Introduction
Retinoik asit (RA) retinol ve vitamin A bir metabolitidir türevidir ve çeşitli hücresel dehidrojenazların 1 sıralı aktivitesi ile üretilmektedir. Nedeniyle amphiphatic kimyasal yapısı nedeniyle, hali hazırda lipid membranlar geçer ve çözünebilir morfogenetik faktörü 1 olarak hareket edebilir. Nükleer retinoid reseptörleri için bir ligand olarak işlev gören ve gen ekspresyonu 2-10 aktive ederek pek çok gelişme ve yetişkin hücresel süreci düzenleyen önemli bir moleküldür. RA olmadan bu RA reseptörleri (RARS) baskılayıcı olarak DNA ve hareket bağlama RARE; RA bu reseptörlere bağlanması, hedef gen ekspresyonu 1,5,6 sonuçlanan transkripsiyonel aktivatörleri haline getirir.
RA sinyal yolu iyi karakterize olmasına rağmen, RA küçük boyutlu (~ 300 Da) ve amfipatik doğası direkt histolojik görselleştirme ve halen RA ölçümü 11 teknik olanaksız hale getirir. dir için tek yöntemRA seviyeleri vb ölçümü, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) 11 kullanılarak doku örneklerinden RA izolasyonu geçer. Bu yöntem, genellikle, farklı numuneler 12 havuzu kolaylaştırdı doku büyük miktarlarda gerektirir. Bu nedenle, bu teknik, tek tek embriyolar ya da örnek / doku küçük miktarlarda RA seviyelerinin ölçümü için pek uygun değildir.
RA hücresel fonksiyonu incelemek için, birkaç yöntem dolaylı RA varlığını ortaya koymak geliştirilmiştir. Bu yöntemler, beta-galaktosidaz veya lusiferaz 11,13,14 ifadesini süren RARE son derece duyarlı, RAR-beta ihtiva eden raportör sistemler kullanır. Rossant ve ark., 13 tarafından oluşturulan transgenik NADİR-LacZ haberci fare yerinde 11,13,15,16 RA sinyalizasyon Spatiotemporal bölgelerini görselleştirmek için ideal bir sistem ancak kantitatif ölçümler için uygun değildir. T F9 NADİR-LacZ hücre hattı 14,O, diğer yandan, doku eksplantlarında 11,12,14,17,18 RA RA seviyelerinin niceliksel ölçümlerini içerir saptanması için yararlıdır.
F9 teratokarsinoma hücrelerinin beta, endojen alfa- ifade eder ve y-retinoik asit, 19 alıcıları, ve RA 19-21 maruz kaldıktan sonra parietal endoderm şeklınde farklılaşmayı başlatır. F9 hücrelerinin uzun bir RA haberci deneyi için ideal bir hücre çizgisi olarak seçilmiştir neden RA-uyarılan hücre farklılaşması için bir model olarak belirlenmiştir. Wagner ve ark tarafından üretilen F9 türetilmiş Sil-15 RA raportör hücre çizgisi. 14, E. içerir insan beta-retinoik asit reseptörü (RAR-p) geni (nadir) 64-bp retinoik asit, yanıt elementi bir kopyasının alt coli'LacZ geni. Seçip stabil klonlar korumak için, yapı da G418 mevcudiyetinde bir seçilebilir marker olarak aminoglikosit fosfotransferaz (NEO r) geni de içerir. Bu konstrukt, COLacZ boyama yoluyla görselleştirilebilir RA varlığında, B-galaktosidaz uyarılabilir ifade nfers ve bu yanıt, daha sonra olması kolorimetrik yöntemler 11,12,14,18 kullanılarak ölçülür olabilir.
Bu çok yönlü raportör hücre hattı yaygın olarak 17 koklear ve embriyonik taban plakası eksplantlar 14 olarak haberci hücrelerde, doku örneklerinin ko-kültür ile endojen RA üretim saptanmasında kullanılmıştır. Buna ek olarak, bu muhabir hattı ayrıca oluşum safhasındaki omurilik toplanmış bölümleri kültürlenmesini ve F9 nadir LacZ hücre 18 için bu kültürlerden kıvamlandırılmış ortam eklenerek geliştirilmesi omurilik RA seviyelerinin ölçümü için kullanılmıştır. Niceleme standart ELISA plaka okuyucusu 11,12,18 kullanılarak kolorimetrik okuma yoluyla LacZ boyama sonra yapıldı. Son olarak, bu raportör hücre hattı Monitori RA metabolik enzimlerin mevcudiyetinde saptanmasında kullanılmıştırng RA seviyeleri 12,18 değişir.
Burada bu raportör hücre kuşağının duyarlılığı tek tek birlikte kültüre E8.5 embriyolardan oluşturulan RA seviyelerinin ölçümü sağlar bildirmektedir. Bu, farklı genotipleri bireysel embriyoları arasında karşılaştırma sağlar. Spesifik bir örnek olarak, Gpr161 RA sinyal yolu 22 boyunca kısmen Nörülasyonu düzenleyen yetim GPCR olduğunu ve genel RA düzeyde Gpr161 (Gpr161 il) ve resesif mutasyon etkisinin araştırılması için bu raportör hücre soyu kullanılarak rapor embriyo. Buna ek olarak, çok yönlülük ve kolay kullanım, bu muhabir sisteminin ölçmek ve hatta yetişkin omurilik kök hücrelerinden elde edilen neurosphere kültürlerde, farklı doku örneklerinin RA seviyelerini karşılaştırmak için özgürlük sağlar. Burada F9 NADİR-LacZ RA temsilcisi ile doğrudan ko-kültür aracılığıyla embriyo ve neurosphere kültürlerde göreceli RA seviyelerinin kantitatif tayini tarifÖrter hücre çizgisi.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları kabul Rutgers-RWJMS IACUC yöntemlere uygun olarak yapıldı.
1. Çözüm ve Medya Hazırlık
- . Tablo 1 gereğince stok ve tampon çözümleri hazırlayın Tablo 2'deki gibi çalışan çözümleri hazırlayın.
2. Kültür ve F9 NADİR-LacZ Hücrelerinin Bakım
- Çözülme Dondurulmuş Hücreler
- Tablo 2'de ayrıntılı olarak F9 NADİR-LacZ hücre kültür ortamı hazırlayın.
- Ceket 10 cm kültür tabaklarında% 0.2 jelatin 10 ml (işlemden hücre kültürü), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (Tablo 2 ye bakınız). damıtılmış su 10 ml iki durulama ile aşırı jelatin yıkayınız. Hemen kurutma jelatinin önlemek için şişeye F9 nadir LacZ hücre kültür ortamının 9 ilave edin.
- 3 dakika - 2 için bir 37 ° C su banyosu içinde, F9 nadir LacZ hücre 14 bir şişe çözülme. Kaplanmış bulaşık C içine plakası hücreleri (6 ila 10 x yaklaşık 1 hücre / ml)kültür ortamının 9 ml içeren gruptur. 37 ° C 'de kültür,% 5 CO2. Ertesi gün orta değiştirin.
- F9 NADİR-LacZ Hücrelerinin Bakım
- 1:10 oranında - 3 gün, her 2 düzenli geçit koruyun.
Not: Hücreler bu onların farklılaşma neden olacaktır olarak confluency içine büyümesine izin vermeyin. - % 80-90 bir confluency kültürleri Böl. Ortamı çıkarın ve 1X fosfat tamponlu tuz, 10 ml (PBS) hücreleri yıkamak. 5 dakika boyunca inkübe PBS çıkarın ve tripsin 1 ml. kültür ortamı, pipet 9 ml yukarı ve aşağı ve split hücreler 01:10 geçişi için ekle.
- 1:10 oranında - 3 gün, her 2 düzenli geçit koruyun.
- F9 NADİR-LacZ Hücreleri Dondurucu
- Adım 2.2.2 detaylı olarak% 90 izdiham - 80 F9 NADİR-LacZ hücreleri içeren bir 10 cm'lik çanak Trypsinize. 5 dakika boyunca 200 x g'de 15 ml santrifüj borusu ve bir dönüş ayrışmış hücreleri aktarın.
- F9 NADİR-LacZ f 10 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelet çıkarınorta reezing (bakınız Tablo 2). Kısım dondurma kaplara etiketli cryovials ve transfer şişelere 1 mi. Ertesi gün, sıvı azot tanklarına -80 ° C dondurucu O / N ve transfer şişelere kap dondurma yerleştirin.
E8.5 Embriyolar 3. Diseksiyon
- Çiftleşme Cage Set-up ve Tak Kontrol
- Set-up bir çiftleşme çifti içeren bir çiftleşme kafesi. Ertesi gün sabah, vajinal fiş olup olmadığını denetlemek ve bir fiş günde 0.5 23 olarak bulunmuştur gün belirleyin. günlük E8.5, hasat embriyolar.
- Embriyoların Diseksiyon
- Servikal dislokasyon ile baraj Kurban ve% 70 etanol ile karın bölgesi sprey (bakınız Tablo 2). cerrahi makas kullanarak karın üstündeki cilde kesilmiş bir çapraz yapın ve karın bölgesi ortaya çıkarmak için ayrı (anterior ve posterior) iki flep çekin. Benzer bir kesim olunperiton üzerinde karın ortaya çıkarmak.
- Uterus bulun ve fallop tüplerinin gelen uterus bırakın ve makas 23 bir çift kullanarak mesometrium. PBS aşırı yağ ve kan yıkamak için 1x 10 ml 6 cm çanak (tedavi olmayan hücre kültüründe) olarak uterus yerleştirin. PBS 1x taze 10 ml içeren başka 6 cm çanak aktarın.
- cerrahi makas kullanarak keserek bir embriyo içeren bir rahim ayrı. rahim ve desidua çıkarın ve hiçbir iki çift kullanarak embriyo içeren yumurta sarısı kesesi bırakın. 5 forseps 23.
- embriyo yumurta sarısı kese Ayrı ve genotip için kullanılmak üzere, genomik DNA izolasyonu için bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne sarısı kese aktarın. tripsin 10 ul içeren bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine bütün embriyoyu transfer geniş çaplı bir ucu ile bir P20 pipet kullanın. buz üzerinde tüp yerleştirin.
- Tüm embriyolar disseke edilene kadar 3.2.4 - Tekrar 3.2.3 adımları.
- embriyo Ayrılma
- 5 dakika enzimatik ayrışma kolaylaştırmak için 37 ° C'de tripsin embriyolar içeren 1.5 ml tüpler inkübe edin.
- Öğütün yavaşça embriyo mekanik ayrışması için bir P20 pipet kullanılarak ve 96 oyuklu bir plaka içerisinde, F9 nadir LacZ hücrelerinden biri üzerinde iyi bir ayrışmış embriyolu tam 10 ul hacmi plaka (F9 nadir LacZ hücreleri kaplama adımını 5.1 96 çukurlu bir tablanın bir çukuru). Kültür O / N 37 ° C'de ve% 5 CO2.
- 5 dakika enzimatik ayrışma kolaylaştırmak için 37 ° C'de tripsin embriyolar içeren 1.5 ml tüpler inkübe edin.
4. Laminektomi, Diseksiyon Yetişkin Lomber Spinal Kord ve Neurosphere Kültür
- laminektomi
- servikal dislokasyon ile bir yetişkin (P60) fare Kurban.
- % 70 etanol ile dorsal yüzü sprey ve cerrahi makas kullanarak enine kesim yapmak. sırt ve omurga sütununu maruz ayrı hem kanatlara (anterior ve posterior) çekin.
- cerrahi makas kullanarak, omurga kapsayan kasları keserek.kaburga altında, omuriliğin bel bölgesini bulun. makas kullanarak, derin bir kesik omuriliği ortaya çıkarmak için bu noktada omurga koparmaya olun.
- Hiçbir ile omurganın bel bölgesini yukarı çekin. 5 forseps omurilik maruz kalan enine kesitinin deneyci bakacak şekilde. ince makas ipuçlarını kullanarak, maruz sonu 03:00 ve 09:00 pozisyonunda omur ve kas snip. forseps ile kesilmiş vertebra dorsal kapağını tutun. Lomber spinal kord uzunluğu maruz kadar kaudal bu kesim devam ediyor.
- hayır kullanarak omurlar arasından omurilik bırakın. 5 yanı sıra künt uçlu forseps. DMEM / F12 kültür ortamı 3 ml içeren 15 ml'lik bir tüpe omurilik aktarın. tüm lomber omurilik izole edilene kadar buz üzerinde tutun.
- Spinal Kord Diseksiyon
- 6 cm çanak içine omurilik ile kültür ortamı dökün (non-hücre kültürü tedavi).
- Bir stereomikroskop altında, hiçbir iki çift kullanarak ganglionlar ve kan damarlarını tutarak omurilik segmentinde etrafında dorsal kök ganglionlar ve kan damarlarını çıkarın. 5 forseps ve yavaşça omurilik uzak çekerek. Hiçbir orta ile 6 cm çanak omurilik segmenti aktarın ve ince bir neşter bıçak kullanarak doku kıyma.
- Neurosphere ayrışma ortamı 1 ml içeren 15 ml'lik bir tüpe transfer Kıyılmış doku (bakınız Tablo 2). Tüm omurilik işlendikten kadar 4.2.2 - 4.2.1 adımları buz ve tekrar tüpü koyun.
- 10 dakika boyunca 37 ° C 'de ayrışma ortamı içinde kıyılmış doku ihtiva eden tüpler inkübe karıştırmak için yan boru fiske ve daha sonra başka bir 10 dakika daha 37 ° C'de inkübe edin. Mekanik ayrışma için çapları azalan yangın cilalı pipetler ile enzimatik sindirim, çiğnemek sonra.
Not: deneyler gerçekleştirmeden önce çapları azalan yangın cilalı pipetler hazırlayın. Bir bardak Pasteur alınpipet ve temiz pamuk ile geniş ucunu. bir alkol lambası kullanarak, yangın lehçe alev pipetler ipuçları Farklı çaplarda oluşturmak için: "Normal", "para cezası", ve "ekstra para cezası". "Normal" cilalı pipetler için, çapı (~ 1 mm) düşürmeden kenarları yuvarlak alevinde pipet ucunu burgu. "Iyi" (~> 1 mm ve> 5 mm çap) ve "ekstra para cezası" (~ 0.5 mm) cilalı pipetler oluşturmak için biraz daha uzun bir süre için alev pipet ucunu döndürün. 0.5 mm'den daha az çaptaki pipetler kullanmayın.
- neurosphere Kültür
- içeren aşağı Spin tüpler 10 dakika boyunca 200 xg'de omurilik dokusu ayrışmış. Neurosphere kültür ortamı, 1 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın (bakınız Tablo 2). ayrışma kolaylaştırmak için bir P200 pipet ardından P1,000 pipet ile toz haline getirin.
Not: tanıtan kabarcıkları kaçının,hangi hücre canlılığı azalacaktır. - Bir hemasitometre içine Transferi ayrışmış hücrelerin 10 ul ve hücre sayımı edinin. Neurosphere kültür ortamı, 10 ml bir T25 şişesi içinde 1x10 5/10 ml yoğunlukta plaka hücreleri. Neurospheres 24 görünene kadar 7 gün boyunca CO2 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5.
- içeren aşağı Spin tüpler 10 dakika boyunca 200 xg'de omurilik dokusu ayrışmış. Neurosphere kültür ortamı, 1 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın (bakınız Tablo 2). ayrışma kolaylaştırmak için bir P200 pipet ardından P1,000 pipet ile toz haline getirin.
- neurosphere Ayrılma
- neurosphere kültürünü toplayın ve 15 ml tüpler transfer. 10 dakika boyunca 200 xg'de Spin. geride 1 ml bırakarak süpernatant en çıkarmak. Hücre pelletini ve tek hücre içine neurospheres ayırmak için bir P1,000 pipet ile çiğnemek. Bir hemasitometre içine Transferi ayrışmış hücrelerin 10 ul ve hücre sayımı olsun.
- Levha 1 x 10 5, 96 oyuklu bir plaka (96 oyuklu bir plaka içerisinde, F9 nadir LacZ kaplama için bölüm 5.1) F9 nadir LacZ bir oyuk üzerinde neurosphere hücreleri kesilerek. Plaka çoğaltır olarak 3 kuyu. Kültür O / N 37 ° C'de ve% 5 CO2.
E8.5 Embriyolar ve Omurilik Neurospheres 5. RA Deneyi
- 96 oyuklu bir plaka kaplama F9 nadir LacZ
- Bir gün hasat E8.5 embriyolar veya neurospheres ayrışmasından önce, kaplama, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oyuk başına% 0.2 jelatin, 100 ul, 96 oyuklu bir plaka. Aspire ve jelatin distile su, 200 ul iki kez yıkayın.
- Adım 2.2.2 detaylı olarak Trypsinize F9 NADİR-LacZ hücreleri 10 cm yemekleri sürdürdü. Levha 1 x 10 5 hücre / kuyu F9-NADİR LacZ hücreleri, ama G418 olmadan kültür ortamı kullanılarak bu sefer.
- , Neurospheres (3 kuyu / genotip) yanı sıra, üç kopya halinde standart bir eğri (27 oyuk) - embriyo ko-kültür (altlık boyutuna bağlı olarak 20 ~ 12) için yeterli kuyu hazırlayın.
- F9 NADİR-LacZ ve E8.5 Embriyolar veya Omurilik Neurospheres Co-kültür
- F9 üstündeki bölüm 3.2 ve plaka ayrıntılı olarak hasat embriyolarbölüm 5.1 96-plaka NADİR-LacZ. Benzer bir şekilde, Aşama 4.4 ayrıntılı olarak açıklanan 96-çukurlu plaka içinde F9 nadir LacZ üstünde Neurospheres ve plaka ayrıştırmaları. Kültür O / N 37 ° C'de ve% 5 CO2.
- Bir standart eğri oluşturma
- 100 nM, 10 nM, 1 nM, at- seri seyreltme ile 100 pM, 10 pM, 13:00, 100 FM: bir standart eğri oluşturmak için aşağıdaki konsantrasyonlarına sahip çözeltiler (en-RA), tüm-trans RA hazırlanması F9 nADİR-LacZ kültür ortamı ile RA stok (bakınız Tablo 1).
- bölüm 5.1 F9 NADİR-LacZ hücrelerine konsantrasyonlarda-RA de bu farklı 100 ul ekleyin. Tedavi edilmemiş F9 NADİR-LacZ hücreleri negatif kontrol olarak içeren kuyu atayın. her RA konsantrasyonu ve negatif kontrol kuyuları triplicates hazırlayın. Kültür O / N 37 ° C'de ve% 5 CO2.
Not: F9 nadir LacZ hücre-trans RA değişen konsantrasyonlarda bir doza bağlı doğrusal bir şekilde yanıt verir.
- RA Deneyi
- Standart eğriler ve ko-kültürler içeren 96 oyuklu plakanın O / N kültürden sonra, ortamını çıkarın ve% 2.5 glutaraldehid, 100 ul ekleyerek kültürleri çözmek, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında (bakınız Tablo 2). Fiksatif çıkarın ve PBS 1X 200 ul, yıkama başına 10 dakika ile iki kez yıkanır.
- PBS çıkarın ve LacZ yıkama çözeltisi 200 ul ile üç kez yıkama, yıkama başına 10 dk (bakınız Tablo 2). Üçüncü yıkama sırasında folyo ile sarılmış bir 15 ml tüp içinde X-gal ile boyama solüsyon hazırlanır (bakınız Tablo 2). gerekli ne kadar boyama çözeltisi hesaplayın ve uygun bir miktar (200 ul / oyuk) hazırlanması.
Not: X-gal boyama çözüm duyarlı ışıktır. hazırlandıktan sonra 15 dakika içinde boyama solüsyonu kullanın. - 96 oyuklu bir plaka tutmak için yeterince büyük, bir plastik kap içine damıtılmış su ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu yerleştirerek nemlendirilmiş bir odada hazırlayın. X 200 ul eklegal boyaması 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu çözeltisi ve nemlendirilmiş bir odada plaka koyun.
- Mavi renkli çökelti gelişimine izin vermek için 37 ° C'de 96-çukurlu plaka ihtiva eden nemlendirilmiş bir odacıkta inkübe edin. (- 16 saat 12) E8.5 embriyoların plaka O / N kuluçkaya yatmaktadır. 8 saat - neurosphere kültürler için, 4 plaka inkübe edin.
- OD 610 ve Görüntüleme de Absorbans Okuma
- renk reaksiyonundan sonra, LacZ boyama çözüm kaldırmak ve PBS 1x 200 ul ile değiştirin. RA raportör yanıtını ölçmek için standart bir ELISA plaka okuyucusu kullanılarak 610 nm'de absorbansı ölçülür. Bir kamera ile donatılmış bir standart stereomikroskop kullanılarak görüntü bireysel kuyular.
F9 NADİR-LacZ Hücreleri 6. Altklonlaması
- RA F9 NADİR-LacZ rResponse denetleme
- herhangi bir deney başlamadan önce, RA için F9 NADİR-LacZ hücrelerinin tepkisini test edin. Plaka F9 NADİR-LacZ c96 oyuklu bir plaka içerisinde arşın (bakınız bölüm 5.1) ve 1 nM All-trans retinoik asit (adım 5.3) ekleyin. 37 ° de CO / N nemlendirilmiş bir oda içinde inkübe edin.
- Bir mikroskop kullanılarak mavi renkli çökelti gelişimini gözünüzde canlandırın. Renk geliştirme gözdeki hücrelerin boyunca düzgün değilse, aşağıda ayrıntıları altklonlanmasıyla gerçekleştirmek (sol Şekil 1B, bakınız).
- F9 NADİR-LacZ Hücreleri Altklonlaması
- Adım 2.2.2 detaylı olarak 10 cm yemekleri kültüre F9 NADİR-LacZ hücreleri bölme. Bunun yerine 1:10 oranı, her bir koloni, tek bir F9 nadir LacZ hücre ortaya çıkar, öyle ki izole edilmiş koloni büyümesine izin vermek için 10 cm'lik bir tabak içinde, 1 x 10 5 hücre / 10 mi düşük bir tohum yoğunluğu plaka.
- İki gün sonra, kaplama, 30 dakika boyunca oyuk başına% 0.2 jelatin 500 ul, 24 oyuklu bir plaka. Jelatin çözeltisini çıkarın ve distile su, 500 ul kuyular iki kere yıkayın. F9 nadir LacZ hücre kültür ortamında 500 ul su ile değiştirin.
- iyi birine steril bir P10 pipet ve transfer kullanarak bir koloni seçin; 24 ayrı koloniler elde etmek için bu 24 kez yapmak. 4 gün - 37 ° C, 3% 5 CO 2 kültür.
- İki 24 oyuklu plakalar içinde ayrı ayrı koloniler Böl. kültür içinde 2 gün sonra bir 24 oyuklu plaka ve Kültür O / N her bir kuyu için RA 1 nm ekleyin. yüksek yanıt test etmek için bölüm 5.4 detaylı olarak LacZ boyama yapın. Güçlü ve muntazam müdahale belirlemek için iyi bir mikroskop altında her renk reaksiyonu gözünüzde canlandırın.
- Güçlü bir alt klon yanıtlayıcı belirlendikten sonra, diğer 24 plaka karşılık gelen kültür genişletin. Dahası, 10 cm'lik bir çanak o koloni genişletmek bölüm 2.3 detaylı olarak çeşitli şişeleri aşağı dondurmak ve diğer tüm sömürgeleri atın.
Not: Orijinal kolonilerin dörtte biri yüksek yanıt neden Sadece yaklaşık. Tipik olarak, alt klonlama ilk turda üniforma LacZ boyanma yol açmaz ve alt klonlama bir sonraki tur için yapılması gerekenüniforma güçlü müdahale elde.
Representative Results
F9 nadir LacZ haberci jelatin kaplı bir yüzey üzerinde yetiştirilen yapışkan bir embriyonik karsinoma hücre hattıdır. Raportör yapı hücreleri beta-galaktosidaz. 11,12,14,18 orantılı indüksiyon ile RA kantitatif yanıt sağlar. Bu hücreler, epitelyal morfoloji (Şekil 1A) görüntüler. 1:10 oranında 3 gün - için yüksek katlama oranı, hücrelerin her 2 bölünmesi tavsiye edilir. Bu raportör hücre hattı ile çalışma sırasında bile kültür ortamına G418 eklenmesi ile RA, bu hücrelerin yanıtı çok geçitler (sol Şekil 1B) ve bu raportör kapasitesini etkileyen sonra zayıflar gözledik Bu hücre hattı. duyarlılığının bu kayıp daha sonraki pasajlar da transgen kısmi kaybına bağlı olabilir. Bu periyodik alt klonlama RA kuvvetli ve düzgün müdahale için gerekli olduğu gibi (Şekil1B, sağ).
Bu hücre hattı, çeşitli kullanımları daha önce 12,14-18 yayınlanmış olsa da, burada rapor farklı genotipleri bireysel E8.5 embriyolardan endojen RA düzeylerini ölçmek için, bu hücre soyu kullanılmasıdır. Bölgesindeki Gpr161 il / il mutasyon sonucu 22 sinyal embriyonik RA azalmıştır. F9 nadir LacZ hücreleri ile ayrışmış embriyoların ko-kültür ile gösterildiği gibi, bu Gpr161 vl / il embriyolar, vahşi tip litermatında (Şekil 2A) ile karşılaştırıldığında, endojen RA azaltmıştır. Çünkü aynı zamanda burada rapor Bu raportör hücre hattı, çok yönlü yetişkin Gpr161 ağırlık / ağırlık olarak fareler (Şekil 2B) elde neurosphere kültürleri ile üretilen RA seviyesini tespit etmek için, bu hücrelerin yeni bir kullanımıdır. Bu muhabir hücre hattı endojen RA üreten erişkin omurilik kök hücrelerinden o neurosphere kültürleri göstermek mümkün oldu. Büyük farkboyama yoğunluğu değini E8.5 embriyolar göre omurilik neurospheres için daha büyük bir raportör hücre yanıtı göstermektedir. Bu, bağlı neurosphere kültürler E8.5 embriyolar daha homojen ve böylece daha fazla RA-üreten hücrelerin içermesi gerçeğine bağlı olabilir E8.5 embriyolar ile karşılaştırıldığında, zaman içinde neurospheres tarafından üretilen daha büyük RA seviyelerine bağlı olabilir.
raportör hücrelerinin doza-bağımlı bir lineer karşılık olarak en-RA sonuçlar farklı konsantrasyonlarda ilave edilmesi. Bu yanıt bir 610 nm'de absorbans okunarak kolorimetrik ölçülebilir. Oluşturulan standart eğri daha sonra, doğal tipte neurosphere kültürleri (Şekil 3A) ve E8.5 embriyolar (Şekil 3B) gibi örneklerde RA düzeylerini ölçmek için kullanılabilir.
Şekil 1. Bakımenance, F9 nadir LacZ Hücreler alt klonlama. (A) F9 NADİR-LacZ hücrelerinin bir faz-kontrast görüntü gösterilir. Bu hücreler, 10 saat bir katlama zaman ve her 3 günde bir geçmiş olması gerekir. - 1:10 oranında (yaklaşık 70% 80 izdiham) (B) ve daha sonra, LacZ-RA, 1 nM ilavesiyle kültürlerinin periyodik test boyama kültürleri RA (sağda) güçlü ve homojen müdahale kalmasını sağlamak için yapılmalıdır. fakir ve muntazam olmayan yanıt (sol) durumunda, alt klonlama gerçekleştirilmelidir. Ölçek 100 mikron barlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. LacZ Boyama Co-kültür Örnekleri (Dissosiye E8.5 Embriyolar / Neurospheres) ve F9 NADİR-LacZ hücrelerini. (A) E8.5 fare embriyo Çeşitli genotiplerinin s ayrılmış ve F9 nadir LacZ hücre üzerine plakalanmıştır. LacZ 24 saat boyama sonra ko-kültür örneklerinin tarafından üretilen endojen RA F9 NADİR-LacZ hücrelerinin tepki görselleştirme sağlar. Raportör hücrelerinin azalması tepki tarafından görüntülendi olarak azalmıştır endojen RA'da Gpr161 vl mutasyon sonuçları. (B) Sol. yetişkin omurilik, nöral kök hücre kültürlerinde neurospheres bir faz-kontrast görüntüsü gösterilmektedir. Sağ. Yetişkin Gpr161 ağırlık / ağırlık olarak omurilik türetilen Neurospheres ayrılmış ve F9 nadir LacZ hücre üzerine plakalanmıştır. LacZ boyama aşağıdaki mavi çökelti varlığı, bu neurospheres endojen RA varlığını gösterir. neurosphere ve E8.5 embriyo ko-kültürler arasında boyanma yoğunluğu farkı E8.5 embriyolar daha neurospheres RA mevcut büyük seviyelerini göstermektedir. Ölçek 100 mikron barlar.target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Standart eğri ve RA Düzeylerinin Kolorimetrik miktarının belirlenmesi. F9 nadir LacZ haberci hücre çizgisinin tepkisi standart ELISA plaka okuyucusu kullanılarak 610 nm de kolorimetrik ölçülebilir. (A) göreli RA seviyesini ölçmek için kullanılan bir standart eğri Örnek vahşi tip neurosphere kültürü s. Ko-kültürlenmiştir E8.5 embriyolardan göre RA seviyelerine (B) belirlenmesi. N = 3; * P <0.05, öğrencinin t-testi. Hata çubukları SEM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Stock Tamponlar / Çözümler | Bileşenler | Depolama koşulları |
| % 10 sodyum deoksikolat monohidrat (Cı 24 H 39 NaO 4 · H2O) | 100'in ml DH 2 O 10 ml | 4 ºC |
| 1 M magnezyum klorür (MgCI2) | RT | |
| 100x potasyum ferrosiyanür (K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 6 O) | 10 mi DH 2.12 g 2 O | Karanlıkta RT |
| 100x potasyum ferrisiyanür (K 3: [Fe (CN) 6]) | 10 mi dH 1.64 g 2 O | Karanlıkta RT |
| 20 mg / ml X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid) | 20 mg / ml stok çözelti yapmak için 5 ml dimetil formamid ilave | -20 ºC |
| 10 mM (3 mg / ml) her trretinoik asit ans | 16.67 ml mutlak etanol içinde, 50 mg çözülür. 1 ml'lik numuneler hazırlayın. | 1.5 ml amber mikrosantrifüj tüpleri karanlıkta -80 ºC, |
| papain | 7 ml HBSS bir flakon çözülür | 4 ºC |
Tablo 1. Tamponlar ve Çözüm bileşimler.
| Tamponlar / Çözümler Çalışma | Bileşenler | Depolama koşulları |
| F9 NADİR-LacZ hücre kültür ortamı | 50 ml cenin sığır serumu (FBS) (nihai konsantrasyon% 10) | Filtre-sterilize edin. |
| 5 mi 100X Penisilin Streptomisin (nihai konsantre 1X) | 4 ° C'de saklayın. | |
| 4mi 50 mg / ml G418 (son kons 0.4 mg / ml) | ||
| 500 ml DMEM / F-12 (L-glutamin ve HEPES) | ||
| % 0.2 jelatin | 25 mi% 2.0 jelatin | 4 ° C'de saklayın. |
| 80 ml saf su | ||
| İyice karıştırın | ||
| % 70 etanol | 30 ml% 95 etanol | sprey şişesinde yerleştirin. |
| 70 mL distile su | Oda sıcaklığında saklayın | |
| Neurosphere ayrıştırma ortamı | 1 mi 20U papain | her zaman taze hazırlayın |
| 100 ul 13 mg / ml tripsin | ||
| 100 ul 7 mg / ml hyaluronik asit | ||
| 28 ul 10 mg / ml DNasel | ||
| 50 ul 4 mg / ml kynurenic asit | ||
| Neurosphere kültür ortamı | DMEM / F-12 (L-glutamin ve HEPES) | her zaman taze hazırlayın |
| % 2 B-27 takviyesi | ||
| 20 ng / ml fibroblast büyüme faktörü (FGF) | ||
| 20 ng epidermal büyüme faktörü (EGF) | ||
| % 2.5 glutaraldehid | 250 ul% 50 glutaraldehid | her zaman taze hazırlayın |
| 4750 ul 1x PBS | ||
| LacZ yıkama çözeltisi | 0.5 ml% 10 deoksikolat (nihai konsantrasyon% 0.1) | 4 ° C'de saklayın. |
| 1.0 ml% 100 NP-40 (son derişim 0.2%) | ||
| 50 mi 10X PBS | ||
| 500 ml saf su | ||
| X-gal ile boyama çözeltisi | 1x potasyum Ferrosiyanat | her zaman taze hazırlayın |
| 1x potasyum ferrisiyanür | ||
| 1 mg / ml X-gal | ||
| Uygun hacme LacZ yıkama solüsyonu kullanarak | ||
| F9 NADİR-LacZ donma orta | F9 NADİR-LacZ kültür ortamı +% 5 DMSO | her zaman taze hazırlayın |
Tablo 2. Çalışma Tamponlar ve Çözüm kompozisyonlar.
Discussion
F9 nadir LacZ hücre çizgisi 14 doku eksplantlarında 12,14,17,18 tarafından üretilen RA saptanması için kullanılabilen bir güçlü bir sistemdir. RA 12,14,18 ile muamele edilmemiş hücreler tespit Resim spesifik olmayan bir tepki ile, 100 fM kadar düşük RA konsantrasyonlarda duyarlıdır. Ayrıca, raportör hücre dolayısıyla LacZ Reaksiyon ölçülmesi ve RA seviyelerine 12,14,18 büyüklüğünü belirlemek için kullanılabilir sağlayan konsantrasyon belirli bir aralık içinde doğrusal bir şekilde all-trans RA yanıt. Burada sunulan hızlı ve kolay RA muhabiri tahlil embriyo ve kültürlü yetişkin nöral kök hücrelerin görselleştirme (Şekil 2) ve bağıl kantitatif ölçümü (Şekil 3) için F9 NADİR-LacZ haberci hücre hattını kullanır. Bu muhabir sistem Şekil 2'de gösterildiği gibi bireysel örnekler arasında endojen RA seviyeleri, karşılaştırılmasına olanak sağlar. RA tespit edebilmek için yeterince duyarlıkültürlenmiş neurospheres (Şekil 2B) tarafından üretilen tek tek E8.5 embriyolar (Şekil 2A) ve RA tarafından oluşturulan. RA konsantrasyonları bu hücre hattının doza bağlı tepki örnekleri (Şekil 3B) arasındaki görece RA seviyelerinin örnekleri RA seviyelerine (Şekil 3A) miktarının yanı sıra, karşılaştırma için izin verir. F9 RARE raportör hücre hattı fırınlama süresi boyunca doku örnekleri tarafından üretilen RA toplam miktarını ölçen dikkat etmek önemlidir. Bu RA sentezi ve katabolizması net dengesi eşdeğerdir.
F9 NADİR-LacZ hücre muhabiri sistemi son derece hassas ve çok yönlü iken, biz bu sistemin güvenilirliğini sağlamak için dahil olması pek çok kritik sorun giderme adımları vardır. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, ilk, onlara g izin vermeden normal yolu ile bu hücrelerin sağlığını korumak için önemlidirbirleştirilmek üzere kürek. İkinci olarak, gözlemledik daha geçitler kültürler sürekli G418 ile seçim altında muhafaza bile, tutarsız RA yanıtlarına neden olma eğilimindedir. Bu sorunu gidermek için, 20 pasajlar sonra kültürleri atmak ve yeni bir flakon çözülme tavsiye edilir. Buna ek olarak, düzenli kontroller muhabiri hücreleri hala medyada RA varlığı güçlü yanıt olmasını sağlamak için yapılmalıdır. Üçüncü olarak, erken pasajlar güçlü yanıt (Şekil 1B, righ t) elde edilene kadar gerekli olabilir RA (sol Şekil 1B), bir ya da alt klonlama birkaç tur yoksul ya da düzgün olmayan tepki göstermek durumunda. Son olarak,-kültür birlikte önce, tür embriyo ve neurospheres doku örnekleri tek hücrelere ayrışmış önerilir. Biz daha tutarlı kolorimetrik ölçümlerde numunelerin sonuçları bu ayrışma gözlemlenmiştir. ayrışan hücreler uni gibi bu kültür kaynağında RA'nın daha düzgün bir dağılımı nedeniyle olabilirmuhabir hücreleri form temas.
Çeşitli modifikasyonlar orijinal protokole 14 yapılmıştır. İlk olarak, F9 nadir LacZ hücre RA yanıtı, hücreleri doğrudan doğruya sabitlenmesi ve 610 nm'deki soğurma gücü ölçülerek yerine hücrelerin toplanması ile B-galaktosidaz aktivitesi 14 lisat analiz edilmesi ile ölçüldü. Başka bir değişiklik RA tepkisinin ölçümü öncesinde F9 NADİR-LacZ ile ayrışmış numunelerin doğrudan ko-kültür olduğunu. Önceki yöntemler ayrı ayrı numune kültüre ve NADİR-LacZ 16,18 F9 bu kültürlerden sadece medya ekleyerek bildirdi.
onun varlık güçlü bir sisteme rağmen, F9 NADİR-LacZ haberci deneyi çeşitli sınırlamalar vardır. Bu raportör hücre hattının bir sınırlaması, all-trans RA varlığında güçlü bir şekilde tepki verir, ancak, aynı zamanda, 9-cis-RA ve 13-sis-RA dahil olmak üzere diğer retinoik asit izomerleri tepki gösterir; Ancak, tüm-trans RA iştigal daha duyarlı 100 kat olandiğer izomerler 18 kırmızı. Bu sistemin bir başka sınırlama doğrusal doza bağımlı tepki sadece 10 -7 10 -13 M arasında düşer ki M at-RA 14,18; Bu şekilde, bu sınırların dışında RA seviyelerini karşılaştıran, ölçümler, doğrusal aralığı içinde kadar numunenin bir seri seyreltme yapılması gerekli olabilir. Bu öncelikle bir kolorimetrik tahlil olduğundan Son olarak, renk geliştirme uç örnekleri ve deneyler arasında değişir. Bu nedenle, her zaman için, her bir deney için paralel olarak kaplama, bir standart eğri raportör hücre yanıtının ölçülmesi için kullanmak önemlidir.
Sonuç olarak, neurospheres olarak, daha önce bildirilmemiş, E8.5 embriyoların kantitatif RA seviyelerini ölçmek ve F9 NADİR-LacZ RA raportör hücre hattının kullanımını bildirmişlerdir. Bu raportör sistemi çok yönlülüğü hemen hemen herhangi bir hücre ya da doku tipi RA seviyelerinin ölçümü sağlar, ve m, olabiliray gelecekte çeşitli uygulamaların geliştirilmesi ile sonuçlanır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain | Jackson Laboratory | 000316 | |
| F9 RARE-LacZ reporter cell line | from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) | ||
| DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES) | ThermoFisher Scientific | 11330-057 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 °C for media preparation |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive |
| G418 | ThermoFisher Scientific | 10131-027 | Store at 4 °C; light-sensitive |
| 2% Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Store at 4 °C |
| B-27 supplement (2 % stock solution) | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation |
| Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1xPBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C |
| Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic | PeproTech | 450-33 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1x PBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C |
| 50% glutaraldehyde | Amresco | M155 | Store at 4 °C |
| Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O) | Sigma Aldrich | D5670 | Store at RT |
| X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside) | Promega | V3941 | Store stock at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 41639 | Store at RT |
| all-trans Retinoic Acid (at-RA) | Sigma Aldrich | R-2625 | Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12605-010 | Store at RT |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200-056 | alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | Store at 4 °C |
| 10x phosphate buffered solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Store at 4 °C |
| Papain | Worthington | LK003176 | Store at 4 °C. |
| Trypsin | Worthington | LS003703 | Store in 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Hyaluronic acid | Calbiochem | 385908 | Store 200 μl aliquots at -20 °C. |
| DNaseI | Worthington | LS002139 | Store in 200 μl aliquots at -20 °C |
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich | K3375 | Store in 200 μl aliquots at -20 °C |
| 95% ethanol | |||
| Mr. Frosty Freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| 10 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
| 10 cm culture dish (cell culture treated) | |||
| 6 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
| 96-well cell culture plates | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| 1.5 ml amber microcentrifuge tubes | |||
| 1.5 ml cryovials | |||
| 37 °C water bath | |||
| surgical scissors | |||
| fine surgical scissors | |||
| no. 5 forceps | |||
| blunt-ended forceps | |||
| scalpel blade | |||
| glass pasteur pipettes | |||
| cotton | |||
| alcohol lamp | |||
| ELISA plate reader | |||
| stereomicroscope |
References
- Vilhais-Neto, G. C., Pourquie, O.
- Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Science Signalling. 324, 1-3 (2006).
- Lane, M. A., Bailey, S. J. Role of retinoid signalling in the adult brain. Prog Neurobiol. 75 (4), 275-293 (2005).
- Maden, M. Retinoid signalling in the development of the central nervous system. Nat Rev Neurosci. 3 (11), 843-853 (2002).
- Maden, M. Retinoids and spinal cord development. J Neurobiol. 66 (7), 726-738 (2006).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Ang, H. L., Deltour, L., Hayamizu, T. F., Zgombic-Knight, M., Duester, G. Retinoic acid synthesis in mouse embryos during gastrulation and craniofacial development linked to class IV alcohol dehydrogenase gene expression. J Biol Chem. 271 (16), 9526-9534 (1996).
- Ang, H. L., Duester, G. Stimulation of premature retinoic acid synthesis in Xenopus embryos following premature expression of aldehyde dehydrogenase ALDH1. Eur J Biochem. 260, 227-234 (1999).
- Bastien, J., Rochette-Egly, C. Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes. Gene. 328, 1-16 (2004).
- Chatzi, C., Cunningham, T. J., Duester, G. Investigation of retinoic acid function during embryonic brain development using retinaldehyde-rescued Rdh10 knockout mice. Dev Dyn. 242 (9), 1056-1065 (2013).
- Sakai, Y., Drager, U. C. Detection of retinoic acid catabolism with reporter systems and by in situ hybridization for CYP26 enzymes. Methods Mol Biol. 652, 277-294 (2010).
- Yamamoto, M., Drager, U. C., McCaffery, P. A novel assay for retinoic acid catabolic enzymes shows high expression in the developing hindbrain. Dev Biol Res. 107, 103-111 (1998).
- Rossant, J., Zirngibl, R., Cado, D., Shago, M., Giguere, V. Expression of a retinoic acid response element-hsplacZ transgene defines specific domains of transcriptional activity during mouse embryogenesis. Genes & Dev. 5, 1333-1344 (1991).
- Wagner, M., Han, B., Jessel, T. M. Regional differences in retinoid release from embryonic neural tissue detected by an in vitro reporter assay. Development. 116, 55-66 (1992).
- Luo, T., Wagner, E., Crandall, J. E., Drager, U. C. A retinoic-acid critical period in the early postnatal mouse brain. Biol Psychiatry. 56 (12), 971-980 (2004).
- Luo, T., Wagner, E., Grun, F., Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the brain marks formation of optic projections, maturation of the dorsal telencephalon, and function of limbic sites. J Comp Neurol. 470 (3), 297-316 (2004).
- Kelley, M. W., Xu, X. M., Wagner, M. A., Warchol, M. E., Corwin, J. T. The developing organ of Corti contains retinoic acid and forms supernumerary hair cells in response to exogenous retinoic acid in culture. Development. 119, 1041-1053 (1993).
- McCaffery, P., Drager, U. C. Hot spots of retinoic acid synthesis in the developing spinal cord. Proc Natl Acad Sci. 91, 7194-7197 (1994).
- Hu, L., Gudas, L. J. Cyclic AMP analogs and retinoic acid influence the expression of retinoic acid receptor alpha, beta, and gamma mRNAs in F9 teratocarcinoma cells. Mol Cell Biol. 10 (1), 391-396 (1990).
- Martin, G. R.
- Strickland, S., Mahdavi, V. The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid. Cell. 15 (2), 393-403 (1978).
- Li, B. I., et al. The orphan GPCR, Gpr161, regulates the retinoic acid and canonical Wnt pathways during neurulation. Dev Biol. 402 (1), 17-31 (2015).
- Hogan, B., Constantini, F., Lacy, E. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 1st, Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Methods Mol Biol. 549, 91-101 (2009).
