilder.
Representative Results
Die Testergebnisse sollten als Differenz in dem überlagerten Wettbewerber Stamm in der Nähe des zentral spotted Inhibitor-produzierenden Stamm (Abbildung 1) zu beobachten sein. Diese Unterschiede lassen sich als Voll Hemmung (1A), die partielle Hemmung (1B und 1C) interpretiert werden, ohne Hemmung (1D) oder positive Assoziation. Die weithin verfügbar Laborstämme S. epidermidis und S. Tü3298 epidermidis RP62A und S. epidermidis und S. RP62A aureus Newman wurden in den 1B und 1D verwendet wurden . Wir schlagen vor, dass diese Stämme dieses Protokoll zu testen, verwendet werden könnten.
Je nach Spezies getestet, vollständige Hemmung und partielle Hemmung sind höchstwahrscheinlich das Ergebnis von antimikrobiellen Peptiden, Antibiotika oder anderen diffusionsfähiges Wachstum inhibitors durch den Inhibitor-produzierenden Stamm produziert. Teilweise Hemmung wurde auch aufgrund der reduzierten Nährstoffverfügbarkeit für die Wettbewerber Stamm - Aufnahme oder Sequestrierung von Nährstoffen durch den Inhibitor Stamm 6 in Verbindung gebracht worden.
Vergleich der Größe der Hemmzone zwischen verschiedenen Inhibitor-produzierenden getesteten Isolate gegen den gleichen Wettbewerber Stamm zeigt Unterschiede in einer der folgenden Eigenschaften: die Menge an antimikrobiellen durch den Inhibitor-produzierenden Stammes erzeugt wird; die Fähigkeit des Inhibitors durch die Medien zu diffundieren; die Art von Inhibitor produziert und der Widerstandsgrad des Wettbewerbers Stamm zu den Inhibitoren produziert. Vergleich der Größe der Hemmzone zwischen verschiedenen Konkurrenz getesteten Stämme gegen den gleichen Inhibitor-produzierender Stamm ist indikativ für die Widerstandswerte der Kompetitor-Stämme der Inhibitor produziert.
Wenn uneinheitliche Anwendung von Bakterien die Platten aufgetreten ist, sollten nicht verwendet werden. Wenn beispielsweise der Test Konkurrenzkultur zu verdünnt ist die Zone der Hemmung erscheint größer und mit einem weniger klar definierte Kante als üblicherweise (2A) beobachtet; dies würde die Zuverlässigkeit von Vergleichszone Messungen beeinflussen. Wenn der Inhibitor-produzierenden Stamm vor Ort nicht vollständig über Nacht vor der Inkubation getrocknet wurde, ist der Inhibitor Stamm wahrscheinlich zu verbreiten und nicht eine klar definierte Stelle (2B), die typischerweise eine Zone Messungen beeinflusst , sondern auch die Klarheit Scoring beeinflussen können. Ist der Teilnehmer-Stammgleichmäßig kann dies zu einer unausgewogenen Verteilung der Bakterien führen (Abbildung 2C) nicht besprüht. Wenn der Teilnehmer zu Belastung konzentriert ist , ist es möglich , dass die Wettbewerber Belastung auf der Oberseite des Inhibitor - Stamm (2C) wachsen können, in extremen Fällen kann dies bis zu einem gewissen Umkehrung der Wettbewerber / Inhibitor - Stamm Rollen führen.
Abb . 1: Der Bereich der qualitativen und quantitativen Ergebnisse , die aus der aktiven latenten Wachstumshemmung Testergebnisse für die Wachstumshemmung erhalten werden kann , kann im Bereich von (A) eine vollständige Hemmung (Score von 0), (B) teilweise Hemmung (Note 1) , (C) teilweise Hemmung (Score von 2) bis (D) keine Hemmung (Note 4). Etiketten zeigen die Ränder des Wachstums der Inhibitor-Stämme (Y) und der äußersten Kante der HemmungZonen (X). Die Größe der Hemmzone Bereich von 0 mm bis über 10 mm, wie in (E) gezeigt, die die Messungen für die Platten in A, B, C und D. Die Ergebnisse sind gezeigt für den letzten Staphylokokken Isolate (A zeigt fotografiert , C) oder gemeinsame Staphylokokken - lab - Isolaten S. epidermidis Tü3298 (Inhibitor) und S. epidermidis RP62A (Wettbewerber) (B), und S. epidermidis RP62A (Inhibitor) und S. aureus Newman (Wettbewerber) (D). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Beispiele für inkonsistente Ergebnisse aufgrund der schlechten Technik Ergebnisse etwas anders aus als erwartet , wenn (A. (B) Inhibitor - Stamm war nicht vollständig trocken sein, bevor die Inkubation / Platten waren nicht trocken oder (C) , wenn die Wettbewerber Belastung nicht gleichmäßig aufgesprüht wurde und zu konzentriert. Bitte hier klicken , um eine größere Version zu sehen dieser Figur.
Discussion
Ein kritischer Schritt dieses Bakterienart Wettbewerb Protokoll , das es von anderen unterscheidet, ist die Inkubation über Nacht des Inhibitors vor der Zugabe des Kompetitors Isolat isolieren. Der Inhibitor Stamm benötigt diese Wachstumsperiode inhibitorischen Verbindungen herzustellen. Als Kompetitor Belastung auf dem gleichen Medium überlagert wird, ermöglicht dieses Verfahren die Forscher das volle Potential zu beobachten des Inhibitors Stamm mit einem Wachstum des Wettbewerbers Belastung zu stören. Als Ergebnis spiegelt dieser Test, was mit der Natur geschieht; ein Isolat ist vollständig in einer Nische eingerichtet, und die andere müssen alle hemmenden Variablen entgegenzuwirken können der Lage sein, um erfolgreich die Nische eindringen.
Es gibt zwei Teile zu diesem Protokoll, die am ehesten zu fehlerhaften Ergebnissen führen, wenn nicht richtig durchgeführt wird. Zum einen kann unvollständige Sterilisation der Verdampfer Flaschen einführen Bakterien in den Test zu kontaminieren. IncuBation der Brühe verwendet, um den Verdampfer Flasche in Schritt 3.6 in ein steriles Gefäß zu spülen können Flaschen verwendet werden, vollständig sterilisiert, um zu bestätigen wurden. Zusätzliche Wäschen in desinfizierenden Lösungen, wie Virkon kann vor der Wäsche in oberflächenaktiven Reinigungsmittel verwendet werden, beschrieben in Schritt 3.2, ob zusätzliche Sterilisation erforderlich ist.
Ein zweiter Schritt, der zu falschen Ergebnissen führen kann, ist die Verdünnung des Wettbewerbers Stamm (Schritt 6.1). Wenn die Verdünnung nicht optimal, klare Messungen der Hemmung ist nicht leicht bestimmt werden. Dieser Test wurde unter Verwendung verschiedener Isolate nasal optimiert als Inhibitor produzierenden Stämme in einem breiten Spektrum von Gram-positive und Gram-negative Spezies im Vergleich zu S. aureus SH1000 als Wettbewerber Stamm 7,8. Es wurde anschließend unter Verwendung von verschiedenen Koagulase negative und Koagulase-positive Staphylokokken als Wettbewerber getestet und Inhibitor-produzierenden Stämme. Bei der Prüfung von Gattungen andere als die oben als Wettbewerber beschriebenStamm, einige Optimierung der Verdünnung des Inokulums kann notwendig sein.
Wenn Klarheit Partituren signifikant zwischen den Wiederholungen variieren, könnte es notwendig sein, den Wettbewerber Stamm Inokulum zu standardisieren, indem es auf eine bestimmte optische Dichte einstellen. Das wird jedoch die Zeit, die der Test einzurichten dauert, und wird wahrscheinlich die Zahl der Stämme zu reduzieren ist es möglich, pro Experiment zu verarbeiten. Optisch Einstellen der Kultur auf einen entsprechenden OD ein McFarland-Standard eine schnelle Alternative zur Verfügung stellen kann.
Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass es nur zu kultivierbaren Bakterien angewendet werden. Aus diesem Grund viele Studien verwenden 16S rRNA - Sequenzierung Konkurrenzausschluss Wechselwirkungen 3,4,13 zu prognostizieren. Allerdings genetische und Metagenom-Techniken können nur Mitglieder der Gemeinschaft auf Artenebene zu unterscheiden, und / oder berücksichtigen keine besondere innerartliche Merkmalsvariation. Es ist möglich, dass die Zuordnung eines particul zu screenenar Gen , das ein Merkmal mit der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Bakterienspezies codiert 5, jedoch erfordert dieses Vorwissen eines Gens wahrscheinlich unter Ausschluss zugeordnet werden einer Spezies.
Ein Sicherheitsaspekt dieser Technik ist, dass aufgrund der Aerosolerzeugung von Bakterien, kann es nur in Laboratorien mit einem Level 2 Sicherheitsschrank oder mit ähnlichen Sicherheitsvorkehrungen verwendet werden. Es gibt alternative Techniken für den Wettbewerb zwischen den Isolaten zu testen, die für intraspezifische Merkmalsvariation berücksichtigen und erzeugen keine Aerosole von Bakterien. Ein solches Verfahren ist die gleichzeitige Antagonismus - Test 2. In diesem Verfahren wird ein Inokulum von einem Isolat auf einer Agarplatte verteilt, und ein zweites Isolat Inokulum wird auf getüpfelt oder gestochen, sobald die erste getrocknet ist. Dies würde eine Umgebung, wo die Stämme im direkten Wettbewerb (gleichzeitige Antagonismus) erzeugen, die beide im Wettbewerb hemmende Verbindungen herzustellen und scavenge Nährstoffe zuerst. Die advantage des latenten Wachstumshemmung Assays über die gleichzeitige Antagonismus-Test ist, dass der Inhibitor-Isolat immer den Wettbewerbsvorteil ist voll etabliert, bevor Invasion des Konkurrenten Isolat haben sollte. Dies ist mehr reflektiert , was in der Umgebung passieren würde, wie in den meisten Nischen, wird ein Isolat hergestellt werden , bevor ein anderer Stamm hinzugefügt wird, anstatt zwei Isolate gleichzeitig 8 hinzugefügt wird.
Eine weitere Alternative zur Vermeidung von Aerosolerzeugung von Bakterien, die die Wettbewerber in Top-Agar isolieren hinzuzufügen wäre, die anstatt über den Inhibitor-Isolat gesprüht werden gegossen könnte. das Volumen der Top-Agar jedoch müssten hinzugefügt etwa 3 ml werden gleichmäßige Abdeckung der Platte zu gewährleisten. Innerhalb dieses Bandes würde die Kompetitor-Isolat nicht auf dem gleichen Medium wie dem Inhibitor Isolat wachsen, so würde nicht von reduzierten Nährstoffe leiden. Der Wettbewerber würde auch nicht mit irgendwelchen hemmenden Verbindungen in direktem Kontakt until sie in die Top-Agar diffundiert. Ein solcher Test nicht als aktive latente Hemmung oder gleichzeitige Antagonismus beschrieben werden könnte.
Ein ähnliches Verfahren wurde früher verwendet, um die Niveaus von Bacitracin Widerstand unter klinischen S. beurteilen aureus - Isolaten 10. Der wesentliche Unterschied zwischen dem Protokoll hier beschrieben und die von 10 beschrieben wurde , ist die letztere nur Klein Wettbewerber Stämme als sensibel (komplett inhibition- Klarheit Score 0) oder beständig (teilweise bis gar keine inhibition- Klarheit Score 1-5). Der latente Wachstumshemmung Assay könnte daher auch für die Höhe der Widerstand an die Erzeuger von bestimmten antimikrobiellen Mitteln zu screenen, verwendet werden, oder auch für neuartige antimikrobielle Substanzen wirksam gegen multiresistente Erreger zu suchen.
Es wurde vorgeschlagen , dass die Host - Mikroflora 9 unerwünschte Mitglieder der Bakteriengemeinschaft zu beseitigen manipuliert werden könnte. Die Anwendung von Corynebakterien oder Staphylococcus epidermidis wurden bereits S. gezeigt zu beseitigen aureus Besiedlung in den Nasenlöchern in einem erheblichen Teil der Bevölkerung 11,12. Studien in bestimmte Stämme, die kompetitiv unerwünschte Mitglieder der Wirts Flora, durch Techniken wie die hier beschriebene ausschließen kann, kann daher auf zukünftige Therapeutika führen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
JCM wird von einem BBSRC-IPA-Auszeichnung mit Unilever Plc (BB / L023040 / 1) gefördert. HAG wird von einem saudi-arabische Ministerium für Höhere Bildung PhD studentship finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
| agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Plastic perfume vaporizer | not known | - | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
| Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (~280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
| Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |
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