Introduction
Retinsyre (RA) er en metabolit derivat af retinol eller vitamin A og er produceret gennem den sekventielle aktivitet af adskillige cellulære dehydrogenaser 1. På grund af sin amfifatisk kemiske natur, det passerer let lipidmembraner og kan fungere som en opløselig morfogenetisk faktor 1. Det er en væsentlig molekyle, der regulerer mange udviklingsmæssige og voksne cellulære processer ved at fungere som en ligand til nukleare retinoidreceptorerne og aktivere genekspression 2-10. Uden RA, disse RA receptorer (RAR) binder Rares i DNA og fungerer som repressorer; RA-binding til disse receptorer gør dem til transskriptionelle aktivatorer resulterer i målgenekspression 1,5,6.
Selv RA signalvejen er godt karakteriseret, den lille størrelse (~ 300 Da) og amfipatiske natur RA gør direkte histologisk visualisering og måling af RA øjeblikket teknisk muligt 11. Den eneste metode til direct måling af RA-niveauer er gennem isolering af RA fra vævsprøver ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC) 11. Denne metode kræver typisk store mængder af væv, lettere ved at samle forskellige prøver 12. Således er denne teknik dårligt egnede til måling af RA-niveauer i individuelle embryoer eller små mængder prøve / væv.
For at undersøge den cellulære funktion af RA er adskillige metoder blevet udviklet til indirekte udlede tilstedeværelsen af RA. Disse metoder gør brug af reporter, der indeholder den yderst responsive RAR-beta RARE driver ekspressionen af beta-galactosidase eller luciferase 11,13,14. Den transgene RARE-LacZ reporter mus genereret af Rossant et al. 13 er et ideelt system til visualisering spatiotemporale regioner i RA-signalering in situ 11,13,15,16 men er uegnet til kvantitative målinger. F9 RARE-LacZ-cellelinje 14, på than derimod er nyttig til påvisning af RA og kvantitative målinger af RA-niveauer i vævseksplantater 11,12,14,17,18.
F9 teratocarcinomceller udtrykker endogen alpha-, beta- og gamma-retinsyrereceptorer 19, og initiere differentiering til parietal endoderm efter udsættelse for RA 19-21. F9-celler har længe været etableret som en model for RA-induceret celledifferentiering, hvorfor det blev valgt som en ideel cellelinie til et RA reporter assay. F9-afledte Sil-15 RA reporter cellelinje genereret af Wagner et al. 14 indeholder et E. coli'LacZ genet nedstrøms for en kopi af 64 bp retinsyre responselement (RARE) af det humane beta-retinsyrereceptor (RAR-beta) genet. For at vælge og opretholde stabile kloner, konstruktionen indeholder også aminoglycosidphosphotransferase (NEO r) genet som en selekterbar markør i nærvær af G418. Denne konstrukt confers inducerbar ekspression af b-galactosidase i nærvær af RA, hvilket kan visualiseres gennem LacZ-farvning og denne reaktion kan være efterfølgende kvantificeres ved hjælp af kolorimetriske metoder 11,12,14,18.
Denne ekstremt alsidige reporter cellelinje har været meget anvendt i påvisning af endogene RA produktion gennem co-kultur af vævsprøver med reporter celler, såsom cochlear 17 og embryonale gulv plade eksplanteret 14. Desuden har denne reporter linje blevet anvendt til kvantificering af RA-niveauer i den udviklende rygmarv ved dyrkning puljede sektioner af embryonale rygmarv separat og tilsætte konditionerede medier fra disse kulturer til F9 RARE-LacZ-celler 18. Kvantificering blev udført efter LacZ-farvning gennem kolorimetrisk læsning under anvendelse af en standard ELISA pladelæser 11,12,18. Endelig har denne reporter cellelinie blevet anvendt til detektion af tilstedeværelsen af RA metaboliske enzymer ved styre projekng ændringer i RA-niveauer 12,18.
Her rapporterer vi at følsomheden af denne reporter cellelinie muliggør også måling af RA-niveauer frembragt fra individuelle samdyrket E8.5 embryoer. Dette muliggør sammenligning mellem individuelle embryoner af forskellige genotyper. Som et specifikt eksempel, Gpr161 er sjældne GPCR der regulerer neurulation delvis gennem RA-signalvejen 22, og vi rapporterer ved hjælp af denne reporter cellelinie for at undersøge virkningen af en recessiv mutation i Gpr161 (Gpr161 VL) på de samlede RA niveauer i Foster. Ud over dette, alsidighed og lethed-i-brug af denne reporter system tillader frihed til at måle og sammenligne RA-niveauer i forskellige vævsprøver, selv i neurosfære-kulturer opnået fra voksne rygmarven stamceller. Her beskriver vi den kvantitative bestemmelse af relative RA niveauer i embryoner og neurosfære kulturer gennem direkte co-kultur med F9 RARE-LacZ RA repOrter cellelinie.
Protocol
Alt dyr arbejde blev udført i henhold til godkendte Rutgers-RWJMS IACUC metoder.
1. Løsning og medier Forberedelse
- Tilberedes og bufferopløsninger som pr tabel 1. Forbered arbejdsopløsninger som pr tabel 2.
2. Kultur og vedligeholdelse af F9 RARE-LacZ Cells
- Optøning Frosne Cells
- Forbered F9 RARE-LacZ cellekulturmedium som beskrevet i tabel 2.
- Coat 10 cm dyrkningsskåle (cellekultur behandlet) med 10 ml 0,2% gelatine (se tabel 2) i 30 minutter ved stuetemperatur. Vask overskydende gelatine med to skylninger på 10 ml destilleret vand. Umiddelbart tilsættes 9 ml F9 RARE-LacZ cellekulturmedium i kolben at forhindre gelatinen tørrer.
- Optø et hætteglas med F9 RARE-LacZ-celler 14 i et 37 ° C vandbad til 2 - 3 min. Plate celler (ca. 1 x 10 6 celler / ml) i det overtrukne skålen containing 9 ml dyrkningsmedium. Dyrkning ved 37 ° C, 5% CO2. Skift medium den næste dag.
- Vedligeholdelse af F9 RARE-lacZ Celler
- Opretholde en regelmæssig passage hver 2 - 3 dage ved et forhold på 1:10.
Bemærk: Lad ikke cellerne vokse ind sammenflydning, da dette vil resultere i deres differentiering. - Split kulturerne ved en konfluens på 80-90%. Fjern medierne og vask cellerne med 10 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Fjern PBS og tilsæt 1 ml trypsin, inkuberes i 5 min. Tilføj 9 ml dyrkningsmedium, pipette op og ned og opdele celler 1:10 til passage.
- Opretholde en regelmæssig passage hver 2 - 3 dage ved et forhold på 1:10.
- Frysning F9 RARE-LacZ Cells
- Trypsinisér en 10 cm skål indeholdende F9 RARE-LacZ-celler ved 80 - 90% sammenløb som beskrevet i trin 2.2.2. Overfør dissocierede celler i et 15 ml centrifugerør og centrifugering ved 200 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml F9 RARE-LacZ freezing medium (se tabel 2). Portion 1 ml i mærkede kryoglas og overføre hætteglas i frysning containere. Placer frysning beholder i -80 ° C fryser O / N og overføre hætteglas til flydende nitrogen tanke næste dag.
3. Dissektion af E8.5 embryoer
- Parring Cage Opsætning og Plug Check
- Set-up en parring bur, der indeholder en parring par. Om morgenen den næste dag, så tjek for tilstedeværelsen af en vaginal prop og udpege den dag en plug findes som dag 0,5 23. På dag E8.5, høst embryoner.
- Dissektion af embryoner
- Sacrifice dæmningen gennem cervikal dislokation og spray det abdominale område med 70% ethanol (se tabel 2). Foretag en tværgående snit på huden over abdomen anvendelse af kirurgiske sakse og træk de to flapper fra hinanden (anterior og posterior) for at blotlægge den abdominale område. Lav et lignende snitpå bughinden at eksponere maven.
- Find uteri og frigivelse uteri fra æggelederne og mesometrium bruge en saks 23. Placer uteri i en 6 cm skål (ikke-cellekultur behandlet) med 10 ml 1x PBS til at vaske overskydende fedt og blod. Overførsel til en anden 6 cm skål indeholdende friske 10 ml 1x PBS.
- Separat én livmoderen, der indeholder et foster ved at skære det ud ved hjælp af kirurgiske sakse. Fjerne livmoderen og decidua og frigivelse blommesækken indeholdende embryoet bruger to par no. 5 pincet 23.
- Adskil blommesækken fra embryoet, og overføre blommesækken til et 1,5 ml mikrocentrifugerør for genomisk DNA-ekstraktion, der skal anvendes til genotypebestemmelse. Brug en P20 pipette med en bred-boring tip, overføre hele embryo i et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 10 pi trypsin. Glasset anbringes på is.
- Gentag trin 3.2.3 - 3.2.4, indtil alle embryoner er blevet dissekeret.
- Embryo Dissociation
- Inkubér 1,5 ml rør indeholdende embryoner i trypsin ved 37 ° C i 5 minutter for at lette enzymatisk dissociation.
- Dette findeles forsigtigt under anvendelse af en P20 pipette for mekanisk dissociation af embryonet, og pladen hele 10 pi volumen indeholdende en dissocieret embryo over en brønd af F9 RARE-LacZ-celler i en plade med 96 brønde (se trin 5.1 for udpladning F9 RARE-LacZ-celler i en plade med 96 brønde). Kultur O / N ved 37 ° C og 5% CO2.
- Inkubér 1,5 ml rør indeholdende embryoner i trypsin ved 37 ° C i 5 minutter for at lette enzymatisk dissociation.
4. laminektomi, Dissektion af Voksen Lumbar Spinal Cord og neurosfære Kultur
- laminektomi
- Sacrifice en voksen (P60) mus gennem cervikal dislokation.
- Spray den dorsale side med 70% ethanol og gøre en tværgående snit anvendelse af kirurgiske sakse. Træk begge flapper (forreste og bageste) fra hinanden for at eksponere ryggen og rygsøjlen.
- Anvendelse af kirurgiske sakse, trimme musklerne dækker rygsøjlen.Find den lumbale region i rygmarven, under ribbenene. Brug af saks, lave en dyb udskæring at bryde rygsøjlen på dette tidspunkt for at blotlægge rygmarven.
- Træk lænderegionen af rygsøjlen uden. 5 pincet således at den udsatte tværsnit af rygmarven vender forsøgslederen. Brug spidsen af fine sakse, snip ryghvirvel og muskler klokken 3 og klokken 9 positioner af den udsatte ende. Tag fat i dorsale klap af snittet ryghvirvel med pincet. Fortsæt disse nedskæringer kaudalt indtil længden af den lumbale rygmarv er udsat for.
- Slip rygmarven fra ryghvirvler hjælp no. 5 samt stumpendede pincet. Overfør rygmarven til et 15 ml rør indeholdende 3 ml DMEM / F12 dyrkningsmedium. Hold på is indtil alle lumbale rygmarv er blevet isoleret.
- Spinal Cord Dissektion
- Hæld dyrkningsmediet med rygmarven i en 6 cm skål (ikke-cellekultur behandlet).
- Under et stereomikroskop, fjerne dorsalrodsganglier og blodkar omkring rygmarven segment ved at tage fat ganglier og blodkar anvender to par nr. 5 pincet og forsigtigt at trække dem væk fra rygmarven. Overfør rygmarven segment til en 6 cm skål med ingen medium og hakkekød vævet fint under anvendelse af en skalpel.
- Overførsel hakket væv til 15 ml rør indeholdende 1 ml neurosfære dissociation medier (se tabel 2). Sætte rør på is og gentage trin 4.2.1 - 4.2.2, indtil alle rygmarv er blevet behandlet.
- Inkuber rør indeholdende hakket væv i dissociation medium ved 37 ° C i 10 minutter, flick røret på siden for at blande og derefter inkuberes ved 37 ° C i yderligere 10 min. Efter enzymatisk nedbrydning, tritureres med brand-poleret pipetter med faldende diametre for mekanisk dissociation.
Bemærk: Forbered brand-poleret pipetter med faldende diametre før udføre eksperimenter. Tag et glas Pasteurpipette og sæt den brede ende med rent bomuld. Ved hjælp af en alkohol lampe, brand polish spidsen af pipetter i flammen at skabe forskellige diametre: "regelmæssig", "fine", og "ekstra fine". For "almindelige" polerede pipetter, svinge enden af pipetten i flammen til runde af kanterne uden at reducere diameteren (~ 1 mm). Drej enden af pipetten i flammen i en lidt længere perioder for at skabe "fine" (~> 1 mm og> 5 mm diameter) og "ekstra fine" (~ 0,5 mm) polerede pipetter. Brug ikke pipetter med diametre under 0,5 mm.
- neurosfære Kultur
- Spin ned rør indeholdende dissocieret rygmarv væv ved 200 x g i 10 min. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml neurosfære dyrkningsmedier (se tabel 2). Tritureres med en P1,000 pipette efterfulgt af en P200 pipette for at lette dissociation.
Bemærk: Undgå at indføre bobler,hvilket ville falde cellelevedygtighed. - Transfer 10 pi dissocierede celler i et hæmocytometer og opnå en celletælling. Plate celler ved en densitet på 1x10 5/10 ml i en T25 kolbe med 10 ml neurosfære dyrkningsmedier. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 7 dage indtil neurosfærer vises 24.
- Spin ned rør indeholdende dissocieret rygmarv væv ved 200 x g i 10 min. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml neurosfære dyrkningsmedier (se tabel 2). Tritureres med en P1,000 pipette efterfulgt af en P200 pipette for at lette dissociation.
- neurosfære Dissociation
- Saml neurosfære kultur og overførsel til 15 ml rør. Spin ved 200 xg i 10 min. Fjerne det meste af supernatanten forlader 1 ml bag. Triturer med en P1,000 pipette til resuspender cellepelleten og dissociere neurosfærer i enkelte celler. Transfer 10 pi dissocierede celler i et hæmocytometer og få en celletælling.
- Plade 1 x 10 5 dissocierede neurosfære celler over en brønd af F9 RARE-LacZ i en plade med 96 brønde (se afsnit 5.1 for udpladning F9 RARE-LacZ i 96-brønds plade). Plade 3 brønde som replikater. Kultur O / N ved 37 ° C og 5% CO2.
5. RA Analyse af E8.5 embryoer og rygmarv Neurosfærer
- Plating F9 RARE-LacZ i 96-brønds plade
- En dag før høst E8.5 embryoer eller dissociation af neurosfærer, belægge en 96-brønds plade med 100 ul 0,2% gelatine per brønd i 30 minutter ved stuetemperatur. Aspirer ud gelatinen og skylles to gange med 200 pi destilleret vand.
- Trypsinisér F9 RARE-LacZ-celler opretholdt i 10 cm skåle som beskrevet i trin 2.2.2. Plade 1 x 10 5 celler / brønd F9-RARE LacZ-celler, men denne gang ved hjælp dyrkningsmedium uden G418.
- Forbered nok brønde til co-kultur af embryoner (-12 - 20 afhængigt af kuldstørrelse), neurosfærer (3 brønde / genotype) samt for en standardkurve i tre eksemplarer (27 brønde).
- Co-kultur af F9 RARE-LacZ og E8.5 embryoer eller rygmarven Neurosfærer
- Harvest embryoner som beskrevet i afsnit 3.2 og plade på toppen af F9RARE-LacZ i 96-brønds plade fra afsnit 5.1. På lignende måde, dissociere neurosfærer og plade oven på F9 RARE-LacZ i 96-brønds plade som beskrevet i trin 4.4. Kultur O / N ved 37 ° C og 5% CO2.
- Generering af en standardkurve
- For at generere en standardkurve, forberede alle-trans RA (at-RA) opløsninger med følgende koncentrationer: 100 nm, 10 nm, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM, ved seriel fortynding af at- RA lager (se tabel 1) med F9 RARE-LacZ dyrkningsmedium.
- Tilsæt 100 pi af disse forskellige ved-RA koncentrationer til F9 RARE-LacZ-celler fra afsnit 5.1. Tildel brønde indeholdende ubehandlet F9 RARE-LacZ-celler som negativ kontrol. Forbered triplikater af hver RA koncentration og negative kontrolbrønde. Kultur O / N ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: F9 RARE-LacZ celler reagerer på en dosis-afhængig lineært varierende koncentrationer af all-trans RA.
- RA Assay
- Efter O / N-kulturen af 96-brønds plade indeholdende faste kurver og co-kulturer, fjern mediet og løse kulturerne ved tilsætning af 100 pi 2,5% glutaraldehyd (se tabel 2) i 15 minutter, RT. Fjern fiksativ og vask to gange med 200 pi 1x PBS, 10 min per vask.
- Fjern PBS og vaskes tre gange med 200 pi af LacZ vaskeopløsning (se tabel 2), 10 min per vask. I tredje vask, forberede X-gal-farvning opløsning i et 15 ml rør pakket ind i folie (se tabel 2). Beregne, hvor meget farvningsopløsning er behov og forberede den passende mængde (200 pi / brønd).
Bemærk: X-gal-farvning løsning er lysfølsomt. Brug farvningsopløsningen inden for 15 minutter efter fremstilling. - Forbered et fugtigt kammer ved at placere en papirserviet fugtet med destilleret vand i en plastbeholder stor nok til at holde en plade med 96 brønde. Tilsæt 200 pi af Xgal farvningsopløsning per brønd af 96-brønds plade og placere pladen i et fugtigt kammer.
- Inkuber befugtet kammer indeholdende 96-brønds plade ved 37 ° C for at give mulighed for udvikling af blåfarvet bundfald. For E8.5 embryoer, inkuber pladen O / N (12 - 16 timer). For neurosfære kulturer inkuberes pladen i 4-8 timer.
- Læsning Absorbansen ved OD 610 og Imaging
- Efter farvereaktion, fjerne LacZ farvning løsning og erstatte med 200 pi 1x PBS. Absorbansen ved 610 nm under anvendelse af en standard ELISA pladelæser at kvantificere reporter respons på RA. Billede individuelle brønde med en standard stereomikroskop udstyret med et kamera.
6. Subkloning af F9 RARE-lacZ Celler
- Kontrol F9 RARE-LacZ rResponse til RA
- Før du starter nogen eksperimenter, teste respons F9 RARE-LacZ celler til RA. Plate F9 RARE-LacZ calen i 96-brønds plade (se afsnit 5.1), og der tilsættes 1 nM all-trans-retinsyre (se trin 5.3). Inkuber i et fugtigt kammer ved 37 ° CO / N.
- Visualiser udvikling af blå farvet bundfald ved hjælp af et mikroskop. Hvis farven udvikling ikke er ensartet i hele cellerne i brønden (se figur 1B, til venstre), udføre subkloning beskrevet nedenfor.
- Subkloning af F9 RARE-lacZ Celler
- Split F9 RARE-lacZ celler dyrket i 10 cm skåle som beskrevet i trin 2.2.2. I stedet for en 1:10 ratio, plade en lav seeding tæthed på 1 x 10 5 celler / 10 ml i en 10 cm skål for at tillade vækst af isolerede kolonier, således at hver koloni stammer fra en enkelt F9 RARE-LacZ celle.
- Efter to dage, frakke en 24-brønds plade med 500 pi 0,2% gelatine per brønd i 30 minutter. Fjern gelatineopløsning og skyl brøndene to gange med 500 pi destilleret vand. Erstat vand med 500 pi F9 RARE-LacZ cellekulturmedium.
- Vælg en koloni ved hjælp af en steril P10 pipettespids og overførsel til en godt; gøre dette 24 gange for at opnå 24 individuelle kolonier. Dyrkning ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 - 4 dage.
- Split de individuelle kolonier i to 24-brønds plader. Efter 2 dage i kultur, tilsættes 1 nM af RA til hver brønd i en plade og kultur 24 brønde O / N. Udfør LacZ farvning som beskrevet i afsnit 5.4 til at teste for høje respondenter. Visualisere farvereaktion af hver brønd under et mikroskop for at bestemme stærke og ensartede responders.
- Når en stærk subklon responder bestemmes, udvide den tilsvarende kultur fra den anden plade 24 brønde. Yderligere udvide denne koloni i en 10 cm skål, fryse ned flere hætteglas som beskrevet i afsnit 2.3, og kassér alle andre kolonier.
Bemærk: Kun omkring en fjerdedel af de oprindelige kolonier føre til høje responders. Typisk behøver den første runde af subkloning ikke medføre ensartet LacZ-farvning og en efterfølgende runde af subkloning skal gøres tilopnå ensartede stærke responders.
Representative Results
F9 RARE-LacZ reporter er en adhærent embryonisk karcinom cellelinie dyrket på gelatine-coatede overflade. Reporterkonstruktet tillader cellerne at reagere kvantitativt til RA med en proportional induktion af beta-galactosidase. 11,12,14,18. Disse celler udviser en epitelial morfologi (figur 1A). På grund af deres høje fordobling sats, anbefales det, at disse celler opdeles hver 2 - 3 dage ved et forhold på 1:10. Under vores arbejde med denne reporter cellelinie, har vi observeret, at selv med tilsætning af G418 i dyrkningsmediet, svaret af disse celler til RA svækker efter flere passager (figur 1B, til venstre), og dette kan påvirke reporter kapacitet denne cellelinie. Dette tab af respons kan skyldes delvist tab af transgenet på senere passager. Som sådan periodisk subkloning er nødvendigt at sikre stærke og ensartede responderer på RA (figur1B, til højre).
Selv om forskellige anvendelser af denne cellelinie er blevet tidligere offentliggjorte 12,14-18, rapporterede her er anvendelsen af denne cellelinie for at måle endogene RA niveauer fra individuelle E8.5 embryoer med forskellige genotyper. De Gpr161 vl / vl mutation resulterer i nedsat embryonal RA signalering 22. Som vist ved co-dyrkning af dissocierede embryoner med F9 RARE-LacZ-celler, har disse Gpr161 vl / vl embryoner reduceret endogen RA sammenlignet med vildtype-kuld (figur 2A). På grund af alsidigheden af denne reporter cellelinie også rapporteret her er en hidtil ukendt anvendelse af disse celler til påvisning RA niveauer produceret af neurosfære-kulturer opnået fra voksne Gpr161 vægt / vægt mus (figur 2B). Denne reporter cellelinie var i stand til at påvise, at neurosfære kulturer fra voksne rygmarven stamceller producere endogene RA. Den store difference i farvningsintensitet indikerer en større reporter celle respons på rygmarv neurosfærer i forhold til E8.5 embryoer. Dette kan skyldes langt større RA niveauer genereret af neurosfærer over tid sammenlignet med E8.5 embryoer, som kunne være på grund af det faktum, at neurosfære kulturer er mere homogen end E8.5 embryoer og dermed indeholde mere RA-producerende celler.
Tilsætning af forskellige koncentrationer af at-RA resulterer i en dosisafhængig lineær respons af reporter-celler. Denne reaktion kan måles kolorimetrisk ved aflæsning af absorbansen ved 610 nm. Den genererede standardkurve kan derefter anvendes til at kvantificere RA-niveauer i prøver, såsom i vildtype neurosfære-kulturer (figur 3A) eller E8.5 embryoer (figur 3B).
Figur 1. Maintenance og Subkloning af F9 RARE-LacZ Cells. (A) En fase-kontrast billede af F9 RARE-LacZ-celler er vist. Disse celler har en fordoblingstid på ~ 10 timer og skal bestås hver 3. dag. (Ca. 70 - med 80% konfluens) ved en 1:10 ratio (B) Periodisk afprøvning af kulturer med tilsætning af 1 nM at-RA og efterfølgende LacZ farvning skal gøres for at sikre kulturer forbliver stærke og ensartede respondenter til RA (højre). I tilfælde af fattige og uensartede respondenter (venstre), skal udføres subkloning. Scale bars 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. LacZ Farvning af Co-dyrkede Samples (Dissocierede E8.5 embryonerne / Neurosfærer) og F9 RARE-LacZ celler. (A) E8.5 mus embryo s af forskellige genotyper blev dissocieret og udpladet på toppen af F9 RARE-LacZ-celler. LacZ farvning 24 timers tillader senere visualisering af respons af F9 RARE-LacZ celler til endogen RA produceret af co-dyrkede prøver. Den Gpr161 vl mutation resulterer i nedsat endogen RA som visualiseret ved den reducerede respons reporter celler. (B) Venstre. Et fase-kontrast billede af neurosfærer dyrket fra voksne rygmarv neurale stamceller vises. Højre. Neurosfærer afledt fra voksne Gpr161 vægt / vægt rygmarv blev dissocieret og udpladet på toppen af F9 RARE-LacZ-celler. Tilstedeværelsen af blå bundfald efter LacZ farvning indikerer tilstedeværelsen af endogen RA i disse neurosfærer. Forskellen i farvning intensitet mellem neurosfære og E8.5 embryo co-kulturer indikerer højere niveauer af RA stede i neurosfærer end E8.5 embryoer. Scale bars 100 um.target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Standard Curve og kolorimetriske Kvantificering af RA Levels. Reaktionen fra F9 RARE-LacZ reporter cellelinie kan måles kolorimetrisk ved 610 nm under anvendelse af en standard ELISA pladelæser. (A) repræsentant standardkurve til kvantificering relative RA niveauer af vildtype neurosfære kultur s. (B) Kvantificering af relative RA niveauer fra co-dyrkede E8.5 embryoer. N = 3; * P <0,05, t-test. Fejllinjer SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Stock Buffere / Løsninger | komponenter | Opbevaringsbetingelser |
| 10% Natriumdeoxycholat monohydrat (C 24 H 39 NaO 4 · H2O) | 10 ml i 100 ml dH2O | 4 ºC |
| 1 M magnesiumchlorid (MgCl2) | RT | |
| 100x kaliumferrocyanid (K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 6 O) | 2,12 g i 10 ml dH2O | RT i mørke |
| 100x kaliumferricyanid (K 3 [Fe (CN) 6]) | 1,64 g i 10 ml dH2O | RT i mørke |
| 20 mg / ml X-gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) | der tilsættes 5 ml dimethylformamid til at gøre 20 mg / ml stamopløsning | -20 ºC |
| 10 mM (3 mg / ml) all-trans retinsyre | Opløs 50 mg i 16,67 ml absolut ethanol. Forbered 1 ml portioner. | -80 ºC i mørke, i 1,5 ml ravfarvet mikrocentrifugerør |
| Papain | opløse et hætteglas i 7 ml HBSS | 4 ºC |
Tabel 1. Buffere og Solution Kompositioner.
| Arbejde Buffere / Løsninger | komponenter | Opbevaringsbetingelser |
| F9 RARE-LacZ cellekulturmedium | 50 ml føtalt bovint serum (FBS) (slutkoncentration 10%) | Filter-sterilisere. |
| 5 ml 100x Penicillin Streptomycin (slutkonc 1X) | Opbevar ved 4 ºC. | |
| 4ml 50 mg / ml G418 (slutkoncentration 0,4 mg / ml) | ||
| til 500 ml DMEM / F-12 (med L-glutamin og HEPES) | ||
| 0,2% gelatine | 25 ml 2,0% gelatine | Opbevar ved 4 ºC. |
| 80 ml destilleret vand | ||
| Bland godt | ||
| 70% ethanol | 30 ml 95% ethanol | Sted i sprayflaske. |
| 70 ml destilleret vand | Opbevares ved stuetemperatur | |
| Neurosfære dissociation medium | 1 ml 20U papain | forberede frisk hver gang |
| 100 pi 13 mg / ml trypsin | ||
| 100 pi 7 mg / ml hyaluronsyre | ||
| 28 pi 10 mg / ml DNasel | ||
| 50 pi 4mg / ml kynurensyre | ||
| Neurosfære dyrkningsmedium | DMEM / F-12 (med L-glutamin og HEPES) | forberede frisk hver gang |
| 2% B-27 supplement | ||
| 20 ng / ml fibroblast vækstfaktor (FGF) | ||
| 20 ng epidermal vækstfaktor (EGF) | ||
| 2,5% glutaraldehyd | 250 pi 50% glutaraldehyd | forberede frisk hver gang |
| 4750 pi 1x PBS | ||
| LacZ vaskeopløsning | 0,5 ml 10% deoxycholat (slutkoncentration 0,1%) | Opbevar ved 4 ºC. |
| 1,0 ml 100% NP-40 (slutkoncentration 0,2%) | ||
| 50 ml 10X PBS | ||
| destilleret vand til 500 ml | ||
| X-gal-farvningsopløsning | 1x kaliumferrocyanid | forberede frisk hver gang |
| 1x kaliumferricyanid | ||
| 1 mg / ml X-gal | ||
| til passende volumen ved hjælp LacZ vaskeopløsning | ||
| F9 RARE-LacZ frysemedium | F9 RARE-LacZ dyrkningsmedium + 5% DMSO | forberede frisk hver gang |
Tabel 2. Arbejdsvilkår Buffere og Solution Kompositioner.
Discussion
F9 RARE-LacZ-cellelinje 14 er et kraftfuldt system, der kan anvendes til påvisning af RA produceret af vævseksplantater 12,14,17,18. Det er følsomt over RA koncentrationer så lave som 100 fM, med ingen ikke-specifik respons detekteres i celler ubehandlede med RA 12,14,18. Endvidere reporter-celler reagerer på all-trans RA lineært inden for et specifikt område af koncentration, hvilket således tillader LacZ reaktion kvantificeres og anvendes til at bestemme størrelsen af RA-niveauer 12,14,18. Den hurtige og lette RA reporter assay præsenteres her udnytter F9 RARE-LacZ reporter cellelinie til visualisering (figur 2) og relativ kvantitativ måling (figur 3) af embryoner og dyrkede voksne neurale stamceller. Denne reporter system tillader sammenligning af endogene RA niveauer mellem individuelle prøver, som vist i figur 2. Den er følsom nok til at kunne detektere RAgenereret af individuelle E8.5 embryoer (figur 2A) samt RA produceret af dyrkede neurosfærer (figur 2B). Den dosisafhængige respons af denne cellelinje til varierende koncentrationer af RA muliggør kvantificering af RA-niveauer (figur 3A) i prøverne samt sammenligning af relative RA-niveauer mellem prøverne (figur 3B). Det er vigtigt at bemærke, at F9 RARE reporter cellelinie måler den samlede RA genereret af vævsprøverne over inkubationstiden. Det svarer til nettobalancen for RA syntese og katabolisme.
Mens F9 RARE-LacZ celle reporter system er meget følsomt og alsidig, er der flere kritiske trin til fejlfinding, som vi har indarbejdet for at sikre pålideligheden af dette system. Først, som vist i figur 1, er det vigtigt at opretholde helbredet af disse celler ved regelmæssige passager uden at lade dem grække til konfluens. For det andet har vi observeret senere passager tendens til at resultere i inkonsistente RA reaktioner, selv om kulturerne konstant holdes under selektion med G418. Du kan foretage fejlfinding, anbefales det at kassere kulturer efter 20 passager og tø et nyt hætteglas. Desuden skal der udføres regelmæssig kontrol for at sikre, at de reporter celler er stadig stærke responders af tilstedeværelsen af RA i medierne. Tredje, hvis de tidlige passager vise dårlig eller uensartet respons på RA (figur 1B, venstre), en eller flere runder af subkloning kan være nødvendigt indtil stærke respondere opnås (figur 1B, righ t). før co-kultur, anbefales endelig, at vævsprøver såsom embryoer og neurosfærer dissocieres til enkeltceller. Vi har observeret, at dissociation af prøverne giver mere konsistente kolorimetriske målinger. Dette kan skyldes en mere jævn fordeling af RA i kulturbrøndene, som de dissocierede celler er i uniformular kontakt med reporter celler.
Adskillige modifikationer blev også foretaget den oprindelige protokol 14. Først blev RA respons F9 RARE-LacZ-celler kvantificeret ved direkte fiksering af cellerne og måling af absorbans ved 610 nm i stedet for at indsamle celler og analyse lysat i b-galactosidaseaktivitet 14. En anden ændring er den direkte co-dyrkning af dissocierede prøver med F9 RARE-LacZ før kvantificering af RA respons. Tidligere metoder rapporterede dyrkning prøver separat og tilføjer kun medier fra disse kulturer til F9 RARE-LacZ 16,18.
Trods det er et kraftfuldt system, F9 RARE-LacZ reporter assay har flere begrænsninger. En begrænsning ved denne reporter cellelinje er, at selv om det reagerer kraftigt til tilstedeværelsen af all-trans RA, det reagerer også på andre retinsyre isomerer, herunder 9-cis-RA og 13-cis-RA; de er imidlertid 100 gange mere følsomme over for all-trans RA virksomrød til de andre isomerer 18. En anden begrænsning til dette system er, at den lineære dosis-afhængige respons kun falder mellem 10 -13 M til 10 7M at-RA 14,18; Så hvis man sammenligner RA-niveauer uden for disse grænser, kan det være nødvendigt at udføre en seriel fortynding af prøven, indtil målingerne falder inden for det lineære område. Endelig da dette er primært en kolorimetrisk assay, vil endepunkt farveudvikling variere mellem prøver og eksperimenter. Således er det vigtigt, at en standardkurve altid udpladet parallelt for hver enkelt eksperiment for at bruge det til kvantificering af reporter cellerespons.
Som konklusion har vi beskrevet anvendelsen af F9 RARE-LacZ RA reporter cellelinie at måle RA niveauer kvantitativt i E8.5 embryoer og tidligere urapporteret, i neurosfærer. Alsidigheden af dette reportersystem kan tillade kvantificeringen af RA-niveauer i næsten enhver celle eller vævstype, og may resultere i udvikling af forskellige applikationer i fremtiden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain | Jackson Laboratory | 000316 | |
| F9 RARE-LacZ reporter cell line | from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) | ||
| DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES) | ThermoFisher Scientific | 11330-057 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 °C for media preparation |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive |
| G418 | ThermoFisher Scientific | 10131-027 | Store at 4 °C; light-sensitive |
| 2% Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Store at 4 °C |
| B-27 supplement (2 % stock solution) | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation |
| Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1xPBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C |
| Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic | PeproTech | 450-33 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1x PBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C |
| 50% glutaraldehyde | Amresco | M155 | Store at 4 °C |
| Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O) | Sigma Aldrich | D5670 | Store at RT |
| X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside) | Promega | V3941 | Store stock at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 41639 | Store at RT |
| all-trans Retinoic Acid (at-RA) | Sigma Aldrich | R-2625 | Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12605-010 | Store at RT |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200-056 | alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | Store at 4 °C |
| 10x phosphate buffered solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Store at 4 °C |
| Papain | Worthington | LK003176 | Store at 4 °C. |
| Trypsin | Worthington | LS003703 | Store in 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Hyaluronic acid | Calbiochem | 385908 | Store 200 μl aliquots at -20 °C. |
| DNaseI | Worthington | LS002139 | Store in 200 μl aliquots at -20 °C |
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich | K3375 | Store in 200 μl aliquots at -20 °C |
| 95% ethanol | |||
| Mr. Frosty Freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| 10 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
| 10 cm culture dish (cell culture treated) | |||
| 6 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
| 96-well cell culture plates | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| 1.5 ml amber microcentrifuge tubes | |||
| 1.5 ml cryovials | |||
| 37 °C water bath | |||
| surgical scissors | |||
| fine surgical scissors | |||
| no. 5 forceps | |||
| blunt-ended forceps | |||
| scalpel blade | |||
| glass pasteur pipettes | |||
| cotton | |||
| alcohol lamp | |||
| ELISA plate reader | |||
| stereomicroscope |
References
- Vilhais-Neto, G. C., Pourquie, O. Retinoic acid. Curr Biol. 18 (5), R191-R192 (2008).
- Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Science Signalling. 324, 1-3 (2006).
- Lane, M. A., Bailey, S. J. Role of retinoid signalling in the adult brain. Prog Neurobiol. 75 (4), 275-293 (2005).
- Maden, M. Retinoid signalling in the development of the central nervous system. Nat Rev Neurosci. 3 (11), 843-853 (2002).
- Maden, M. Retinoids and spinal cord development. J Neurobiol. 66 (7), 726-738 (2006).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Ang, H. L., Deltour, L., Hayamizu, T. F., Zgombic-Knight, M., Duester, G. Retinoic acid synthesis in mouse embryos during gastrulation and craniofacial development linked to class IV alcohol dehydrogenase gene expression. J Biol Chem. 271 (16), 9526-9534 (1996).
- Ang, H. L., Duester, G. Stimulation of premature retinoic acid synthesis in Xenopus embryos following premature expression of aldehyde dehydrogenase ALDH1. Eur J Biochem. 260, 227-234 (1999).
- Bastien, J., Rochette-Egly, C. Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes. Gene. 328, 1-16 (2004).
- Chatzi, C., Cunningham, T. J., Duester, G. Investigation of retinoic acid function during embryonic brain development using retinaldehyde-rescued Rdh10 knockout mice. Dev Dyn. 242 (9), 1056-1065 (2013).
- Sakai, Y., Drager, U. C. Detection of retinoic acid catabolism with reporter systems and by in situ hybridization for CYP26 enzymes. Methods Mol Biol. 652, 277-294 (2010).
- Yamamoto, M., Drager, U. C., McCaffery, P. A novel assay for retinoic acid catabolic enzymes shows high expression in the developing hindbrain. Dev Biol Res. 107, 103-111 (1998).
- Rossant, J., Zirngibl, R., Cado, D., Shago, M., Giguere, V. Expression of a retinoic acid response element-hsplacZ transgene defines specific domains of transcriptional activity during mouse embryogenesis. Genes & Dev. 5, 1333-1344 (1991).
- Wagner, M., Han, B., Jessel, T. M. Regional differences in retinoid release from embryonic neural tissue detected by an in vitro reporter assay. Development. 116, 55-66 (1992).
- Luo, T., Wagner, E., Crandall, J. E., Drager, U. C. A retinoic-acid critical period in the early postnatal mouse brain. Biol Psychiatry. 56 (12), 971-980 (2004).
- Luo, T., Wagner, E., Grun, F., Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the brain marks formation of optic projections, maturation of the dorsal telencephalon, and function of limbic sites. J Comp Neurol. 470 (3), 297-316 (2004).
- Kelley, M. W., Xu, X. M., Wagner, M. A., Warchol, M. E., Corwin, J. T. The developing organ of Corti contains retinoic acid and forms supernumerary hair cells in response to exogenous retinoic acid in culture. Development. 119, 1041-1053 (1993).
- McCaffery, P., Drager, U. C. Hot spots of retinoic acid synthesis in the developing spinal cord. Proc Natl Acad Sci. 91, 7194-7197 (1994).
- Hu, L., Gudas, L. J. Cyclic AMP analogs and retinoic acid influence the expression of retinoic acid receptor alpha, beta, and gamma mRNAs in F9 teratocarcinoma cells. Mol Cell Biol. 10 (1), 391-396 (1990).
- Martin, G. R. Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis. Science. 209 (4458), 768-776 (1980).
- Strickland, S., Mahdavi, V. The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid. Cell. 15 (2), 393-403 (1978).
- Li, B. I., et al. The orphan GPCR, Gpr161, regulates the retinoic acid and canonical Wnt pathways during neurulation. Dev Biol. 402 (1), 17-31 (2015).
- Hogan, B., Constantini, F., Lacy, E. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 1st, Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Methods Mol Biol. 549, 91-101 (2009).
