Uppskjuten Growth Inhibition Assay att kvantifiera effekten av bakterie härledda Antimicrobials om konkurrens

Protocol

Följande metod är anpassad ^7,8 för att testa konkurrent stammar med stammar inhibitor-producerande.

OBS: Detta protokoll innebär aerosolbildning med bakteriekulturer. Detta kan endast utföras i en innesluten plats med genomförandet av lokalt godkända säkerhetsöverväganden. Sprutning av kulturen på agarplattorna i en nivå två säkerhetsbänk kommer att minimera kontaminering av agarplattorna och den omgivande miljön. Detta kommer också att skydda forskaren från aerosol inandning av de sprutade bakterier, är detta ett stort problem om forskaren använder skyddsnivå 2 organismer. Lämplig personlig skyddsutrustning skall bäras. Området kring petriskål är bäst täckt med absorberande engångs vävnad. Post-sprut sanering med hjälp av UV-ljus rekommenderas.

1. Förbereda agarplattorna

1. Förbereda hjärna-hjärta-infusion (BHI) agar i enlighet med den manukarens instruktioner.
2. Autoklavera BHI-agar vid 121 ° C, 15 psi under 20 minuter, eller enligt autoklav tillverkarens rekommendationer för att sterilisera.
3. Häll 15 ml alikvoter av steriliserad BHI-agar till sterila petriskålar och låta den stelna.
   OBS: Se till varje agarplatta som ska användas i analysen kommer från samma lager av agar och att det är samma mängd agar i varje platta. Detta begränsar variationen i tillgängliga näringsämnen och inhibitor diffusion mellan plattorna tillåter jämförbarhet.

2. Förberedelse Sterilt Broth

1. Förbered BHI buljong i enlighet med tillverkarens instruktioner.
2. Tillsätt 10 ml alikvoter av BHI till 28 ml glas universella flaskor.
3. Autoklavera BHI buljong vid 121 ° C, 15 psi under 20 minuter, eller enligt autoklav tillverkarens rekommendationer för att sterilisera.
   OBS: Se till att alla buljong som används i analysen kommer från samma parti buljong autoclaved samtidigt för att begränsa variationen i näringsämnen som kan orsaka variation i resultaten.

3. Förbereda Sterila Vaporizer Bottle (s)

1. Demon förångaren flaskan.
2. Spray 5% ytaktivt rengöringsmedel genom förångaren för att eliminera interna föroreningar, blöt förångaren flaska, lock och förångaren i 5% ytaktivt rengöringsmedel natten.
   OBS: Handskar och lämplig personlig skyddsutrustning ska användas vid hantering av ytaktivt rengöringsmedel.
3. Torka förångaren, locket och flaskor under steril luft flöde huva.
4. Fyll flaskan med 70% etanol, sätt tillbaka förångaren och spraya några av etanolen genom förångaren.
5. Sätt på locket på förångaren och lagra med etanolen inne fram till användning.
6. Omedelbart före användning, aseptiskt skölja flaskan med sterilt BHI buljong och spraya buljongen genom förångaren.
   OBS: Detta förhindrar etanol affecting inokulatet tillsätts till flaskan i avsnitt 6.3.

4. Förbereda Bacterial natten kultur (s)

1. Strimma den tävlande och inhibitor-stammar på en steril BHI-agarplatta och inkubera vid 37 ° C aerobt under ca 18 h (över natten).
   OBS: Denna platta ger ett lager av bakterier som kan användas för flera replikat inom samma vecka vid förvaring vid 4 ° C.
2. Inokulera 10 ml steril BHI-buljong med en enda koloni av den erforderliga konkurrenten bakteriestammen inom en 28 ml universalflaska.
3. Inkubera det universella flaska vid 37 ° C aerobiskt över natten genom skakning vid 250 rpm i en orbitalskak.

5. Spot kultur av inhibitor-producerande Isolera

1. Förbered natten kultur (er) som beskrivs i avsnitt 4.
2. Se till agarplattor är helt torr, med ingen kondens på locket, före ympning (t.ex. genom inkubation plate under 60 min vid 37 ° C); Detta hindrar ympen från att sprida sig över plattan från ympning platsen.
3. Pipettera 25 | il av den över natten odlade kulturen har laddats in i centrum av agarplattorna. Undvik helt deprimerande pipetten kolven för att förhindra luftbubblor som sprutar kulturen över agar.
4. Tillåta odlingen att torka vid rumstemperatur för att begränsa spridningen av kulturen. Inkubera agarplattorna vid 37 ° C aerobiskt över natten.

6. Förbereda Spray Inokulat av test Konkurrent Strain (s)

1. Förbered natten kulturen som beskrivs i avsnitt 4. Späd natten kultur 10 gånger i BHI-buljong till att ge cirka 4 x 10 ⁶ CFU ml ^-1, och en suspension av OD ₆₀₀ 0,3 ± 0,05.
   OBS: En 10-faldig utspädning kommer inte att ge 4 x 10 ⁶ CFU ml ^-1 för alla bakteriearter, beräkna den nödvändiga utspädningsfaktorn genom spridning plätering serieutspädningar mellan 1 x 10 -6.
2. Häll den utspädda kulturen i en steril plastparfym förångare flaska.
   OBS: Den totala volymen måste vara mer än som är nödvändigt för det antal agarplattor som sprutas. Approximativt 250 | il per platta är lämplig för en 9 cm diameter Petri-skål.

7. uppskjuten tillväxt-inhibitionsanalys

1. Spraya kulturen genom var och en av förångarens flaskor för att säkerställa att kulturen är laddad i sprutmekanismen före sprutning på agar.
2. Från ett avstånd på ca 15 cm ovanför agar, spraya cirka 250 pl utspädd kultur (3 sprayer av en typisk 50 ml förångare) över hela agarytan. Inkubera agarplattorna vid 37 ° C aerobiskt över natten. Upprepa för andra plattor med samma antal sprayer.

8. Tolkning uppskjuten tillväxt-inhibitionsanalys-resultat

1. Mäta tillväxthämningszonen av den sprutade konkurtor stam (Figur 1A - C, "X" till "X") i millimeter, subtrahera diametern på den centrala platsen av inhibitor-producent (Figur 1A - C, "Y" till "Y").
   OBS: Figur 1E visar hur dessa data kan presenteras
2. Spela klarhet betyget för hämningszoner.
   OBS: Detta indikerar graden av inhibition observerades. Exempel visas i figur 1A - D, stammar som kan användas för standardisering föreslås i resultaten avsnitt ombudet. Följande skala kan användas för tydlighets skull scoring: en tydlighet poäng av 0 för att beskriva en zon med fullständig inhibering av konkurrentens stammens tillväxt. En poäng på 1 för att beskriva en zon med nästan fullständig inhibering av tillväxt, med endast individuella kolonier som förekommer i zon av clearing. En poäng på två för att beskriva en synlig zon med minskad tillväxt, är tillväxten inom denna zon conflytande eller nära sammanflytande men minskade i densitet av> 50%. En poäng på 3 för att beskriva endast minimal minskning tillväxt, är tillväxten sammanhängande och minskat med mindre än 50%, är en zon fortfarande synliga och mätbara. En poäng på 4 för att beskriva någon synlig hämning av tillväxt. En poäng på 5 för att beskriva att tillväxten av den tävlande stammen ökades i närheten av test inhibitor-producerande stam. Se figur 1 för exempel. Dessa värderingar är subjektiva till försöksledaren.

9. Replikat

1. Upprepade analyser åtminstone i biologisk tre exemplar för att bestämma reproducerbarhet av resultaten.
   OBS: Om replikat utförs på olika dagar, ta mätningar och göra plattorna omedelbart efter avlägsnande från inkubation, då antingen lagra plattorna vid 4 ° C eller ta högkvalitativa fotografier av plattor innan du slänger dem. Lagring eller fotografier av plattor gör det lätt att jämföra resultaten mellan olika dagar, thans är särskilt viktigt för att bekräfta reproducerbar poäng över dagar / experiment. Var medveten om att lagring av plattorna har potential att förändra resultat.
   OBS: För tydliga fotografier plats plattor upprätt utan deras lock på en matt svart bakgrund i ett område med diffust ljus, använder en kamera med hög upplösning (≥8 MP) förmåga att fokusera på objekt nära linsen (makroläge). Alternativt kan en del gel kameror med transbelysnings inställd på vitt ljus av hög kvalitet, mycket reproducerbara bilder.

Representative Results

Analysresultaten ska vara observerbara som en skillnad i den överlagrade konkurrenten stammen nära den centralt prickiga inhibitor-stam (Figur 1). Dessa skillnader kan tolkas som full inhibering (figur 1 A), partiell hämning (Figur 1B och 1C), ingen hämning (figur 1D) eller positiv association. Den allmänt tillgängliga lab stammar S. epidermidis Tü3298 och S. epidermidis Rp62A, och S. epidermidis Rp62A och S. aureus Newman användes i figurerna 1B och 1D respektive. Vi föreslår att dessa stammar kunde användas för att testa detta protokoll.

Beroende på art testade fullständig hämning och partiell hämning är troligen ett resultat av antimikrobiella peptider, antibiotika eller andra diffunderbart tillväxt inhibitors produceras av inhibitor-producerande stammen. Partiell hämning har också kopplats till minskad närings tillgänglighet för konkurrenten svårigheter till följd av upptag eller inneslutning av näringsämnen från hämmaren stammen ^6.

Jämförelse av storleken på inhibitionszonen mellan olika hämmarproducerande isolat testas mot samma konkurrent stam indikerar skillnader i något av följande: mängden antimikrobiellt medel som produceras av inhibitor-producerande stammen; förmågan hos hämmaren att diffundera genom medierna; den typ av inhibitor som produceras och motståndet på konkurrentens stam till inhibitorema som produceras. Jämförelse av storleken på inhibitionszonen mellan olika konkurrent testade stammarna mot samma inhibitor-producerande stam är indikativ för de motståndsnivåer hos de konkurrerande stammar till inhibitorn som produceras.

Om inkonsekvent tillämpning av bakterier har skett plattorna inte bör användas. Till exempel, om testet konkurrenten kultur är alltför utspädd inhibitionszonen visas större och med en mindre tydligt definierad kant än normalt observeras (Figur 2A); detta skulle påverka tillförlitligheten hos de jämförande mätningar zon. Om inhibitor-producerande stammen plats inte var helt torkas innan inkubation över natten, kommer sannolikt att sprida och inte bildar en klart definierad plats (figur 2B), som normalt påverkar zon mätningar, men kan också påverka tydligheten poäng stammen hämmare. Om konkurrenten stammen ärinte besprutas jämnt detta kan leda till en ojämn spridning av bakterier (figur 2C). Om deltagaren stammen alltför koncentrerad det är möjligt att konkurrenten stammen kan växa på toppen av inhibitorn stam (figur 2C), i extrema fall kan detta leda till en viss inversion av konkurrent / inhibitor-stam roller.

Figur 1:. Utbudet av kvalitativa och kvantitativa resultat som kan erhållas från den uppskjutna tillväxthämning analysresultat för tillväxthämning kan variera från (A) fullständig inhibering (0 poäng), (B) partiell hämning (poäng 1) , (C) partiell hämning (poäng av 2) till (D) ingen hämning (poäng av 4). Etiketter indikerar kanterna av tillväxt av stammar hämmaren (Y) och den yttersta kanten av hämningenzoner (X). Storleken på inhibitionszonen sträcker sig från 0 mm till mer än 10 mm, såsom visas i (E), som visar mätningarna för plattorna som fotograferas i A, B, C och D. Resultat visas för senaste stafylokock isolat (A , C) eller gemensamt lab stafylokock-isolat S. epidermidis Tü3298 (hämmare) och S. epidermidis Rp62A (konkurrent) (B), och S. epidermidis Rp62A (hämmare) och S. aureus Newman (konkurrent) (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Exempel på inkonsekventa resultat på grund av dålig teknik Resultaten kan se annorlunda ut om än förväntat (A. (B) hämmare stammen var inte helt torr innan inkubation / plattorna var inte torr eller (C) om den tävlande stammen inte sprayades jämnt och alltför koncentrerad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Ett kritiskt steg i denna bakteriearter konkurrens protokoll som skiljer den från andra, är den natten inkubation av inhibitor isolera före tillsats av konkurrentens isolat. Stammen hämmare kräver denna tillväxtperiod för att producera hämmande föreningar. Som den tävlande stammen överlagras ovanpå samma medium medger denna metod att forskaren att observera den fulla potentialen av stammen inhibitorn att störa tillväxten av konkurrent-stammen. Som ett resultat, reflekterar denna analys vad som händer med naturen; ett isolat är fullt etablerad i en nisch, och andra måste kunna motverka eventuella hämmande variabler för att kunna framgångsrikt invadera nisch.

Det finns två delar i detta protokoll som är mest sannolika att orsaka felaktiga resultat om de utförs felaktigt. För det första kan ofullständig sterilisering av förångaren flaskor införa kontaminerande bakterier in analysen. Incubation av buljongen användes för att skölja förångaren flaskan i steg 3,6 i en steril kärl kan användas för att bekräfta flaskorna helt steriliseras. Ytterligare tvättar i desinficerande lösningar, såsom Virkon kan användas innan tvätten i ytaktivt rengöringsmedel, som beskrivs i steg 3,2, om ytterligare sterilisering krävs.

Ett andra steg som kan leda till felaktiga resultat är utspädningen av den tävlande stammen (steg 6,1). Om utspädnings inte är optimal, tydliga mätningar av hämning kan inte lätt bestämmas. Denna analys optimerades med hjälp av olika nasala isolat som inhibitor-producerande stammar över ett brett spektrum av grampositiva och gramnegativa arter jämfört med S. aureus SH1000 som konkurrenten stammen ^7,8. Det har därefter testats med olika koagulasnegativa negativa och koagulaspositiva stafylokocker som konkurrent och stammar inhibitor-producerande. Vid testning av andra än de som beskrivs ovan som konkurrenten släktenstammen, kan en viss optimering av utspädningen för inokulatet vara nödvändig.

Om klarhet poäng varierar kraftigt mellan upprepningarna, kan det vara nödvändigt att standardisera konkurrenten stammen inokulatet genom att ställa in en specifik optisk densitet. Detta kommer dock att öka den tid analysen tar att ställa upp, och kommer sannolikt att minska antalet stammar är det möjligt att bearbeta per experiment. Visuellt justera kulturen till en lämplig OD med hjälp av en McFarland standard kan ge en snabb alternativ.

En begränsning med denna teknik är att det endast kan tillämpas på odlingsbara bakterier. Det är därför många studier använder 16S rRNA-sekvensering för att förutsäga konkurrenskraftiga uteslutnings interaktioner ^3,4,13. Däremot kan genetiska och metagenomic tekniker endast skilja samhällsmedlemmar till artnivå och / eller tar inte hänsyn till särskilt inomarts egenskap variation. Det är möjligt att screena för föreningen av en particular gen som kodar för ett drag med närvaron eller frånvaron av en bakterieart ^5, men detta förutsätter förkunskaper av en gen sannolikt att förknippas med uteslutning av en art.

En säkerhets övervägande av denna teknik är att, på grund av alstrandet av bakterier aerosol, det kan endast användas i laboratorier med en nivå två säkerhetsbänk, eller med liknande säkerhetsåtgärder. Det finns alternativa metoder för att testa för konkurrens mellan isolat som står för intraspecifika drag variation och inte genererar aerosoler av bakterier. En sådan metod är den samtidiga antagonism-analysen ^2. I denna metod, är ett inokulum av ett isolat spreds på en agarplatta, och ett andra isolat inokulatet spotted eller hackat ovanpå när den första har torkat. Detta skulle ge en miljö där stammarna är i direkt konkurrens (samtidig antagonism), båda tävlar om att producera hämmande föreningar och rensar näringsämnen först. den advantage av den uppskjutna tillväxtinhibitionsanalys över den samtidiga antagonism-analysen är att hämmaren isolat alltid ska ha konkurrensfördelar av att vara fullt etablerad före invasionen av konkurrentens isolat. Detta är mer reflekterande av vad som skulle hända i miljön, som i de flesta nischer, kommer ett isolat fastställas innan en annan stam tillsätts i stället för två isolat läggs samtidigt ^8.

Ett annat alternativ för att undvika aerosolbildning av bakterier skulle vara att lägga den tävlande isolera i toppagar, vilket kan hällas i stället sprutas över inhibitorn isolatet. Skulle emellertid volymen av toppagar tillsätts måste vara ca 3 ml för att säkerställa jämn täckning av plattan. Inom denna volym skulle konkurrent isolat inte växer på samma media som hämmaren isolat, så skulle inte drabbas av minskade näringsämnen. Den tävlande skulle heller inte vara i direkt kontakt med eventuella inhiberande föreningarna until de sprids i den övre agar. En sådan analys kan inte beskrivas som uppskjuten hämning eller samtidig antagonism.

En liknande metod har tidigare använts för att bedöma nivåerna av bacitracin motstånd bland kliniska S. aureus-isolat ^10. Den största skillnaden mellan det protokoll som beskrivs här och som beskrivs av ^10, är den senare bara klassificerade konkurrent stammar som känsliga (komplett inhibition- klarhet poäng 0) eller resistenta (partiell eller ingen inhibition- klarhet poäng 1-5). Den uppskjutna tillväxtinhibitionsanalys kan därför också användas för att screena för nivåer av resistens mot producenter av vissa antimikrobiella medel, eller till och med för att söka efter nya antimikrobiella medel verksamma mot multiresistenta patogener.

Det har föreslagits att värdmikrofloran kunde manipuleras för att eliminera icke önskvärda medlemmar av den bakteriella gemenskap ^9. Tillämpning av Corynebacteria eller Staphylococcus epidermidis har redan visat sig eliminera S. aureus kolonisering i näsborrarna i en betydande andel av befolkningen ^11,12. Studier specifika stammar som konkurrenskraftigt kan utesluta oönskade medlemmar i värd flora, genom tekniker såsom den som beskrivs här, kan därför leda till framtida läkemedel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain heart infusion broth	Lab M	lab049	rich general purpose media
agar-agar	Merck Milipore	101614
Petri dishes	Sarstedt	82.1473.001
Plastic perfume vaporizer	not known	-	10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket
Universal bottles		no longer in production, alternative SLS BOT5006	28 ml glass cylindrical bottle (~280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap
Decon 90	Decon		surface active cleaning agent