Utsatt Vekst Hemningsmetoden å tallfeste effekten av bakterier-avledet antimicrobials på Competition

Protocol

Følgende metode er innrettet til ^7,8 for å teste konkurrerende stammer med inhibitor-produserende stammer.

MERK: Denne protokollen innebærer aerosol generasjon med bakteriekulturer. Dette kan bare gjøres i en inneholdt plass med gjennomføring av lokalt godkjente vernehensyn. Sprøyting av kulturen på agarplatene innenfor et nivå to sikkerhetskabinett vil minimalisere kontaminering av agarplatene og det omkringliggende miljø. Dette vil også beskytte forskeren fra aerosol innånding av sprøytet bakterier, er dette et stort problem hvis forskeren er inneslutningsnivå ved hjelp av 2 organismer. Egnet personlig verneutstyr må brukes. Området rundt petriskål er best dekket med absorberende engangs vev. Post-spray dekontaminering ved hjelp av UV-lys anbefales.

1. Klar Agarplatene

1. Forbered hjerne hjerte infusjon (BHI) agar i henhold til manufabrikantens anvisninger.
2. Autoklaver BHI agar ved 121 ° C, 15 psi i 20 min, eller i henhold til autoklav produsentens anbefalinger, for å sterilisere.
3. Hell 15 ml porsjoner av sterilisert BHI agar i sterile petriskåler og la den stivne.
   MERK: Kontroller hver agarplate som skal brukes i den analysen stammer fra det samme lager av agar, og at det er samme mengde agar i hver plate. Dette begrenser variasjonen i tilgjengelige næringsstoffer og hemmer spredning mellom platene slik at sammenlignbarhet.

2. Forbereder Sterile buljong

1. Forbered BHI kraft i henhold til produsentens instruksjoner.
2. Tilsett 10 ml porsjoner av BHI til 28 ml glassflasker universelle.
3. Autoklaver BHI kraft ved 121 ° C, 15 psi i 20 min, eller i henhold til autoklav produsentens anbefalinger, for å sterilisere.
   MERK: Pass på alle kjøttkraft brukes i analysen stammer fra samme parti av kjøttkraft autoclaved samtidig for å begrense variasjoner i næringsstoffer som kan føre til variasjon i resultatene.

3. Forbereder Sterile Fordamper Bottle (s)

1. Demonter vapourizer flasken.
2. Spray 5% overflateaktivt rengjøringsmiddel gjennom vapourizer å eliminere interne forurensninger, suge vapourizer flasken, lokk og vapourizer i 5% overflateaktivt rengjøringsmiddel over natten.
   MERK: Hansker og egnet personlig verneutstyr bør brukes ved håndtering av overflateaktivt rengjøringsmiddel.
3. Tørk fordamper, lokket og flasker under sterile luftstrøm hette.
4. Fylle flasken med 70% etanol, setter vapourizer og spray noe av etanolen gjennom vapourizer.
5. Sett lokket på den fordamper og lagre med etanol inne inntil bruk.
6. Umiddelbart før bruk, aseptisk skylle flasken med sterilt BHI kraft og spray suppen gjennom vapourizer.
   MERK: Dette hindrer etanol affecting inokulum tilsatt til flasken i avsnitt 6.3.

4. Klar Bakteriell Night kultur (s)

1. Streak konkurrenten og hemmer stammer på et sterilt BHI agar plate og inkuberes ved 37 ° C aerobt i ca 18 timer (over natten).
   NB: Denne plate frembringer et lager av bakterier som kan brukes for flere replikater innen samme uke når de lagres ved 4 ° C.
2. Inokulere 10 ml sterilt BHI-substrat med en enkeltkoloni av den nødvendige konkurrenten bakteriestammen i en 28 ml flaske universell.
3. Inkuber den universelle flaske ved 37 ° C natten over aerobt ved risting ved 250 rpm på en orbital-rystemaskin.

5. Spot Culture av inhibitor-produserende Isolate

1. Forbered natten kultur (e) som beskrevet i kapittel 4.
2. Sikre agar plater er helt tørre, uten kondensering på lokket, før inokulering (for eksempel ved inkubering av plate i 60 minutter ved 37 ° C); Dette hindrer inokulum fra å spre seg tvers over platen fra inokuleringen området.
3. Pipetter 25 ul av over natten-kulturen på midten av agarplatene. Unngå helt deprimerende pipetten stempelet for å hindre luftbobler som spray kultur på tvers av agar.
4. Tillate kulturen å tørke ved romtemperatur for å begrense spredningen av kulturen. Inkuber agarskåler ved 37 ° C natten over aerobt.

6. Klar Spray Inokulum av Test konkurrent Strain (s)

1. Forbered natten kultur som beskrevet i kapittel 4. Fortynn natten kultur 10 ganger i BHI kraft for å gi ca 4 x 10 ⁶ CFU ml ^-1, og en suspensjon av OD ₆₀₀ 0,3 ± 0,05.
   MERK: En 10 gangers fortynning vil ikke gi 4 x 10 ⁶ CFU ml ^-1 for alle bakteriearter, beregne nødvendig fortynningsfaktoren ved spredning plating serielle fortynninger mellom 1 x 10 -6.
2. Hell den fortynnede kulturen i en steril plast parfyme fordamper flaske.
   MERK: Det totale volumet må være mer enn det som er nødvendig for antall agarskåler som sprøytes. Omtrent 250 ul per plate er egnet for en 9 cm diameter petriskål.

7. utsatt vekst hemningsmetoden

1. Spray kulturen gjennom hver av fordamper flaskene for å sikre at kulturen er lastet inn i sprøytemekanismen før spraying på agar.
2. Fra en avstand på omtrent 15 cm over agar, spray ca 250 ul av fortynnet kultur (3 spray av en typisk 50 ml fordamper) over hele agaroverflaten. Inkuber agarskåler ved 37 ° C natten over aerobt. Gjenta for andre plater med samme antall spray.

8. Tolke utsatt vekst Hemming analyseresultatene

1. Måle veksthemming sone av den sprøytede konkurransetor belastning (figur 1A - C, "X" til "X") i millimeter, å trekke diameteren til den sentrale flekk av inhibitoren-produsent (figur 1A - C, "Y" til "Y").
   MERK: Figur 1E viser hvordan disse dataene kan presenteres
2. Spill klarhet score for soner av hemming.
   MERK: Dette angir graden av hemming observert. Eksempler er vist i Figur 1A - D, stammer som kan brukes for standardisering er foreslått i den representative resultater delen. Den følgende skala kan benyttes for klarhet scoring: en klarhet score på 0 for å beskrive en sone av fullstendig inhibering av konkurrenten stammen vekst. En score på 1 for å beskrive en sone med nesten fullstendig inhibering av vekst, med bare individuelle kolonier som er tilstede i sonen av clearing. En score på 2 for å beskrive en synlig sone av redusert vekst, vekst innenfor denne sonen er conflytende eller i nærheten av konfluent men redusert i tetthet ved> 50%. En score på 3 for å beskrive bare minimal vekstreduksjon, er vekst konfluent og reduseres med mindre enn 50%, er en sone fremdeles synlige og målbare. En score på 4 for å beskrive noen synlig hemming av vekst. En score på 5 for å beskrive at veksten av konkurrenten stamme ble øket i nærhet av test inhibitor-produserende stamme. Se figur 1 for eksempler. Disse poengsummene er subjektive til eksperimentator.

9. Replikater

1. Gjentatte analyser i det minste i det biologiske tre eksemplarer for å bestemme reproduserbarheten av resultatene som oppnås.
   MERK: Hvis gjentak er utført på ulike dager, ta målinger og scorer plater umiddelbart etter fjerning fra inkubasjon, deretter enten butikk plater ved 4 ° C eller ta høy kvalitet bilder av platene før du kaster dem. Lagring eller fotografier av plater muliggjør enkel sammenligning av resultater mellom ulike dager, thans er spesielt viktig for å bekrefte reproduserbar score over dager / eksperimenter. Vær oppmerksom på at lagring av platene har potensial til å endre resultater.
   MERK: For klare bilder sted plater oppreist uten deres lokk på en matt svart bakgrunn i et område av diffust lys, bruk en høyoppløselig kamera (≥8 MP) i stand til å fokusere på objekter som er nær objektivet (makromodus). Alternativt kan noen gel kameraer med trans-illuminator satt til hvitt lys produsere høy kvalitet, svært reproduserbare bilder.

Representative Results

Analyseresultatene bør være observerbar som en forskjell i overleggs konkurrent belastningen nær sentralt flekket inhibitor-produserende stamme (figur 1). Disse forskjellene kan tolkes som fullstendig hemming (figur 1A), delvis hemming (figur 1B og 1C), ingen hemming (figur 1D) eller positiv sammenheng. Den allment tilgjengelig lab stammer S. epidermidis Tü3298 og S. epidermidis Rp62A, og S. epidermidis Rp62A og S. aureus Newman ble anvendt i figurene 1B og 1D respektivt. Vi foreslår at disse stammer kan brukes for å teste denne protokollen.

Avhengig av art som ble testet, fullstendig hemning og delvis hemning er mest sannsynlig et resultat av antimikrobielle peptider, antibiotika eller andre diffusjonsevne vekst inhibitors produsert av inhibitor-produserende stamme. Delvis inhibering har også vært knyttet til redusert næringsstoffer for det konkurrerende belastning på grunn av opptak eller sekvestrerende av næringsstoffer ved inhibitoren stammen ^6.

Sammenligning av størrelsen av hemningssonen mellom forskjellige inhibitor-produserende isolater ble testet mot samme konkurrenten stammen indikerer forskjeller i noen av de følgende: mengden av antimikrobielle produsert av inhibitor-produserende stamme; muligheten av inhibitoren til å diffundere gjennom media; typen av inhibitor produsert og motstanden av konkurrenten belastning til inhibitorene som produseres. Sammenligning av størrelsen av hemningssonen mellom forskjellige konkurrerende stammene som ble testet mot den samme inhibitor-produserende stamme er en indikasjon på motstands nivåene av de konkurrerende stammer til inhibitor blir produsert.

Hvis det har forekommet inkonsekvent anvendelse av bakterier bør ikke brukes platene. For eksempel, hvis testen konkurrenten kulturen er for tynn hemningssonen vises større og med en mindre klart definert kant enn det som typisk observert (figur 2A); dette vil påvirke påliteligheten av sammenlignende sone målinger. Hvis inhibitoren-produserende stamme sted ikke var fullstendig tørket før inkubering over natten, er inhibitoren stammen sannsynlig å spre seg og ikke danner en klart definert sted (figur 2B), som typisk påvirker sone målinger, men kan også påvirke klarheten scoring. Hvis konkurrenten belastningen erikke sprayes jevnt kan dette føre til en ujevn spredning av bakterier (figur 2C). Hvis konkurrenten belastningen blir for konsentrert er det mulig at den konkurrenten stamme kan vokse på toppen av inhibitoren stammen (figur 2C), og i ekstreme tilfeller kan dette føre til noen inversjon av konkurrent / inhibitor belastnings roller.

Figur 1:. Utvalget av kvalitative og kvantitative resultater som kan oppnås fra den utsatte veksthemmende analyse Resultater for veksthemming kan variere fra (A) fullstendig hemming (score på 0), (B) delvis hemming (score 1) (C) delvis hemming (score på 2) til (D) ingen hemming (score på fire). Etiketter angir kantene av vekst av inhibitoren stammer (Y) og den ytterste kant av hemmingensoner (X). Størrelsen av hemningssonen område fra 0 mm til mer enn 10 mm, som vist i (E), som viser målingene for platene fotografert i A, B, C og D. Resultatene er vist i de senere stafylokokk-isolater (A , C) eller vanlig laboratorie stafylokokk-isolater S. epidermidis Tü3298 (hemmer) og S. epidermidis Rp62A (konkurrent) (B), og S. epidermidis Rp62A (hemmer) og S. aureus Newman (konkurrent) (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Eksempler på inkonsistente resultater på grunn av dårlig teknikk Resultatene kan se annerledes ut enn forventet if (A. (B) hemmer stammen var ikke helt tørr før ruge / plater var ikke tørr eller (C) hvis konkurrent belastningen ikke ble sprøytet jevnt og ble for konsentrert. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Discussion

Et kritisk trinn i denne bakterieart konkurranse protokoll som skiller den fra andre, er inkubering over natten av inhibitoren isolere før tilsetningen av konkurrenten isolatet. Inhibitoren stammen krever denne vekstperioden for å frembringe inhiberende forbindelser. Som konkurrenten belastningen er overlagt på toppen av det samme medium, gir denne metoden forskeren til å observere det fulle potensialet av inhibitoren belastning å påvirke vekst av konkurrenten belastning. Som et resultat, gjenspeiler denne analysen hva som skjer med naturen; ett isolat er fullstendig etablert i en nisje, og den andre må være i stand til å motvirke eventuelle hemmende variabler for å være i stand til å invadere den nisje.

Det er to deler til denne protokollen som er mest sannsynlig føre til feilaktige resultater hvis utført feil. For det første kan ufullstendig sterilisering av fordamper flaskene innføre forurensende bakterier i analysen. Incuvestand av kjøttkraft som brukes til å skylle fordamperen flasken i trinn 3,6 i et sterilt kar kan brukes for å bekrefte flaskene ble helt sterilisert. Ytterligere vaskinger i desinfiserende oppløsninger, for eksempel Virkon, kan anvendes før vaske i overflateaktivt rengjøringsmiddel, som er beskrevet i trinn 3.2, hvis ytterligere sterilisering er nødvendig.

Et annet skritt som kan føre til feilaktige resultater er utvanning av konkurrenten belastning (trinn 6.1). Dersom fortynningen ikke er optimal, klare måling av inhibering kan ikke lett bestemmes. Denne analysen ble optimalisert ved bruk av ulike nasale isolater som inhibitor-produserende stammer over et bredt spekter av Gram-positive og Gram-negative arter versus S. aureus SH1000 som konkurrenten belastningen ^7,8. Den har senere blitt testet ved hjelp av ulike koagulase-negative og koagulase stafylokokker som konkurrent og inhibitor-produserende stammer. Når testing andre enn de som er beskrevet ovenfor som konkurrenten slektenebelastning, kan noen optimalisering av fortynning for pode være nødvendig.

Dersom klarhet score varierer betydelig mellom gjentakelser, kan det være nødvendig å standardisere konkurrent belastningen podestoff ved å sette den til en bestemt optisk tetthet. Dette vil imidlertid øke den tiden målingen tar å sette opp og er egnet til å redusere antall stammer det er mulig å bearbeide per eksperiment. Visuelt justering av kulturen til en passende OD ved hjelp av en McFarland-standard kan tilveiebringe en rask alternativ.

En begrensning med denne teknikken er at den kan bare anvendes for dyrkbare bakterier. Dette er grunnen til at mange studier bruker 16S rRNA sekvensering for å forutsi konkurranseeksklusjons interaksjoner ^3,4,13. Imidlertid kan genetiske og metagenomic teknikker bare skille medlemmer til å artsnivå, og / eller tar ikke hensyn til spesielle intraspesifikk egenskap variasjon. Det er mulig å skjerme for foreningen av en particular gen som koder for en egenskap med tilstedeværelse eller fravær av en bakteriearter ^5, men dette krever pre-kjennskap til et gens sannsynlig å være forbundet med utelukkelse av en art.

En sikkerhets betraktning av denne teknikken er at, på grunn av den aerosol-genereringen av bakterier, det kan bare brukes i laboratorier med en nivå to sikkerhetskabinett, eller med tilsvarende sikkerhetsforholdsregler. Det finnes alternative teknikker for å teste for konkurranse mellom isolater som står for intraspesifikk egenskap variasjon og ikke genererer aerosoler av bakterier. En slik metode er den samtidige antagonisme assay ^2. I denne fremgangsmåten blir et inokulum av ett isolat spredd på en agar plate, og en andre isolat inokulum blir flekket eller stukket på toppen når den først har tørket. Dette vil gi et miljø hvor de stammer er i direkte konkurranse (samtidig antagonisme), begge konkurrerer om å produsere hemmende forbindelser og skatte næringsstoffer først. den advantage av den utsatte veksthemmende analyse over samtidig antagonisme analysen er at den hemmer isolatet skal alltid ha konkurransefortrinn av å være fullt etablert før invasjonen av konkurrenten isolat. Dette er mer reflekterende av hva som ville skje i omgivelsene, som i de fleste nisjer, vil det bli etablert en isolat før en annen belastning er lagt til, i stedet for to isolatene ble tilsatt samtidig ^åtte.

Et annet alternativ for å unngå generering av aerosol bakterier vil være å legge konkurrenten isolere i toppagar, som kan helles i stedet for å sprøytes over inhibitor isolatet. Imidlertid ville volumet av topp-agar tilsatt trenger å være omtrent 3 ml for å sikre jevn dekning av platen. Innenfor dette volumet, vil konkurrenten isolat ikke vokser på de samme mediene som hemmer isolat, så ville ikke lider av redusert næringsstoffer. Konkurrenten vil heller ikke være i direkte kontakt med eventuelle hemmende forbindelser until de diffust inn i toppen agar. En slik analyse ikke kan beskrives som en utsatt hemming eller samtidig antagonisme.

En lignende metode har tidligere vært brukt for å vurdere nivået av bacitracin motstand blant kliniske S. aureus isolater ^10. Den største forskjellen mellom protokollen som er beskrevet her, og som er beskrevet med ^10, er de sistnevnte bare klassifisert konkurrerende stammer som sensitive (komplett inhibition- klarhet 0 poeng) eller resistente (delvis eller ingen inhibition- klarhet scorer 1-5). Den utsatte veksthemmende analyse kan derfor også anvendes for å screene for nivåer av resistens mot produsenter av bestemte antimikrobielle stoffer, eller til å søke etter nye antimikrobielle midler som er aktive mot multilegemiddelresistente patogener.

Det har blitt foreslått at vertsmikroflora kan bli manipulert for å eliminere uønskede medlemmer av bakterie fellesskap ^9. Bruk av corynebacteria eller Staphylococcus epidermidis har allerede blitt vist å eliminere S. aureus kolonisering i svelget i en vesentlig andel av befolkningen ^11,12. Studier i spesifikke stammer som kompetitivt kan utelukke uønskede medlemmer av verts flora, gjennom teknikker som den er beskrevet her, kan derfor føre til fremtidige behandlingsformer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain heart infusion broth	Lab M	lab049	rich general purpose media
agar-agar	Merck Milipore	101614
Petri dishes	Sarstedt	82.1473.001
Plastic perfume vaporizer	not known	-	10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket
Universal bottles		no longer in production, alternative SLS BOT5006	28 ml glass cylindrical bottle (~280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap
Decon 90	Decon		surface active cleaning agent