Introduction
Retinoinsyra (RA) är en metabolit derivat av retinol eller vitamin A och framställs genom sekventiell aktivitet av flera cellulära dehydrogenaser 1. På grund av dess amfifatisk kemiska natur, korsar den lätt lipidmembran och kan fungera som en löslig morfogenetiskt faktor 1. Det är en viktig molekyl som reglerar många utvecklings- och vuxna cellulära processer genom att fungera som en ligand för kärn retinoidreceptorer och aktivera genuttryck 2-10. Utan RA, dessa RA receptorer (RAR) binder Rares i DNA och fungerar som repressorer; RA bindning till dessa receptorer förvandlar dem till transkriptionsaktivatorer resulterar i mål genuttryck 1,5,6.
Även om RA signalväg är väl karakteriserad, den lilla storleken (~ 300 Da) och amfipatiskt natur RA gör direkt histologiska visualisering och mätning av RA för närvarande tekniskt omöjligt 11. Den enda metoden för direct mätning av RA nivåer genom isolering av RA från vävnadsprover med hjälp av högupplösande vätskekromatografi (HPLC) 11. Denna metod kräver normalt stora mängder vävnad, underlättas genom att samla olika prover 12. Således är denna teknik dåligt lämpad för mätning av RA-nivåer i individuella embryon eller små mängder av prov / vävnad.
För att undersöka den cellulära funktionen av RA har flera metoder utvecklats för att indirekt sluta sig till närvaron av RA. Dessa metoder använder sig av rapporteringssystem som innehåller mycket lyhörd RAR-beta SÄLLSYNT driver uttrycket av beta-galaktosidas eller luciferas 11,13,14. Den transgena sällsynta LacZ reporter mus som genereras av Rossant et al. 13 är ett idealiskt system för att visualisera Spatiotemporal regioner i RA signaleringen in situ 11,13,15,16 men är olämpliga för kvantitativa mätningar. F9 sällsynta LacZ cellinje 14, på than andra sidan, är användbar för detektion av RA och kvantitativa mätningar av RA-nivåer i vävnadsexplantat 11,12,14,17,18.
F9 teratokarcinomceller celler uttrycker endogen alfa-, beta- och gamma-retinsyrareceptorerna 19, och initiera differentiering i parietal endoderm efter exponering för RA 19-21. F9-celler har länge varit etablerat som en modell för RA-inducerad celldifferentiering, vilket är varför det valdes som en idealisk cellinje för en RA reporter analys. F9-härledda Sil-15 RA reporter cellinje som genereras av Wagner et al. 14 innehåller en E. coli'LacZ genen nedströms om en kopia av den 64-bp retinsyra-svarselementet (RARE) av den humana beta-retinsyra-receptom (RAR-beta) genen. I syfte att välja och upprätthålla stabila kloner, konstruktionen innehåller också den aminoglykosidfosfotransferas (neo ^) genen som en selekterbar markör i närvaro av G418. Detta konstrukt confers inducerbart uttryck av b-galaktosidas i närvaro av RA, som kan visualiseras genom LacZ-färgning och detta svar kan vara därefter kvantifieras med hjälp av kolorimetriska metoder 11,12,14,18.
Denna extremt mångsidig reporter cellinje har använts i stor utsträckning vid detektion av endogena RA produktionen genom samodling av vävnadsprover med reporterceller, såsom cochlea 17 och embryonala golvplatta explants 14. Dessutom har denna reporter linje använts för kvantifiering av RA-nivåer i den utveckla ryggmärgen genom odling poolade sektioner av embryonala ryggmärg separat och tillsätta konditionerade media från dessa kulturer till F9 RARE-LacZ-celler 18. Kvantifiering utfördes efter LacZ färgning genom kolorimetrisk avläsning med en vanlig ELISA-plattläsare 11,12,18. Slutligen har denna reporter-cellinje använts vid detektion av närvaro av RA metaboliska enzymer genom monitoring förändringar i RA nivåer 12,18.
Här rapporterar vi att känsligheten hos denna reporter cellinje möjliggör också för mätning av RA nivåer som genereras från enskilda samodlade E8.5 embryon. Detta möjliggör en jämförelse mellan enskilda embryon från olika genotyper. Som ett specifikt exempel, är Gpr161 en föräldralös GPCR som reglerar neurulation dels genom RA signalväg 22, och vi rapporterar använder denna reporter cellinje för att undersöka effekten av en recessiv mutation i Gpr161 (Gpr161 vl) på den totala RA nivåer i embryo. I tillägg till detta, tillåter mångsidighet och lätthet i användning av detta reportersystem friheten att mäta och jämföra RA-nivåer i olika vävnadsprover, även i neurosfärkulturer erhållna från vuxna ryggmärgen stamceller. Här beskriver vi den kvantitativa bestämningen av relativa RA nivåer i embryon och neurosfärkulturer genom direkt samodling med F9 sällsynta LacZ RA repÖrter cellinje.
Protocol
Alla djur arbete gjordes enligt godkänd Rutgers-RWJMS IACUC metoder.
1. Lösning och Media Preparation
- Förbered lager och buffertlösningar enligt tabell 1. Bered arbetslösningar enligt tabell 2.
2. Kultur och underhåll av F9 sällsynta LacZ celler
- Upptining Frysta celler
- Förbereda F9 RARE-LacZ cellodlingsmedium enligt tabell 2.
- Coat 10 cm odlingsskålar (cellodlingsbehandlade) med 10 ml 0,2% gelatin (se Tabell 2) under 30 min vid RT. Tvätta bort överflödig gelatin med två sköljningar av 10 ml destillerat vatten. Omedelbart lägga 9 ml F9 RARE-LacZ-cellodlingsmedium in i kolven för att förhindra gelatinet från att torka.
- Tina en flaska med F9 RARE-LacZ-celler 14 i en 37 ° C vattenbad under 2-3 min. Plate celler (cirka 1 x 10 6 celler / ml) i den belagda skålen containing 9 ml odlingsmedium. Odling vid 37 ° C, 5% CO2. Ändra mediet nästa dag.
- Underhåll av F9 sällsynta LacZ celler
- Upprätthålla en regelbunden passage var 2 - 3 dagar i förhållandet 01:10.
Obs: Låt inte cellerna växa till sammanflytning eftersom detta kommer att resultera i deras differentiering. - Split kulturerna vid en konfluens av 80-90%. Ta bort media och tvätta cellerna med 10 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort PBS och tillsätt 1 ml trypsin, inkubera i 5 minuter. Lägg 9 ml odlingsmedium, pipett upp och ner och dela celler 1:10 för passage.
- Upprätthålla en regelbunden passage var 2 - 3 dagar i förhållandet 01:10.
- Frysning F9 sällsynta LacZ celler
- Trypsinize en 10 cm skål innehållande F9 sällsynta LacZ-celler vid 80-90% konfluens som beskrivs i steg 2.2.2. Överför de dissocierade cellerna in i ett 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 200 xg under 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml F9 RARE-LacZ freezing medium (se tabell 2). Alikvotera 1 ml i märkta cryovials och överföringsflaskor i frysbehållare. Placera frysning behållare i -80 ° C frys O / N och överföringsflaskor till flytande kväve tankar nästa dag.
3. Dissekering av E8.5 embryon
- Parning Cage Set-up och Plug Check
- Inrätta en passande bur innehållande en parning par. Morgonen den nästa dag, kontrollera närvaron av en vaginal plugg och utse dagen en plugg finns som dag 0,5 23. Vid dag E8.5, skörd embryon.
- Dissektion av embryon
- Offra dammen genom cervikal dislokation och spraya buken med 70% etanol (se tabell 2). Göra en tvärgående skära på huden ovanför buken med användning av kirurgisk sax och dra de två flikama isär (främre och bakre) för att exponera buken. Göra en liknande snittpå bukhinnan att exponera buken.
- Leta reda på livmoder och släpp livmödrar från äggledarna och mesometrium att använda en sax 23. Placera livmoder i en 6 cm skål (icke-cellodling behandlas) med 10 ml 1x PBS för att tvätta bort överflödigt fett och blod. Överföra till en annan 6 cm skål med färska 10 ml 1x PBS.
- Separat en livmoder som innehåller ett embryo genom att skära bort den med kirurgisk sax. Ta bort livmodern och decidua och släpp gulesäcken innehåller embryot med två par av ingen. 5 pincett 23.
- Separera gulesäcken från embryot, och överföra gulesäcken till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör för genomisk DNA-extraktion som ska användas för genotypning. Använd en P20 pipett med ett brett hål spets, överföra hela embryot till en 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 10 pl trypsin. Placera röret på is.
- Upprepa steg 3.2.3 - 3.2.4 tills alla embryon har dissekeras.
- embryo Dissociation
- Inkubera 1,5 ml rör innehållande embryon i trypsin vid 37 ° C under 5 min för att underlätta enzymatisk dissociation.
- Finfördela försiktigt med användning av en P20 pipett för mekanisk dissociation av embryot, och plattan hela 10 ^ il volym innehållande en dissocierade embryo över en brunn av F9 RARE-LacZ-celler i en platta med 96 brunnar (se steg 5.1 för plätering F9 RARE-LacZ-celler i en 96-brunnars platta). Kultur O / N vid 37 ° C och 5% CO2.
- Inkubera 1,5 ml rör innehållande embryon i trypsin vid 37 ° C under 5 min för att underlätta enzymatisk dissociation.
4. Laminektomi, Dissekering av vuxna Lumbar ryggmärg och neurosphere kultur
- laminektomi
- Offra en vuxen (P60) musen genom cervikal dislokation.
- Spraya ryggsidan med 70% etanol och göra en tvärgående snitt med användning av kirurgisk sax. Dra båda flikarna (främre och bakre) isär för att exponera ryggen och ryggraden.
- Med hjälp av kirurgisk sax, trimma bort musklerna täcker ryggraden.Lokalisera den lumbala regionen av ryggmärgen, under revbenen. Med användning av saxen, göra ett djupt snitt för att kapa ryggraden vid denna punkt för att exponera ryggmärgen.
- Dra upp ländryggen i ryggraden utan. 5 pincett så att den exponerade tvärsnitt av ryggmärgen står inför försöks. Med hjälp av tips av fina saxar, klipp kotan och muskler vid klockan 3 och 9 positioner för den exponerade änden. Ta tag i ryggflik snittet kotan med pincett. Fortsätt dessa nedskärningar caudally tills längden av ländryggen ryggmärgen exponeras.
- Släpp ryggmärgen från kotorna utan användning. 5 samt med trubbiga ändar pincett. Överföra ryggmärgen till ett 15 ml rör innehållande 3 ml av DMEM / F12-odlingsmedium. Håll på is tills alla ländrygg sladdar har isolerats.
- Ryggmärgs Dissection
- Pour odlingsmediet med ryggmärgen in i en 6 cm skål (icke-cellkultur behandlade).
- Under ett stereomikroskop, ta bort dorsala rotganglier och blodkärl runt ryggmärgen segmentet genom att ta tag i ganglier och blodkärl med användning av två par av nr. 5 pincett och försiktigt dra dem bort från ryggmärgen. Överför ryggmärgen segmentet till en 6 cm skål med inget medium och finhacka vävnaden fint med hjälp av en skalpell blad.
- Överföring malda vävnaden till 15 ml rör innehållande 1 ml av neurosfären dissociation medium (se tabell 2). Sätt röret på is och upprepa steg 4.2.1 - 4.2.2 tills alla ryggmärg har behandlats.
- Inkubera rör innehållande malet vävnad i dissociation medium vid 37 ° C under 10 min, flick röret på sidan för att blanda och sedan inkubera vid 37 ° C under ytterligare 10 min. Efter enzymatisk spjälkning, triturera med brand polerade pipetter med minskande diametrar för mekanisk dissociation.
Obs: Förbered brand polerad pipetter med minskande diametrar före utför experiment. Ta ett glas Pasteurpipett och anslut den breda änden med ren bomull. Användning av en alkohol lampa, brand polska spetsarna på pipetterna i flamman för att skapa olika diametrar: "vanlig", "bra" och "extra fine". För "vanliga" polerad pipetter, snurra i slutet av pipetten i lågan till runda av kanterna utan att minska diametern (~ 1 mm). Vrid slutet av pipetten i lågan under en något längre tid att skapa "bra" (~> 1 mm och> 5 mm diameter) och "extra bra" (~ 0,5 mm) polerade pipetter. Använd inte pipetter med en diameter mindre än 0,5 mm.
- neurosfär kultur
- Centrifugera ner rör innehållande dissocierade ryggmärgsvävnad vid 200 xg under 10 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml neurosphere odlingsmedia (se tabell 2). Finfördela med en P1,000 pipett följt av en P200 pipett för att underlätta dissociation.
Obs! Undvik att införa bubblor,vilket skulle minska cellviabiliteten. - Överföring 10 fil av dissocierade celler in i en hemocytometer och erhålla en cellräkning. Platt celler vid en densitet av 1x10 5/10 ml i en T25-kolv med 10 ml neurosphere odlingsmedia. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under 7 dagar till neurosfärer visas 24.
- Centrifugera ner rör innehållande dissocierade ryggmärgsvävnad vid 200 xg under 10 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml neurosphere odlingsmedia (se tabell 2). Finfördela med en P1,000 pipett följt av en P200 pipett för att underlätta dissociation.
- neurosphere Dissociation
- Samla neurosphere kultur och överföra till 15 ml rör. Snurra vid 200 xg under 10 min. Ta bort det mesta av supernatanten lämnar 1 ml bakom. Finfördela med en P1,000 pipett för att resuspendera cellpelleten och dissociera neuro i enskilda celler. Överföring 10 fil av dissocierade celler in i en hemocytometer och få ett celltal.
- Plattan 1 x 10 5 dissocierade neurosfärceller över en brunn av F9 RARE-LacZ i en platta med 96 brunnar (se avsnitt 5.1 för plätering F9 RARE-LacZ i 96-brunnar). Plattan 3 brunnar som replikat. Kultur O / N vid 37 ° C och 5% CO2.
5. RA Analys av E8.5 embryon och ryggmärgsNeuro
- Plätering F9 RARE-LacZ i 96-brunnar
- En dag före skörd E8.5 embryon eller dissociering av neurosfärer, belägga en 96-brunnar med 100 pl av 0,2% gelatin per brunn för 30 min vid RT. Sug ut gelatinet och skölj två gånger med 200 | il destillerat vatten.
- Trypsinize F9 sällsynta LacZ-celler upprätthölls i 10 cm skålar som beskrivs i steg 2.2.2. Plattan 1 x 10 5 celler / brunn av F9-SÄLLSYNTA LacZ-celler, men denna gång med användning av odlingsmedium utan G418.
- Förbered tillräckligt brunnar för samodling av embryon (~ 12-20, beroende på kullstorlek), neuro (3 brunnar / genotyp) samt för en standardkurva i tre exemplar (27 brunnar).
- Co-kultur av F9 sällsynta LacZ och E8.5 embryon eller ryggmärgen Neuro
- Skörd embryon som beskrivs i avsnitt 3.2 och platta ovanpå F9SÄLLSYNT-LacZ i 96-brunnar från avsnitt 5.1. På ett liknande sätt, dissociera neurosfärer och platta ovanpå F9 RARE-LacZ i 96-brunnar såsom beskrivs i steg 4,4. Kultur O / N vid 37 ° C och 5% CO2.
- Generera en standardkurva
- För att generera en standardkurva, förbereda all-trans RA (at-RA) lösningar med följande koncentrationer: 100 nm, 10 nm, en nM, 100 pM, 10:00, 01:00, 100 fM, genom serieutspädning av at- RA lager (se tabell 1) med F9 RARE-LacZ odlingsmedium.
- Tillsätt 100 pl av dessa olika vid-RA-koncentrationer till F9 RARE-LacZ-celler från avsnitt 5.1. Tilldela brunnar innehållande obehandlat F9 RARE-LacZ-celler som negativ kontroll. Förbered triplikat för varje RA koncentration och negativa kontrollbrunnar. Kultur O / N vid 37 ° C och 5% CO2.
Notera: F9 RARE-LacZ-celler svarar på ett dosberoende linjärt sätt för att varierande koncentrationer av all-trans RA.
- RA-analys
- Efter O / N-kulturen av 96-brunnar innehåller standardkurvorna och co-kulturer, ta bort media och fixa kulturer genom att tillsätta 100 pl 2,5% glutaraldehyd (se tabell 2) under 15 minuter, RT. Avlägsna fixativet och tvätta två gånger med 200 ^ il 1 x PBS, 10 min per tvätt.
- Avlägsna PBS och tvätta tre gånger med 200 | il av LacZ-tvättlösningen (se tabell 2), 10 min per tvätt. Under den tredje tvättningen, förbereda X-gal-färgning lösning i en 15 ml tub insvept i folie (se tabell 2). Räkna ut hur mycket färglösningen behövs och förbereda lämplig mängd (200 pl / brunn).
Obs: X-gal-färgning lösning är ljuskänslig. Använd färglösningen inom 15 minuter efter beredning. - Förbered en fuktig kammare genom att placera en pappershandduk fuktad med destillerat vatten i en plastbehållare tillräckligt stor för att hålla en platta med 96 brunnar. Tillsätt 200 pl av Xp-gal-färgningslösning per brunn i 96-brunnsplatta och placera plattan i en fuktad kammare.
- Inkubera befuktad kammare innehållande 96-brunnars platta vid 37 ° C för att möjliggöra utveckling av blå-färgad fällning. För E8.5 embryon, Inkubera plattan O / N (12-16 timmar). För neurosfärkulturer, inkubera plattan i 4-8 timmar.
- Läsa Absorbans vid OD 610 och Imaging
- Efter färgreaktion, avlägsna LacZ färglösningen och ersätt med 200 pl 1 x PBS. Mät absorbansen vid 610 nm med användning av en standard-ELISA-plattläsare för att kvantifiera reporter svar på RA. Bild individuella brunnar med användning av en standardstereomikroskop utrustad med en kamera.
6. Subkloning av F9 sällsynta LacZ celler
- Kontroll F9 RARE-LacZ rResponse till RA
- Innan något experiment, testa svaret från F9 sällsynta LacZ celler till RA. Platta F9 Sällsynta LacZ calnar i 96-brunnar (se avsnitt 5.1), och tillsätt 1 nM all-trans-retinsyra (se steg 5,3). Inkubera i en fuktad kammare vid 37 ° CO / N.
- Visualisera utveckling av blåfärgad fällning med användning av ett mikroskop. Om färgutvecklingen är inte enhetlig i hela cellerna i brunnen (se figur 1B, vänster), utför subkloning beskrivs nedan.
- Subkloning av F9 sällsynta LacZ celler
- Split F9 sällsynta LacZ celler odlade i 10 cm skålar som beskrivs i steg 2.2.2. I stället för en 1:10 förhållande, plätera en låg såddtäthet av 1 x 10 5 celler / 10 ml i en 10 cm skål för att möjliggöra tillväxten av isolerade kolonier på sådant sätt att varje koloni uppstår från en enda F9 RARE-LacZ-cell.
- Efter två dagar, belägga en 24-brunnsplatta med 500 | il av 0,2% gelatin per brunn för 30 min. Ta gelatinlösning och skölj brunnarna två gånger med 500 mikroliter destillerat vatten. Ersätta vatten med 500 ul av F9 RARE-LacZ cellodlingsmediet.
- Välj en koloni med en steril P10 pipettspets och överföring till en brunn; göra detta 24 gånger för att erhålla 24 individuella kolonier. Odling vid 37 ° C, 5% CO2 under 3 - 4 dagar.
- Dela individuella kolonier i två 24-hålsplattor. Efter 2 dagar i odling, tillsätt 1 nM av RA till varje brunn i en 24-brunnars platta och kultur O / N. Utför LacZ färgning som beskrivs i avsnitt 5.4 för att testa höga responders. Visualisera färgreaktion för varje brunn under ett mikroskop för att bestämma starka och enhetliga responders.
- När en stark subklon svars bestäms expanderar motsvarande kulturen från den andra 24-brunnar. Ytterligare utöka det koloni i en 10 cm skål, frysa ned flera flaskor som beskrivs i avsnitt 2.3, och kasta alla andra kolonier.
Obs: Endast omkring en fjärdedel av de ursprungliga kolonierna resultera i höga responders. Vanligtvis gör den första omgången av subkloning inte leda till en enhetlig LacZ färgning och en efterföljande omgång av subkloning behöver göras för attuppnå enhetliga starka responders.
Representative Results
F9 sällsynta LacZ reporter är en vidhäftande embryonal carcinoma cellinjen odlas på gelatin-belagda ytan. Reportern konstruktionen gör att cellerna att svara kvantitativt till RA med en proportionell induktion av beta-galaktosidas. 11,12,14,18. Dessa celler uppvisar en epitelial morfologi (Figur 1A). På grund av deras höga fördubbling takt, rekommenderas det att dessa celler delas varje 2 - 3 dagar i förhållandet 01:10. Under vårt arbete med denna reporter cellinje, har vi observerat att även med tillsats av G418 i odlingsmediet, svaret av dessa celler till RA försvagar efter flera passager (Figur 1B, vänster), och detta kan påverka reportern kapacitet denna cellinje. Denna förlust av känslighet kan bero på partiell förlust av transgenen vid senare passager. Som sådan periodisk subkloning är nödvändigt för att säkerställa en stark och enhetlig responders till RA (Figur1B, höger).
Medan olika användningar av denna cellinje har tidigare publicerats 12,14-18, redovisas här är användningen av denna cellinje för att mäta endogena RA nivåerna från enskilda E8.5 embryon med olika genotyper. De Gpr161 vl / vl mutation resulterar i minskad embryonal RA signalering 22. Såsom visas genom sam-odling av dissocierade embryon med F9 RARE-LacZ-celler, har dessa Gpr161 vl / vl embryon reducerad endogen RA jämfört med vildtyp kullsyskon (Figur 2A). På grund av mångsidigheten hos denna reporter-cellinje, rapporteras också här är en ny användning av dessa celler för att detektera RA nivåer som produceras av neurosfärkulturer erhållna från vuxen Gpr161 vikt / vikt-möss (Figur 2B). Detta reporter cellinje kunde visa att neurosfärkulturer från vuxna ryggmärgen stamceller producera endogen RA. Den stora diffrens i färgningsintensitet indikerar en större reporter cell svar på ryggmärgsneuro jämfört med E8.5 embryon. Detta kan bero på mycket större RA nivåer som genereras av neuro över tiden jämfört med E8.5 embryon, vilket kan bero på det faktum att neurosfärkulturer är mer homogen än E8.5 embryon och därmed innehåller mer RA-producerande celler.
Tillsats av olika koncentrationer av at-RA resulterar i en dosberoende linjär respons av reporterceller. Detta svar kan mätas kolorimetriskt genom avläsning av absorbansen vid 610 nm. Den genererade standardkurvan kan sedan användas för att kvantifiera RA-nivåer i prover, såsom i vildtyp neurosfärkulturer (figur 3a) eller E8.5-embryon (figur 3B).
Figur 1. Maintenance och Subkloning av F9 sällsynta LacZ celler. (A) En fas-kontrastbild av F9 sällsynta LacZ celler visas. Dessa celler har en fördubbling tid på ~ 10 timmar och måste föras var 3 dagar. (Ungefär 70-80% konfluens) vid en 1:10 förhållande (B) periodisk provning av kulturer med tillsats av 1 nM at-RA och efterföljande LacZ färgning måste göras för att säkerställa kulturer förbli starka och enhetliga responders till RA (höger). Vid dåliga och ojämna responders (till vänster), måste subkloning utföras. Skalstrecken 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. LacZ Färgning av Co-odlade Prover (Dissocierad E8.5 Embryon / Neuro) och F9 sällsynta LacZ-celler. (A) E8.5 musembryo s från olika genotyper dissocierades och ströks på toppen av F9 RARE-LacZ-celler. LacZ färgning 24 timmar senare tillåter visualisering av responsen hos F9 sällsynta LacZ celler till endogen RA produceras av samodlade prover. Den Gpr161 vl mutation resulterar i minskad endogen RA som visualiseras genom minskat svar av reporterceller. (B) Vänster. En fas-kontrastbild av neuro odlade från vuxna ryggmärgen neurala stamceller visas. Höger. Neurosfärer erhållna från vuxen Gpr161 vikt / vikt ryggmärgen dissocierades och ströks på toppen av F9 RARE-LacZ-celler. Närvaron av blå fällning efter LacZ färgning indikera närvaron av endogen RA i dessa neurosfärer. Skillnaden i färgningsintensitet mellan neurosfär och E8.5 embryo co-kulturer indikerar högre nivåer av RA närvarande i neuro än E8.5 embryon. Skalstrecken 100 | j, m.target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Standardkurva och Kolorimetrisk Kvantifiering av RA Nivåer. Svaret från F9 RARE-LacZ reporter-cellinje kan mätas kolorimetriskt vid 610 nm med användning av en standard ELISA-plattläsare. (A) Representativa standardkurva användes för att kvantifiera relativa RA nivåer av vildtyp neurosphere kultur s. (B) Kvantifiering av relativa RA nivåer från samodlade E8.5 embryon. N = 3; * P <0,05, students t-test. Felstaplar SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| stock Buffertar / lösningar | Komponenter | Förvaringsförhållanden |
| 10% Natriumdeoxikolat monohydrat (C 24 H 39 NaO 4 · H2O) | 10 ml i 100 ml dH 2 O | 4 ° C |
| 1 M magnesiumklorid (MgCl2) | RT | |
| 100x kaliumferrocyanid (K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 6 O) | 2,12 g i 10 ml dH 2 O | RT i mörker |
| 100x kaliumferricyanid (K 3 [Fe (CN) 6]) | 1,64 g i 10 ml dH 2 O | RT i mörker |
| 20 mg / ml X-gal (5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid) | tillsätt 5 ml dimetylformamid för att göra 20 mg / ml stamlösning | -20 ° C |
| 10 mM (3 mg / ml) all-trans retinsyra | Lös 50 mg i 16,67 ml absolut etanol. Förbereda 1 ml alikvoter. | -80 ° C i mörker, i 1,5 ml bärnstensfärgad mikrocentrifugrör |
| papain | upplösa en flaska i 7 ml HBSS | 4 ° C |
Tabell 1. Buffertar och lösningar kompositioner.
| Arbeta Buffertar / lösningar | Komponenter | Förvaringsförhållanden |
| F9 RARE-LacZ-cellodlingsmedium | 50 ml fetalt bovint serum (FBS) (slutkoncentration 10%) | Filter-sterilisera. |
| 5 ml 100x Penicillin Streptomycin (slutlig konc 1X) | Förvaras vid 4 ° C. | |
| 4ml 50 mg / ml G418 (slutlig konc 0,4 mg / ml) | ||
| till 500 ml DMEM / F-12 (med L-glutamin och HEPES) | ||
| 0,2% gelatin | 25 ml 2,0% gelatin | Förvaras vid 4 ° C. |
| 80 ml destillerat vatten | ||
| Blanda väl | ||
| 70% etanol | 30 ml 95% etanol | Placera i sprayflaska. |
| 70 ml destillerat vatten | Förvaras vid RT | |
| Neurosfären dissociation mediet | 1 ml 20U papain | förbereda färskt varje gång |
| 100 ul 13 mg / ml trypsin | ||
| 100 | j, l 7 mg / ml hyaluronsyra | ||
| 28 pl 10 mg / ml DNasI | ||
| 50 | j, l 4 mg / ml kynurensyra | ||
| Neurosphere odlingsmedium | DMEM / F-12 (med L-glutamin och HEPES) | förbereda färskt varje gång |
| 2% B-27 tillägg | ||
| 20 ng / ml fibroblasttillväxtfaktor (FGF) | ||
| 20ng epidermal tillväxtfaktor (EGF) | ||
| 2,5% glutaraldehyd | 250 | il 50% glutaraldehyd | förbereda färskt varje gång |
| 4750 l 1x PBS | ||
| LacZ tvättlösning | 0,5 ml 10% deoxicholat (slutlig konc 0,1%) | Förvaras vid 4 ° C. |
| 1,0 ml 100% NP-40 (slutlig konc 0,2%) | ||
| 50 ml 10X PBS | ||
| destillerat vatten till 500 ml | ||
| X-gal-färgning lösning | 1x kaliumferrocyanid | förbereda färskt varje gång |
| 1x kaliumferricyanid | ||
| 1 mg / ml X-gal | ||
| till lämplig volym med LacZ tvättlösning | ||
| F9 sällsynta LacZ frysmedium | F9 RARE-LacZ odlingsmedium + 5% DMSO | förbereda färskt varje gång |
Tabell 2. Arbets buffertar och lösningar kompositioner.
Discussion
F9 RARE-LacZ-cellinjen 14 är ett kraftfullt system som kan användas för detektion av RA som produceras av vävnadsexplantat 12,14,17,18. Den är känslig för RA så låga koncentrationer som 100 fM, utan någon icke-specifik respons detekterades i celler obehandlade med RA 12,14,18. Vidare är de reporter celler svarar på all-trans RA på ett linjärt sätt inom ett specifikt koncentrationsområde, vilket möjliggör LacZ reaktion som skall kvantifieras och användas för att bestämma storleken på RA nivåer 12,14,18. Den snabba och enkla analys RA reporter presenteras här utnyttjar F9 sällsynta LacZ reporter cellinje för visualisering (Figur 2) och relativ kvantitativ mätning (Figur 3) av embryon och odlade vuxna neurala stamceller. Detta reporter system möjliggör jämförelse av endogena RA nivåer mellan enskilda prover, som visas i figur 2. Det är tillräckligt känslig för att kunna detektera RAgenereras av enskilda E8.5 embryon (figur 2A) samt RA produceras av odlade neuro (Figur 2B). Den dosberoende svaret av denna cellinje för varierande koncentrationer av RA möjliggör kvantifiering av RA-nivåer (Figur 3A) i proven samt jämförelse av relativa RA nivåer mellan prover (Figur 3B). Det är viktigt att notera att den F9 SÄLLSYNTA reporter-cellinje mäter det totala beloppet av RA som genereras av de vävnadsprover över tid för inkubation. Detta motsvarar nettot av RA-syntes och nedbrytning.
Medan F9 sällsynta LacZ cellreportersystem är mycket känslig och mångsidig, det finns flera viktiga felsökningssteg som vi har blandats in för att säkerställa tillförlitligheten av detta system. Först, såsom visas i figur 1, är det viktigt att bibehålla hälsan hos dessa celler genom regelbundna passager utan att låta dem gro till konfluens. För det andra, har vi observerat senare passager tenderar att resultera i inkonsekventa RA svar, även om kulturerna ständigt hålls under val med G418. Att felsöka, är det rekommenderat att kassera kulturer efter 20 passager och tina en ny flaska. Dessutom måste regelbundna kontroller utföras för att säkerställa att de reporter cellerna fortfarande starka responders på närvaron av RA i media. För det tredje, om de tidiga passagerna visar dålig eller icke-enhetligt svar på RA (Figur 1B, vänster), en eller flera omgångar av subkloning kan vara nödvändigt till dess starka responders erhålles (Figur 1B, righ t). Slutligen innan samodling, rekommenderas det att vävnadsprover såsom embryon och neurosfärer dissocieras till enskilda celler. Vi har observerat att dissociation av proverna ger jämnare kolorimetriska mätningar. Detta kan bero på en jämnare fördelning av RA i odlingsbrunnarna, som de dissocierade cellerna är i uniformulär kontakt med reportercellerna.
Flera ändringar gjordes också till det ursprungliga protokollet 14. Först var RA svar på F9 sällsynta LacZ celler kvantifieras genom direkt fastställande av celler och mätning av absorbansen vid 610 nm i stället för att samla in celler och analysera lysat för B-galaktosidasaktivitet 14. En annan modifiering är den direkta samodlingen av dissocierade prover med F9 sällsynta LacZ före kvantifiering av RA svar. Tidigare metoder rapporterade odling prov separat och tillsätta endast media från dessa kulturer till F9 sällsynta LacZ 16,18.
Trots att det är ett kraftfullt system, har de F9 RARE-LacZ reporteranalys flera begränsningar. En begränsning hos denna reporter-cellinje är att även om det svarar starkt på närvaron av all-trans-RA, svarar den även till andra retinsyra isomerer inklusive 9-cis-RA och 13-cis-RA; de är emellertid 100-faldigt mer känslig för all-trans RA comparött till andra isomerer 18. En annan begränsning till detta system är att den linjära dosberoende respons endast faller mellan 10 -13 M till 10 -7 M at-RA 14,18; alltså, om man jämför RA nivåer utanför dessa gränser, kan det vara nödvändigt att utföra en serieutspädning av provet tills mätningarna faller inom det linjära området. Slutligen, eftersom detta är främst en kolorimetrisk analys, kommer slutpunkten av färgutveckling variera mellan prover och experiment. Således är det viktigt att en standardkurva alltid pläteras parallellt för varje enskilt experiment i syfte att använda den för kvantifiering av reportercellsvar.
Sammanfattningsvis har vi rapporterat användningen av F9 sällsynta LacZ RA reporter cellinje för att mäta RA nivåer kvantitativt i E8.5 embryon och tidigare rapporterat, i neuro. Mångsidigheten hos denna reportersystem kan tillåta kvantifiering av RA-nivåer i praktiskt taget vilken cell som helst eller vävnadstyp, och may resultera i utvecklingen av olika applikationer i framtiden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain | Jackson Laboratory | 000316 | |
| F9 RARE-LacZ reporter cell line | from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) | ||
| DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES) | ThermoFisher Scientific | 11330-057 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 °C for media preparation |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive |
| G418 | ThermoFisher Scientific | 10131-027 | Store at 4 °C; light-sensitive |
| 2% Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Store at 4 °C |
| B-27 supplement (2 % stock solution) | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation |
| Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1xPBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C |
| Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic | PeproTech | 450-33 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1x PBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C |
| 50% glutaraldehyde | Amresco | M155 | Store at 4 °C |
| Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O) | Sigma Aldrich | D5670 | Store at RT |
| X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside) | Promega | V3941 | Store stock at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 41639 | Store at RT |
| all-trans Retinoic Acid (at-RA) | Sigma Aldrich | R-2625 | Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12605-010 | Store at RT |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200-056 | alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | Store at 4 °C |
| 10x phosphate buffered solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Store at 4 °C |
| Papain | Worthington | LK003176 | Store at 4 °C. |
| Trypsin | Worthington | LS003703 | Store in 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Hyaluronic acid | Calbiochem | 385908 | Store 200 μl aliquots at -20 °C. |
| DNaseI | Worthington | LS002139 | Store in 200 μl aliquots at -20 °C |
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich | K3375 | Store in 200 μl aliquots at -20 °C |
| 95% ethanol | |||
| Mr. Frosty Freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| 10 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
| 10 cm culture dish (cell culture treated) | |||
| 6 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
| 96-well cell culture plates | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| 1.5 ml amber microcentrifuge tubes | |||
| 1.5 ml cryovials | |||
| 37 °C water bath | |||
| surgical scissors | |||
| fine surgical scissors | |||
| no. 5 forceps | |||
| blunt-ended forceps | |||
| scalpel blade | |||
| glass pasteur pipettes | |||
| cotton | |||
| alcohol lamp | |||
| ELISA plate reader | |||
| stereomicroscope |
References
- Vilhais-Neto, G. C., Pourquie, O.
- Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Science Signalling. 324, 1-3 (2006).
- Lane, M. A., Bailey, S. J. Role of retinoid signalling in the adult brain. Prog Neurobiol. 75 (4), 275-293 (2005).
- Maden, M. Retinoid signalling in the development of the central nervous system. Nat Rev Neurosci. 3 (11), 843-853 (2002).
- Maden, M. Retinoids and spinal cord development. J Neurobiol. 66 (7), 726-738 (2006).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Ang, H. L., Deltour, L., Hayamizu, T. F., Zgombic-Knight, M., Duester, G. Retinoic acid synthesis in mouse embryos during gastrulation and craniofacial development linked to class IV alcohol dehydrogenase gene expression. J Biol Chem. 271 (16), 9526-9534 (1996).
- Ang, H. L., Duester, G. Stimulation of premature retinoic acid synthesis in Xenopus embryos following premature expression of aldehyde dehydrogenase ALDH1. Eur J Biochem. 260, 227-234 (1999).
- Bastien, J., Rochette-Egly, C. Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes. Gene. 328, 1-16 (2004).
- Chatzi, C., Cunningham, T. J., Duester, G. Investigation of retinoic acid function during embryonic brain development using retinaldehyde-rescued Rdh10 knockout mice. Dev Dyn. 242 (9), 1056-1065 (2013).
- Sakai, Y., Drager, U. C. Detection of retinoic acid catabolism with reporter systems and by in situ hybridization for CYP26 enzymes. Methods Mol Biol. 652, 277-294 (2010).
- Yamamoto, M., Drager, U. C., McCaffery, P. A novel assay for retinoic acid catabolic enzymes shows high expression in the developing hindbrain. Dev Biol Res. 107, 103-111 (1998).
- Rossant, J., Zirngibl, R., Cado, D., Shago, M., Giguere, V. Expression of a retinoic acid response element-hsplacZ transgene defines specific domains of transcriptional activity during mouse embryogenesis. Genes & Dev. 5, 1333-1344 (1991).
- Wagner, M., Han, B., Jessel, T. M. Regional differences in retinoid release from embryonic neural tissue detected by an in vitro reporter assay. Development. 116, 55-66 (1992).
- Luo, T., Wagner, E., Crandall, J. E., Drager, U. C. A retinoic-acid critical period in the early postnatal mouse brain. Biol Psychiatry. 56 (12), 971-980 (2004).
- Luo, T., Wagner, E., Grun, F., Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the brain marks formation of optic projections, maturation of the dorsal telencephalon, and function of limbic sites. J Comp Neurol. 470 (3), 297-316 (2004).
- Kelley, M. W., Xu, X. M., Wagner, M. A., Warchol, M. E., Corwin, J. T. The developing organ of Corti contains retinoic acid and forms supernumerary hair cells in response to exogenous retinoic acid in culture. Development. 119, 1041-1053 (1993).
- McCaffery, P., Drager, U. C. Hot spots of retinoic acid synthesis in the developing spinal cord. Proc Natl Acad Sci. 91, 7194-7197 (1994).
- Hu, L., Gudas, L. J. Cyclic AMP analogs and retinoic acid influence the expression of retinoic acid receptor alpha, beta, and gamma mRNAs in F9 teratocarcinoma cells. Mol Cell Biol. 10 (1), 391-396 (1990).
- Martin, G. R.
- Strickland, S., Mahdavi, V. The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid. Cell. 15 (2), 393-403 (1978).
- Li, B. I., et al. The orphan GPCR, Gpr161, regulates the retinoic acid and canonical Wnt pathways during neurulation. Dev Biol. 402 (1), 17-31 (2015).
- Hogan, B., Constantini, F., Lacy, E. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 1st, Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Methods Mol Biol. 549, 91-101 (2009).
