Protocol
다음 방법은 억제제 생산 균주와 경쟁 균주를 테스트하기 위해 7,8 구성된다.
참고 :이 프로토콜은 박테리아 문화와 에어로졸 생성을 포함한다. 이것은 로컬에만 승인 안전 고려 구현과 함께 포함 된 공간에서 실행될 수있다. 레벨이 안전 캐비닛 내에서 한천 플레이트에 문화의 분사하면 한천 플레이트의 오염과 주변 환경을 최소화 할 수 있습니다. 이것은 또한 스프레이 박테리아의 에어로졸 흡입에서 연구원을 보호 할 것, 이것은 연구자가 봉쇄 레벨이 생물을 사용하는 경우 주요 관심사이다. 적절한 개인 보호 장비를 착용해야합니다. 페트리 접시 주변 지역은 최고의 일회용 흡수 조직으로 덮여있다. UV 광을 사용 후 스프레이 오염 제거가 좋습니다.
1. 한천 플레이트를 준비
- 마뉘에 따라 뇌 심장 주입 (BHI) 한천을 준비의 facturer의 지시.
- 살균, 121 ° C, 오토 클레이브 제조업체의 권장 사항에 따라 15 ~ 20 분 동안 PSI, 또는에서 BHI 한천을 압력솥.
- 멸균 배양 접시에 멸균 BHI 한천의 15 ml의 분취 액을 붓고하고 설정할 수 있습니다.
주 : 시험 한천 동일한 스톡에서 유래 내의 모든 한천 플레이트를 사용할 수 있는지 확인하고, 각 접시 한천 동일한 양이된다. 이 사용할 수 영양분과 비교를 허용 판 사이 억제제 확산의 변동성을 제한합니다.
2. 멸균 국물을 준비
- 제조업체의 지침에 따라 BHI 국물을 준비합니다.
- 28 ㎖의 유리 보편적 인 병에 BHI 10 ml의 분취 량을 추가합니다.
- 소독, 15 psi의 20 분 동안, 또는 오토 클레이브 제조업체의 권장 사항에 따라 121 ° C에서 BHI 국물을 압력솥.
참고 : 국물 AUT 같은 배치에서 유래 분석에 사용 된 모든 국물 확인결과의 변동을 초래할 수 영양소 변화를 제한하는 동시에 oclaved.
3. 준비 멸균 기화기 병 (의)
- vapourizer 병을 해체.
- 내부 오염 물질을 제거 밤새 5 % 표면 활성 세정제에 vapourizer 병, 뚜껑과 vapourizer을 흡수하기 위해 vapourizer을 통해 5 %의 표면 활성 세정제 스프레이.
참고 : 표면 활성 세정제를 처리 할 때 장갑과 적절한 개인 보호 장비를 사용해야합니다. - 살균 공기 흐름 후드 아래 기화기, 뚜껑과 병을 건조.
- 70 % 에탄올로 병을 채우기 vapourizer를 다시 연결하고 vapourizer을 통해 에탄올의 일부를 스프레이.
- 기화기에 뚜껑을 넣고 사용할 때까지 내부의 에탄올로 저장합니다.
- 무균 사용 멸균 BHI 국물와 병을 세척하고 vapourizer를 통해 국물을 살포하기 직전.
주 :이 에탄올 AFF 방지6.3 절에서 병에 추가 접종을 돌출 한 칼라.
세균 숙박 문화를 준비 4. (들)
- 킬 선수와 균주 억제제 멸균 BHI 한천 플레이트 상 및 약 18 시간 (야간)에 대한 호기 37 ° C에서 품어.
참고 :이 판은 4 ° C에서 저장 될 때 같은 주 내에서 여러 복제에 사용할 수있는 박테리아의 재고를 생성합니다. - 28 ㎖의 만능 병 내의 필요한 경쟁자 박테리아 균주의 단일 콜로니로 멸균 BHI 배지 10 ㎖를 접종한다.
- 궤도 통에 250 rpm으로 흔들어 기적 밤새 37 ° C에서의 보편적 인 병을 품어.
억제제 생산 격리 5. 스팟 문화
- 제 4 항에 기재된 바와 같이 밤새 배양 (들)을 준비한다.
- 한천 플레이트 뚜껑에 결로와 완전히 건조 확인, 접종 전에 (PLA를 배양하여 예37 ° C에서 60 분)에 대한 테; 이 접종 사이트에서 접시에 걸쳐 확산 접종을 방지 할 수 있습니다.
- 피펫 한천 플레이트의 중심 상에 하룻밤 문화의 25 μL. 완전히 한천 배양에 걸쳐 분무 공기 방울을 방지하기 위해 플런저 피펫 누름 피한다.
- 문화의 확산을 제한하는 문화가 실온에서 건조하도록 허용합니다. 기적 밤새 37 ° C에서 한천 플레이트를 품어.
6. 준비 시험 경쟁자 스트레인의 스프레이 접종 (들)
- 약 4 × 106 CFU ml의 -1 산출하기 BHI 국물에 부 (4) 희석에서 하룻밤 문화 10 배 바와 같이, 하룻밤 문화를 준비하고, OD 600 0.3 ± 0.05의 현탁액.
참고 : 10 배 희석은 4 × 106 CFU ml의 -1 모든 박테리아 종을 제공 1 × 10 사이에 시리얼 희석 도금 확산하여 필요한 희석 계수를 계산하지 않습니다 - 멸균 플라스틱 향수 기화기 병에 희석 문화를 따르십시오.
참고 : 전체 볼륨 한천 플레이트의 수는 스프레이를 위해 필요 이상으로해야합니다. 약 접시 당 250 μL는 9cm 직경 페트리 접시에 적합합니다.
7. 이연 성장 억제 분석
- 문화가 이전 한천에 스프레이로 분무 장치에로드 될 수 있도록 기화기 병의 각을 통해 문화를 스프레이.
- 한천 위 약 15 cm의 거리에서, 전체 한천 표면에 희석 문화의 약 250 μL (일반 50 ㎖ 기화기의 3 스프레이)를 스프레이. 기적 밤새 37 ° C에서 한천 플레이트를 품어. 스프레이 같은 수의 다른 판을 반복합니다.
8. 이연 성장 저해 분석 결과 해석
- 용사 competi의 성장 억제 영역을 측정토르 변형 (그림 1A - C, "X" "X"로) (- C, "Y"를 "Y"그림 1A) 억제제 제작자의 중앙 지점의 직경을 뺀 밀리미터.
참고 : 그림 1E는이 데이터가 제공 될 수있는 방법을 보여줍니다 - 억제의 영역에 대한 선명도 점수를 기록합니다.
참고 :이 관찰 된 억제의 정도를 나타냅니다. 예는도 1a에 도시되어있다 - D, 표준화에 사용할 수있는 균주는 대표적인 결과 섹션에서 제시된다. 다음 규모는 명확하게 득점에 사용할 수 : 0의 선명도 점수는 경쟁 균주의 성장을 완전히 억제의 영역을 설명하기 위해. 1의 점수는 비운의 영역에 존재하는 개별 식민지로, 성장의 거의 완전한 억제의 영역을 설명합니다. (2)의 점수가 감소 성장의 가시 영역을 설명하기 위해,이 영역 내에서 성장은 사기꾼이다유창한 또는 합류 근처에 있지만,> 50 % 농도 감소. 3의 점수를 최소한의 성장 감소를 설명하기 위해, 성장 합류하고 50 % 이하로 감소되고, 영역이 계속 표시하고 측정한다. 4의 점수는 성장의 가시적 억제을 설명 없습니다. 5의 점수는 경쟁자 균주의 성장은 테스트 억제제 생산 균주의 근방에서 증가되었음을 설명한다. 예를 그림 1을 참조하십시오. 이 점수는 실험자에 주관적이다.
9. 복제합니다
- 생물학적 중으로 적어도 반복 분석은 얻은 결과의 재현성을 결정한다.
참고 : 복제는 다른 일을 수행하는 경우, 측정을 4 ℃에서 후, 배양에서 제거 후 즉시 중 저장 판을 판 점수하거나 폐기하기 전에 판의 높은 품질의 사진을 찍을. 저장 또는 판의 사진이 다른 일 사이의 결과를 쉽게 비교할 수 있도록, t자신은 일 / 실험을 통해 재현 점수를 확인하는 특히 중요하다. 판의 저장 결과를 바꿀 수있는 잠재력을 가지고 있음을 유의하십시오.
참고 : 명확한 사진 장소 플레이트를 들어 수직 확산 된 빛의 영역에 무광택 검정색 배경에 자신의 뚜껑없이, 가까운 렌즈 (매크로 모드)에 개체에 초점을 할 수있는 고해상도 카메라 (≥8 MP)를 사용합니다. 대안으로, 백색 광으로 설정 트랜스 일루미네이터 일부 겔 이미 저들은 고품질, 재현성이 높은 화상을 형성 할 수있다.
Representative Results
분석 결과는 중앙에서 발견 억제제 생산 균주 (그림 1) 근처 오버레이 경쟁 변형의 차이로 관찰해야한다. 이러한 차이는 완전한 억제 (도 1A)의 부분 억제 (도 1B 및 1C)없이 억제 (도 1D) 또는 양의 관계로 해석 될 수있다. 널리 사용 가능한 실험실 S. 종자 표피 Tü3298 및 S. 표피 Rp62A 및 S. 표피 Rp62A 및 S. 구균 뉴먼은 각각도 1B와 1D에 사용되었다. 우리는이 균주는이 프로토콜을 테스트하는 데 사용할 수 있음을 시사한다.
시험 종에 따라, 전체 억제 및 부분 억제 가능성이 가장 높은 항균 펩타이드 항생제 또는 다른 확산 성장 inhibito의 결과억제제 생산 균주에 의해 생산 RS. 부분 억제는 또한 억제제 변형 (6)에 의한 경쟁 흡수하기 때문에 변형 또는 영양소의 금속 이온 봉쇄에 대한 감소 영양 가용성에 연결되어 있습니다.
동일한 경쟁 균주에 대해 테스트 상이한 억제제 생산 균주 사이에 억제 영역의 크기의 비교가 다음 중 어느 하나의 차이를 나타낸다 : 억제제 생산 균주에 의해 생성 된 미생물의 양; 매체를 통해 확산 억제제의 능력; 억제제의 종류 및 제조 억제제 참가자 균주의 저항 레벨이 생성된다. 동일한 억제제 생산 균주에 대해 테스트 다른 균주 사이의 경쟁 저해 영역의 크기를 비교 억제제 생산되기 라이벌 균주의 저항 레벨을 나타낸다.
박테리아의 일관성 애플리케이션 발생한 경우 플레이트에 사용되어서는 안된다. 예를 들어, 경쟁 시험 배양 너무 경우 저해 영역이 크게 나타나는 전형적 (도 2A) 관찰보다 덜 명확하게 정의 된 에지로 희석한다; 이것은 모든 비교 영역 측정 신뢰성에 영향을 미칠 것이다. 억제제 생산 균주의 자리가 완전히 밤새 배양하기 전에 건조되지 않은 경우, 억제제 변형 확산 일반적으로 영역 측정에 영향을뿐만 아니라 선명도 점수에 영향을 미칠 수있는 명확하게 정의 된 지점 (그림 2B)를 형성 할 것으로 예상된다. 경쟁사의 변형 인 경우하지 균등이 박테리아의 요철 확산 (그림 2C)로 이어질 수 분무. 경쟁사의 변형이 너무 집중되어있는 경우가 경쟁 변형이 억제 변형 (그림 2C) 위에 성장 수있다, 극단적 인 경우에이 경쟁 / 억제제 변형 역할의 일부 반전으로 이어질 수 있습니다.
그림 1. 성장 저해 지연된 성장 억제 분석으로부터 얻을 수있다 정량적 결과의 범위 결과 (A) 전체 금지 범위 (0의 점수), (B) 부분 억제 (1 점) (D) 없음 억제 (4 점) 내지 (C) 부분 억제 (2 점). 라벨 (Y) 억제제 균주의 성장을 억제 가장자리의 최 외측 에지를 나타내는영역 (X). (A)에 촬영 된 플레이트에 대한 측정을 보여준다 (E)에 도시 된 바와 같이, 0mm에서 10mm 이하로 억제 범위의 영역의 크기는, B, C 및 D. 결과 최근 포도상 구균 균주 (A에 대해 도시 , C) 또는 일반적인 실험실 포도상 구균은 S.는 분리 표피 Tü3298 (억제제)와 S. 표피 Rp62A (경쟁자) (B), 및 S. 표피 Rp62A (억제제)와 S. 구균 뉴먼 (경쟁) (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 빈약 한 기술에 일치하지 않는 결과의 예 결과 경우 예상보다 다르게 나타날 수 있습니다 (A. (B) 억제제 균주 배양 / 판 전에 완전히 건조하지 않았다 건조 또는 (C)하지 않았다. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.
Discussion
다른 사람을 구별이 박테리아 종 대회 프로토콜의 중요한 단계는 억제제의 하룻밤 배양은 경쟁 분리를 첨가하기 전에 분리합니다. 억제제의 변형이 억제 화합물을 생산하는이 성장 기간을 필요로한다. 선수 변형이 동일한 매체 위에 중첩 된 바와 같이,이 방법은 모든 가능성을 관찰하는 연구를 할 수 있습니다 억제제 계통의 경쟁 균주의 성장을 방해합니다. 결과적으로, 이러한 분석은 자연 발생하는 반사; 하나의 분리가 완전히 틈새에 설정되고, 다른 성공적 틈새를 침투 할 수있는 억제 변수를 상쇄 할 수 있어야한다.
잘못 수행 한 경우 잘못된 결과가 발생할 가능성이 가장 높은이 프로토콜에 두 부분이 있습니다. 우선, 기화기 병 불완전 멸균 분석에 세균 오염을 도입 할 수있다. 인큐무균 용기의 단계 3.6에서 증발기 병 린스 사용 브로스 bation 완전히 살균 된 병을 확인하는데 사용될 수있다. 추가 살균이 필요한 경우 등 Virkon 같은 소독제 솔루션에 추가 세척은, 단계 3.2에 설명 된 표면 활성 세정제의 세척, 이전에 사용할 수 있습니다.
잘못된 결과가 발생할 수 있습니다 두 번째 단계는 경쟁 변형 (단계 6.1)의 희석이다. 희석이 최적이 아닌 경우, 억제의 명확한 측정은 쉽게 결정되지 않을 수 있습니다. 이 분석은 억제제 생산 S. 대 그람 - 양성 및 그람 - 음성 종의 넓은 범위에 걸쳐 균주 등의 다양한 코 균주를 사용하여 최적화되었다 선수 변형 7,8 등 구균 SH1000. 그것은 이후 경쟁 및 억제제 생산 균주 등 다양한-아굴라 부정적인와 아굴라 양성 포도상 구균을 사용하여 테스트되었습니다. 경쟁자로서 상기 이외의 속을 테스트 할 때변형, 접종에 대한 희석의 일부 최적화가 필요할 수 있습니다.
명확성 점수 반복 사이에서 크게 다를 경우, 특정 광학 밀도로 설정하여 경쟁 균주 접종을 표준화 할 필요가있을 수도있다. 그러나, 이것은 분석이 설정 취하고,이 실험에 따라 처리 할 수있다 변형의 수를 감소 할 가능성이있는 시간을 증가시킬 것이다. 시각적 신속한 대안을 제공 할 수있다 맥팔랜드 표준을 사용하여 적절한 OD로 배양을 조정.
이 기술의 한 가지 제한은 단지 박테리아 배양에 적용될 수 있다는 것이있다. 많은 연구 경쟁력 제외 상호 작용 3,4,13을 예측하기 16S rRNA의 염기 서열을 사용하는 이유입니다. 그러나, 유전 및 군 유전체학 기술은 종 수준으로 지역 사회 구성원을 구별 할 수 및 / 또는 특정 종자 간 특성의 변화를 설명하지 않습니다. particul의 연결을 선별 할 수있다박테리아 종 (5)의 유무와 특성을 인코딩 AR 유전자 그러나 이것은 종의 배제와 관련 될 가능성이 유전자의 사전 지식을 필요로한다.
이 기술의 안전 고려 사항은 박테리아의 에어로졸 생성으로 인해, 그것은 단지 레벨 2 안전 캐비닛과 함께 실험실에서 사용 또는 유사한 안전주의 사항과 함께 할 수 있다는 것입니다. 종자 간 특성의 변화를 설명하고 박테리아의 에어로졸을 생성하지 않는 균주 간의 경쟁을 테스트하는 다른 방법이 있습니다. 하나의 이러한 방법은 동시 길항 작용 분석법이있다. 이 방법에서는 하나의 분리의 접종은 한천 판에 확산되어, 제 1 건조되면 두 번째 분리 접종은 상단에 발견이나 칼에 찔린된다. 이 모두 억제 화합물을 생성 및 최초의 영양분을 소기하기 위해 경쟁 균주가 직접적인 경쟁 (동시 길항)에 환경을 생성합니다. advantag동시 길항 작용 분석을 통해 이연 성장 억제 분석의 전자는 억제제의 분리는 항상 완전 경쟁 분리의 침공하기 전에 설립되고의 경쟁 우위를 가지고 있어야한다는 것입니다. 또 다른 변형이 아니라 두 개의 분리가 동시에 8에 추가되지 않고, 추가되기 전에, 하나의 분리가 설립됩니다 대부분의 틈새에서와 같이이 환경에 무슨 일이 일어날 지 더 반사입니다.
또 다른 대안은 부어보다는 억제제의 분리에 분무 할 수있는 최고 한천에서 분리 선수를 추가하는 것입니다 박테리아의 에어로졸 발생을 방지 할 수 있습니다. 그러나, 톱 아가 추가의 체적은 플레이트에도 적용을 위해 약 3 ㎖가 될 필요가있다. 이 볼륨 내에서 경쟁의 분리는 억제제의 분리와 같은 미디어에 성장하지 않을 것이다, 그래서 감소 영양분으로 고생하지 않을 것입니다. 선수는 모든 UNT 억제 화합물과 직접 접촉하지 않을위원장은 상단 한천으로 확산. 이러한 분석은 연기 억제 또는 동시 길항 작용으로 설명 할 수 없습니다.
유사한 방법을 이전 임상 S. 사이 바시 트라 신 내성의 수준을 평가하기 위해 사용되어왔다 구균은 10를 분리합니다. (10)에 의해 기술 된 여기에 설명 된 프로토콜과 그 사이의 가장 큰 차이점은, 같은 민감한 (0 점수 inhibition- 선명도를 완료) 또는 저항 후자 만 분류 경쟁 균주이다 (더 inhibition- 선명도 부분 1-5 점수). 지연된 성장 억제 분석은 따라서 또한 다 약제 내성 병원균에 대해 활성 신규 항생제를 검색하더라도 특정 항균제 또는 생산자에 대한 내성 수준을 스크리닝하는데 사용될 수있다.
숙주 미생물이 세균 커뮤니티 (9)의 바람직하지 않은 멤버를 제거하기 위해 조작 될 수 있다고 제안되었다. 코리 네형 또는 포도상 구균의 응용 프로그램ylococcus 표피 이미 S.을 제거하는 것으로 나타났다 인구 11, 12의 상당한 부분에서 콧 구멍에 균 집락. 경쟁력있는 등 여기에 설명 된 것과 같은 기술을 통해 호스트 식물의 바람직하지 않은 회원을 제외 할 수 있습니다 특정 균주에 대한 연구는 따라서 미래의 치료제가 발생할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
JCM은 유니레버 PLC를 (BB / L023040 / 1)와 함께 BBSRC-IPA 수상에 의해 투자된다. 현대차는 고등 교육 박사 과정 재학의 사우디 아라비아 정부에 의해 자금을 지원한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
| agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Plastic perfume vaporizer | not known | - | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
| Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (~280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
| Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |
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