Introduction
Retinoïnezuur (RA) is een metaboliet derivaat van retinol of vitamine A en wordt vervaardigd door sequentiële activiteit van verscheidene cellulaire dehydrogenasen 1. Vanwege de amfifatische chemische aard, dat passeert gemakkelijk lipide membranen en kan fungeren als een oplosbaar morfogenetische factor 1. Het is een belangrijk molecuul dat vele ontwikkelings- en volwassen cellulaire processen reguleert door als een ligand voor retinoïde nucleaire receptoren en activeren genexpressie 2-10. Zonder RA, RA deze receptoren (RAR) binden Rareş in DNA en fungeren als onderdrukkers; RA binding aan deze receptoren verandert ze in transcriptieactievatoren resulteert in doelwit genexpressie 1,5,6.
Hoewel de RA signaleringsroute goed wordt gekenmerkt, het kleine formaat (~ 300 Da) en amfipatische aard van RA maakt directe histologische visualisatie en meting van RA momenteel technisch niet haalbaar 11. De enige methode voor direct meting van RA niveaus tot isolatie van RA van weefselmonsters met behulp van hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) 11. Deze methode vereist doorgaans grote hoeveelheden weefsel, gefaciliteerd door het samenbrengen van verschillende monsters 12. Dus deze techniek is slecht geschikt voor het meten van RA niveaus in individuele embryo's of kleine hoeveelheden monster / weefsel.
Om de cellulaire functie van RA onderzoeken, zijn verschillende werkwijzen ontwikkeld om indirect afleiden van de aanwezigheid van RA. Deze methoden maken gebruik van reporter systemen die de zeer gevoelige RAR-beta RARE de expressie van beta-galactosidase of luciferase 11,13,14. De transgene ZELDZAME LacZ reporter muis gegenereerd door Rossant et al. 13 is een ideaal systeem voor het visualiseren spatio-temporale gebieden van RA signalering in situ 11,13,15,16, maar is ongeschikt voor kwantitatieve metingen. De F9 RARE-LacZ cellijn 14, op thij daarentegen is nuttig voor de detectie van RA en kwantitatieve metingen van RA niveaus in weefselexplantaten 11,12,14,17,18.
F9 teratocarcinoomcellen endogene expressie alfa-, beta- en gamma-retinoïnezuur receptoren 19 en initiëren differentiatie in pariëtale endoderm na blootstelling aan RA 19-21. F9 cellen zijn al lang gevestigd als een model voor RA-geïnduceerde celdifferentiatie, dat is waarom het werd gekozen als een ideale cellijn voor een RA reporter assay. De F9 afgeleide Sil-15 RA reporter cellijn gegenereerd door Wagner et al. 14 bevat een E. coli'LacZ gen stroomafwaarts van een kopie van het 64-bp retinoïnezuur responselement (RARE) van het humane beta-retinoïnezuur receptor (RAR-beta) gen. Voor het selecteren en te onderhouden stabiele klonen, het construct bevat ook de aminoglycoside fosfotransferase (NEO r) gen als een selecteerbare merker in de aanwezigheid van G418. Dit construct confers induceerbare expressie van B-galactosidase in aanwezigheid van RA, die kan worden gevisualiseerd door middel van LacZ kleuring en deze reactie kunnen vervolgens worden gekwantificeerd onder toepassing van colorimetrische methoden 11,12,14,18.
Deze uiterst veelzijdige reporter cellijn is op grote schaal gebruikt bij de detectie van endogene RA productie tot co-kweek van weefselmonsters met de reporter cellen, zoals embryonale cochleaire 17 en bodemplaat 14 explantaten. Daarnaast heeft deze reporter lijn gebruikt voor het kwantificeren van RA niveaus in de ontwikkeling ruggenmerg door het kweken samengevoegde gedeelten van embryonale ruggenmerg afzonderlijk toevoegen van geconditioneerde media van deze kweken tot F9 RARE-LacZ cellen 18. Kwantificering werd uitgevoerd na LacZ kleuring door middel van colorimetrische lezen met behulp van een standaard ELISA plaatlezer 11,12,18. Tenslotte heeft deze reporter cellijn gebruikt bij de detectie van de aanwezigheid van RA metabolische enzymen door monitoring verandert in RA levels 12,18.
Hier melden wij dat de gevoeligheid van deze reporter cellijn maakt ook het meten van RA niveaus gegenereerd individueel samen gekweekt E8.5 embryo. Dit maakt de vergelijking van afzonderlijke embryo's van verschillende genotypen. Als een specifiek voorbeeld, Gpr161 een wees GPCR die neurulatie regelt mede door de RA signaalweg 22 en rapporteren we met deze reporter cellijn om het effect van een recessieve mutatie in Gpr161 (Gpr161 vl) op algemene RA niveaus in de onderzoeken embryo. Daarnaast wordt de veelzijdigheid en het gebruiksgemak van deze reporter systeem kan de vrijheid te meten en te vergelijken RA niveaus in verschillende weefselmonsters, zelfs in neurosfeerculturen verkregen uit volwassen ruggenmerg stamcellen. Hier beschrijven we de kwantitatieve bepaling van de relatieve RA niveaus in embryo's en neurosphere culturen via directe co-cultuur met de F9 RARE-LacZ RA reporter cellijn.
Protocol
Alle dierlijke werk werd gedaan op basis van goedgekeurde Rutgers-RWJMS IACUC methoden.
1. Solution en Media Voorbereiding
- Bereid voorraad en buffer oplossingen als per tabel 1. Bereid werkende oplossingen als per tabel 2.
2. Cultuur en onderhoud van F9 RARE-LacZ cellen
- Ontdooien bevroren cellen
- Bereid F9 RARE-LacZ celcultuurmedium als omschreven in tabel 2.
- Coat 10 cm kweekschalen (celcultuur behandeld) met 10 ml 0,2% gelatine (zie Tabel 2) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Afwassen overtollige gelatine met twee spoelingen van 10 ml gedestilleerd water. Onmiddellijk voeg 9 ml F9 RARE-LacZ celcultuurmedium in de kolf om de gelatine van uitdroging te voorkomen.
- Dooi een flacon van F9 RARE-LacZ cellen 14 in een 37 ° C waterbad gedurende 2-3 min. Plaat cellen (ongeveer 1 x 10 6 cellen / ml) in de gecoate schaal containing 9 ml kweekmedium. Kweken bij 37 ° C, 5% CO2. Verander het medium de volgende dag.
- Onderhoud van F9 RARE-LacZ cellen
- Bent regelmatig passage elke 2-3 dagen in een verhouding van 01:10.
Opmerking: Laat de cellen groeien tot confluentie, omdat dit zal resulteren in hun differentiatie. - Splits het kweken bij een confluentie van 80-90%. Verwijder het medium en was de cellen met 10 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS en voeg 1 ml trypsine, incubeer gedurende 5 min. Voeg 9 ml kweekmedium, pipet op en neer en split cellen 1:10 voor de passage.
- Bent regelmatig passage elke 2-3 dagen in een verhouding van 01:10.
- Invriezen F9 RARE-LacZ cellen
- Trypsinize een 10 cm schotel met F9 RARE-LacZ cellen bij 80-90% samenvloeiing zoals beschreven in stap 2.2.2. Breng de gedissocieerde cellen in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeren bij 200 g gedurende 5 min.
- Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in 10 ml F9 RARE-LacZ freezing medium (zie tabel 2). Aliquot 1 ml in gelabelde cryovials en overdracht flacons in het vriespunt containers. Plaats bevriezing container in -80 ° C vriezer O / N en overdracht flesjes tanks vloeibare stikstof de volgende dag.
3. Dissectie van E8.5 embryo's
- Paring Cage Set-up en Plug Controle
- Set-up van een paring kooi met één koppelen paar. De ochtend van de volgende dag, controleren op de aanwezigheid van een vaginale plug en wijzen de dag een stekker wordt gevonden als de dag 0,5 23. Op dag E8.5, oogst embryo's.
- Dissectie van embryo's
- Offer de dam door middel van cervicale dislocatie en spuit de buikstreek met 70% ethanol (zie tabel 2). Voeg een dwarse snede op de huid boven de buik behulp chirurgische schaar en trek de twee flappen uit elkaar (voorste en achterste) tegen het buikgebied bloot. Maak een soortgelijke cuthet peritoneum aan de buik bloot.
- Zoek de baarmoeders en laat baarmoeders van de eileiders en mesometrium met behulp van een schaar 23. Plaats de baarmoeders in een 6 cm schotel (non-celcultuur behandeld) met 10 ml 1x PBS om overtollig vet en bloed af te wassen. Transfer naar een andere 6 cm schaal met vers 10 ml 1x PBS.
- Aparte een baarmoeder met één embryo door te snijden uit met chirurgische schaar. Verwijder de baarmoeder en decidua en de dooierzak die de embryo u twee paar niet los. 5 pincet 23.
- Scheid de dooierzak van het embryo en de dooierzak overbrengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis voor genomisch DNA extractie wordt gebruikt voor genotypering. Gebruik een P20 pipet met brede boring tip, breng het hele embryo in een 1,5 ml microcentrifugebuis met 10 ul trypsine. Plaats de buis op ijs.
- Herhaal stap 3.2.3 - 3.2.4 tot alle embryo's werden ontleed.
- embryo Dissociatie
- Incubeer de 1,5 ml buisjes met embryo trypsine bij 37 ° C gedurende 5 min enzymatische dissociatie vergemakkelijken.
- Fijnstampen zachtjes met een P20 pipet voor mechanische dissociatie van het embryo en plaat het gehele 10 pl volume met een gedissocieerde embryo over één putje van F9 RARE-LacZ cellen in een 96-putjesplaat (zie stap 5.1 voor plateren F9 RARE-LacZ cellen in een 96-well plaat). Cultuur O / N bij 37 ° C en 5% CO2.
- Incubeer de 1,5 ml buisjes met embryo trypsine bij 37 ° C gedurende 5 min enzymatische dissociatie vergemakkelijken.
4. Laminectomie, Dissectie van volwassen lumbale ruggenmerg en neurosfeercultuur
- laminectomie
- Offer een volwassene (P60) muis door cervicale dislocatie.
- Spuit de dorsale kant met 70% ethanol en een dwarse snede behulp chirurgische schaar. Trek beide kleppen (voorste en achterste) uit elkaar om de rug en wervelkolom bloot te leggen.
- Met behulp van chirurgische schaar, trimmen van de spieren die de wervelkolom.Zoek de lumbale regio van het ruggenmerg, onder de ribben. Met de schaar, maken een diepe snede op de rug verbreken op die plaats en het ruggenmerg bloot.
- Trek de lumbale regio van de wervelkolom zonder. 5 forceps zodat de belichte dwarsdoorsnede van het ruggenmerg wordt geconfronteerd met de experimentator. Met de tips van fijne schaar, knip de wervel en spier op de 3 uur en 9 uur posities van het blootgestelde uiteinde. Pak de dorsale flap van de snede wervel met een tang. Blijven deze verlagingen caudaal tot de lengte van het lumbale ruggenmerg wordt blootgesteld.
- Laat het ruggenmerg van de wervels met behulp van niet. 5 en stompe uiteinden tang. Transfer het ruggenmerg naar een 15 ml buis met 3 ml DMEM / F12 kweekmedium. Blijf op ijs totdat alle lumbale ruggenmerg zijn geïsoleerd.
- Spinal Cord Dissection
- Giet het kweekmedium met het ruggenmerg in een 6 cm schotel (non-celcultuur behandeld).
- Onder een stereomicroscoop, verwijder de dorsale wortel ganglia en bloedvaten rond het koord segment spinale door grijpen de ganglia en bloedvaten met behulp van twee paren van niet. 5 pincet en voorzichtig los te trekken van het ruggenmerg. Breng de kabel segment spinale naar een 6 cm schotel zonder medium en gehakt het weefsel fijn met behulp van een scalpel.
- Overdracht gehakt weefsel 15 ml buisje met 1 ml neurosphere dissociatie media (zie tabel 2). Zet buis op ijs en herhaal de stappen 4.2.1 - 4.2.2 tot alle ruggenmerg zijn verwerkt.
- Incubeer buisjes met gehakt weefsel dissociatie medium bij 37 ° C gedurende 10 min, flick de buis aan de kant te mengen en incuberen bij 37 ° C gedurende nog 10 min. Na enzymatische afbraak, fijnstampen met vuur gepolijst pipetten van afnemende diameters voor de mechanische dissociatie.
Let op: Bereid brand-gepolijst pipetten van afnemende diameters voor het uitvoeren van experimenten. Neem een glas Pasteurpipet en sluit het brede uiteinde met schone katoen. Met een alcohol lamp, vuur polijsten de uiteinden van de pipetten in de vlam verschillende diameters maken: "normale", "fijne" en "extra fine". Voor "normale" gepolijst pipetten, draai het uiteinde van de pipet in de vlam ronde van de randen zonder het verminderen van de diameter (~ 1 mm). Draai het uiteinde van de pipet in de vlam van een iets langere perioden "fine" (~> 1 mm en> 5 mm diameter) en "extra fijn" (~ 0,5 mm) gepolijst pipetten maken. Niet pipetten gebruiken met een diameter kleiner dan 0,5 mm.
- neurosfeercultuur
- Spin down buizen die los ruggenmerg weefsel bij 200 g gedurende 10 min. Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in 1 ml neurosphere kweekmedium (zie tabel 2). Vermaal met een P1,000 pipet gevolgd door een P200 pipet dissociatie vergemakkelijken.
Opmerking: Vermijd het introduceren van bellen,die cellevensvatbaarheid zou verminderen. - Breng 10 pl van gedissocieerde cellen in een hemocytometer en het verkrijgen van een celgetal. Plaat cellen bij een dichtheid van 1x10 5/10 ml in een T25 kolf met 10 ml neurosphere kweekmedium. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 7 dagen tot 24 neurosferen weergegeven.
- Spin down buizen die los ruggenmerg weefsel bij 200 g gedurende 10 min. Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in 1 ml neurosphere kweekmedium (zie tabel 2). Vermaal met een P1,000 pipet gevolgd door een P200 pipet dissociatie vergemakkelijken.
- neurosphere Dissociatie
- Neurosfeercultuur verzamelen en overbrengen naar 15 ml buizen. Spin bij 200 xg gedurende 10 min. Verwijder het grootste deel van de bovenstaande vloeistof zodat er nog 1 ml achter. Vermaal met een P1,000 pipet naar de cel pellet opnieuw in suspensie en distantiëren neurospheres in enkele cellen. Overdracht 10 ul van gescheiden cellen in een hemocytometer en krijgen een celgetal.
- Plaat 1 x 10 5 gescheiden neurosphere cellen over een put van F9 RARE-LacZ in een 96-well plaat (zie paragraaf 5.1 voor plating F9 RARE-LacZ in 96-well plaat). Plate 3 putten als herhalingen. Cultuur O / N bij 37 ° C en 5% CO2.
5. RA Assay van E8.5 embryo's en Spinal Cord Neurosferen
- Plating F9 RARE-LacZ in 96-well plaat
- Eén dag vóór de oogst E8.5 embryo of dissociatie van neurosferen, laag een 96-wells plaat met 100 pl 0,2% gelatine per putje gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren de gelatine en spoel tweemaal met 200 gl gedestilleerd water.
- Trypsinize F9 RARE-LacZ cellen aangehouden in 10 cm schalen zoals beschreven in stap 2.2.2. Plaat 1 x 10 5 cellen / putje van F9-RARE LacZ cellen, maar dit keer met behulp van cultuur medium zonder G418.
- Bereid genoeg putjes co-kweek van embryo's (~ 12-20, afhankelijk van de worpgrootte), neurosferen (3 putjes / genotype) en een standaardcurve in drievoud (27 putjes).
- Co-cultuur van F9 RARE-LacZ en E8.5 embryo's of Spinal Cord Neurosferen
- Harvest embryo's zoals beschreven in paragraaf 3.2 en plaat op de top van F9RARE-LacZ in de 96-well plaat uit paragraaf 5.1. Op soortgelijke wijze dissociëren neurosferen en plaat bovenop F9 RARE-LacZ in de 96-well plaat zoals beschreven in stap 4.4. Cultuur O / N bij 37 ° C en 5% CO2.
- Het genereren van een Standard Curve
- Een standaardcurve bereiden all-trans RA (om-RA) oplossingen met de volgende concentraties: 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM door seriële verdunning van de grens RA voorraad (zie tabel 1) met F9 RARE-LacZ kweekmedium.
- Voeg 100 ul van deze verschillende bij RA-concentraties F9 RARE-LacZ cellen uit paragraaf 5.1. Wijs putjes die onbehandeld F9 RARE-LacZ cellen als negatieve controle. Bereid drievoud van elke RA concentratie en negatieve controleputjes. Cultuur O / N bij 37 ° C en 5% CO2.
Opmerking: F9 RARE-LacZ cellen reageren op een dosis-afhankelijke lineair variërende concentraties van all-trans RA.
- RA Assay
- Na O / N kweek van de 96-well plaat met de standaard curves en co-culturen, verwijder de media en de kweken te lossen door het toevoegen van 100 pi 2,5% glutaraldehyde (zie Tabel 2) gedurende 15 min, RT. Verwijder de fixerende en tweemaal wassen met 200 ul 1x PBS, 10 min per wasbeurt.
- Verwijder PBS en was driemaal met 200 ul van de LacZ wasoplossing (zie tabel 2), 10 min per wasbeurt. Tijdens de derde maal, bereidt de X-gal kleuroplossing in een 15 ml buis omwikkeld met folie (zie tabel 2). Berekenen hoeveel kleuroplossing nodig is en de voorbereiding van de juiste hoeveelheid (200 ul / putje).
Let op: X-gal kleuring oplossing is lichtgevoelig. Gebruik de kleuroplossing binnen 15 minuten na bereiding. - Bereid een bevochtigde kamer door een papieren doek bevochtigd met gedestilleerd water in een plastic container groot genoeg om een 96-wells plaat houden. Voeg 200 ul van de XGal kleuroplossing per putje van de 96-well plaat en plaats de plaat in een bevochtigde kamer.
- Incubeer vochtige kamer met de 96-puts plaat bij 37 ° C om voor de ontwikkeling van blauw gekleurde neerslag. Voor E8.5 embryo's, broeden de plaat O / N (12-16 uur). Voor neurosphere culturen, incubeer de plaat gedurende 4-8 uur.
- Het lezen van absorptie bij OD 610 en Imaging
- Na kleur reactie, verwijder de LacZ kleuroplossing en te vervangen door 200 ul 1x PBS. Meet de absorptie bij 610 nm onder toepassing van een standaard ELISA-plaatlezer om de reporter respons op RA kwantificeren. Afbeelding afzonderlijke putjes met een standaard stereomicroscoop uitgerust met een camera.
6. Subklonering van F9 RARE-LacZ cellen
- Controle F9 RARE-LacZ rResponse RA
- Voor het begin van experimenten, testen van de reactie van F9 RARE-LacZ cellen RA. Plaat F9 RARE-LacZ cells in 96-well plaat (zie paragraaf 5.1), en voeg 1 nM all-trans retinoïnezuur (zie stap 5.3). Incuberen in een bevochtigde kamer bij 37 ° CO / N.
- Visualiseer ontwikkeling van blauw gekleurde neerslag met behulp van een microscoop. Als kleurontwikkeling is niet gelijkmatig over de cellen in het putje (zie figuur 1B, links), voert subkloneren hieronder.
- Subklonering van F9 RARE-LacZ cellen
- Splits de F9 RARE-LacZ cellen gekweekt in 10 cm schalen zoals beschreven in stap 2.2.2. In plaats van een 01:10 verhouding, een plaat lage zaaidichtheid van 1 x 10 5 cellen / 10 ml in een 10 cm schaal om groei van geïsoleerde kolonies zodat elke kolonie voortvloeit uit een F9 RARE-LacZ cellen.
- Na twee dagen, laag een 24-putjes plaat met 500 pl 0,2% gelatine per putje gedurende 30 minuten. Verwijder gelatine-oplossing en tweemaal spoelen putten met 500 pi gedestilleerd water. Vervang water met 500 ul van F9 RARE-LacZ celkweekmedium.
- Kies een kolonie met een steriele P10 pipet en overdracht in een put; doen 24 keer tot 24 afzonderlijke kolonies te verkrijgen. Kweken bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 3-4 dagen.
- Verdeel de individuele kolonies in twee 24-well platen. Na 2 dagen in kweek, voeg 1 nM RA aan elk putje van een 24-wells plaat en cultuur O / N. Voer LacZ kleuring zoals beschreven in paragraaf 5.4 om te testen op hoge responders. Visualiseer kleur reactie van elk putje onder een microscoop om sterke en uniforme responders te bepalen.
- Zodra een sterke subkloon responder wordt bepaald, breiden de overeenkomstige cultuur van de andere 24-wells plaat. Verder uit te breiden dat de kolonie in een 10 cm schotel, bevriezen neer meerdere flacons zoals beschreven in paragraaf 2.3, en gooi alle andere koloniën.
Opmerking: slechts ongeveer een kwart van het oorspronkelijke kolonies leiden tot hoge responders. Meestal raakt de eerste ronde van subklonering niet tot uniform LacZ kleuring en een volgende ronde van subklonering moet worden gedaanbereiken uniform sterke responders.
Representative Results
De F9 RARE-LacZ reporter is een aanhanger embryonale carcinoma cellijn gekweekt op gelatine-gecoate oppervlak. De reporter construct laat de cellen kwantitatief reageren met RA een proportionele inductie van ß-galactosidase. 11,12,14,18. Deze cellen vertonen een epitheliale morfologie (figuur 1A). Vanwege hun hoge mate verdubbeling wordt aanbevolen deze cellen worden gesplitst om de 2-3 dagen in een verhouding van 01:10. Tijdens ons werk met deze reporter cellijn, hebben we waargenomen dat zelfs met de toevoeging van G418 in het kweekmedium, de respons van deze cellen RA verzwakt na een aantal passages (Figuur 1B, links), en dit kan de reporter capaciteit van affect deze cellijn. Dit verlies aan reactiviteit kan door gedeeltelijk verlies van het transgen op latere passages. Als zodanig periodieke subkloneren om te garanderen sterk en uniform responders RA (fig1B, rechts).
Hoewel verscheidene toepassingen van deze cellijn is eerder gepubliceerd 12,14-18, meldde hier is het gebruik van deze cellijn endogene RA niveaus individueel E8.5 embryo's met verschillende genotypen te meten. De Gpr161 vl / vl mutatie resulteert in verminderde embryonale RA signalering 22. Zoals getoond door co-kweek van gedissocieerd embryo's met F9 RARE-LacZ cellen, zijn deze Gpr161 vl / vl embryo endogene RA verminderd in vergelijking met wildtype nestgenoten (Figuur 2A). Door de veelzijdigheid van deze reporter cellijn, hier ook vermeld is een nieuwe toepassing van deze cellen aan RA niveaus door neurosfeerculturen verkregen uit volwassen Gpr161 wt / wt muizen (figuur 2B) detecteren. Deze reporter cellijn in staat was om aan te tonen dat neurosphere culturen van volwassen ruggenmerg stamcellen produceren endogene RA. De grote difference in intensiteit van kleuring duidt op een grotere reporter celrespons op ruggenmerg neurosferen ten opzichte van E8.5 embryo. Dit kan te wijten zijn aan veel grotere RA niveaus die door de neurosferen tijd vergeleken E8.5 embryo, mogelijk veroorzaakt door het feit dat neurosfeer culturen homogener dan E8.5 embryo en dus RA-cellen bevatten.
Toevoeging van verschillende concentraties van ten-RA leidt tot een dosisafhankelijke lineaire respons van de reporter cellen. Deze reactie kan colorimetrisch gemeten door het lezen van de absorptie bij 610 nm. De gegenereerde standaardkromme kan vervolgens worden gebruikt om RA niveaus in monsters, bijvoorbeeld in wildtype neurosfeerculturen (figuur 3A) en E8.5 embryo (figuur 3B) te kwantificeren.
Figuur 1. Maintenance en Subklonering van F9 RARE-LacZ cellen. (A) een fase-contrast beeld van F9 RARE-LacZ cellen wordt getoond. Deze cellen hebben een verdubbelingstijd van ~ 10 uur en wordt afgelegd om de 3 dagen. - In een 01:10 verhouding (ongeveer 70 80% confluentie) (B) Periodieke tests van kweken met toevoeging van 1 nM op-RA en daaropvolgende LacZ kleuring moet worden gedaan om ervoor te zorgen culturen blijven sterk en uniform responders RA (rechts). Bij slechte en ongelijkmatige responders (links), moet subkloneren worden uitgevoerd. Schaal bars 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. LacZ kleuring van Co-gekweekte Monsters (Gescheiden E8.5 embryo's / Neurosferen) en F9 RARE-LacZ cellen. (A) E8.5 muizenembryo s van de verschillende genotypen werden gescheiden en uitgestreken op de top van F9 RARE-LacZ cellen. LacZ kleuring 24 uur later maakt visualisatie van de respons van de F9 RARE-LacZ cellen om endogene RA door co-gekweekte monsters. De Gpr161 vl mutatie resulteert in verminderde endogene RA zoals gevisualiseerd door de verminderde respons van de reporter cellen. (B) Linker. Een fase-contrast beeld van neurospheres gekweekt van volwassen ruggenmerg neurale stamcellen wordt getoond. Rechts. Neurosferen verkregen van volwassen Gpr161 gew / gew ruggenmerg werden gedissocieerd en uitgeplaat bovenop F9 RARE-LacZ cellen. De aanwezigheid van blauwe neerslag na LacZ kleuring de aanwezigheid van endogene RA in deze neurosferen. Het verschil in kleuring intensiteit tussen neurosphere en E8.5 embryo co-culturen geven een grotere mate van RA aanwezig in neurospheres dan E8.5 embryo's. Schaalbalken 100 urn.target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. standaardkromme en colorimetrische Kwantificering van RA niveaus. De respons van de F9 RARE-LacZ reporter cellijn colorimetrisch gemeten bij 610 nm onder toepassing van een standaard ELISA plaatlezer. (A) Representatieve standaardcurve gebruikt om het relatieve niveau van RA kwantificeren wild-type neurosphere cultuur s. (B) Kwantificering van relatieve RA niveaus van co-gekweekte E8.5 embryo's. N = 3; * P <0,05, t-test van Student. Error bars SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Stock Buffers / Oplossingen | Components | Opslag condities |
| 10% natrium deoxycholaat monohydraat (C 24 H 39 NaO 4 · H 2 O) | 10 ml in 100 ml dH 2 O | 4 ºC |
| 1 M magnesiumchloride (MgCl2) | RT | |
| 100x kaliumferrocyanide (K 4 [Fe (CN) 6] · 3 H 6 O) | 2,12 g in 10 ml dH 2 O | RT in het donker |
| 100x kaliumferricyanide (K 3 [Fe (CN) 6]) | 1,64 g in 10 ml dH 2 O | RT in het donker |
| 20 mg / ml X-gal (5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Voeg 5 ml dimethylformamide bij 20 mg / ml voorraadoplossing maken | -20 ºC |
| 10 mM (3 mg / ml) al-trans retinoïnezuur | Los 50 mg in 16,67 ml absolute ethanol. Bereid 1 ml porties. | -80 ºC in het donker, in 1,5 ml amber microcentrifugebuizen |
| papaïne | ontbinden één flacon in 7 ml HBSS | 4 ºC |
Tabel 1. Buffers en oplossingssamenstellingen.
| Werken Buffers / Oplossingen | Components | Opslag condities |
| F9 RARE-LacZ celkweekmedium | 50 ml foetaal runderserum (FBS) (eindconcentratie 10%) | Filter-steriliseren. |
| 5 ml 100x penicilline streptomycine (uiteindelijke conc 1X) | Bewaren bij 4 ºC. | |
| 4ml 50 mg / ml G418 (eindconcentratie 0,4 mg / ml) | ||
| tot 500 ml DMEM / F-12 (met L-glutamine en HEPES) | ||
| 0,2% gelatine | 25 ml 2,0% gelatine | Bewaren bij 4 ºC. |
| 80 ml gedestilleerd water | ||
| Goed mengen | ||
| 70% ethanol | 30 ml 95% ethanol | Plaats in spray fles. |
| 70 ml gedestilleerd water | Bewaren bij RT | |
| Neurosphere dissociatie medium | 1 ml 20U papaïne | vers bereid elke keer |
| 100 gl 13 mg / ml trypsine | ||
| 100 gl 7 mg / ml hyaluronzuur | ||
| 28 ui 10 mg / ml DNasel | ||
| 50 gl 4 mg / ml kynureenzuur | ||
| Neurosphere kweekmedium | DMEM / F-12 (met L-glutamine en HEPES) | vers bereid elke keer |
| 2% B-27 supplement | ||
| 20 ng / ml fibroblast groeifactor (FGF) | ||
| 20 ng epidermale groeifactor (EGF) | ||
| 2,5% glutaaraldehyde | 250 pl 50% glutaaraldehyde | vers bereid elke keer |
| 4750 ul 1x PBS | ||
| LacZ wasoplossing | 0,5 ml 10% deoxycholaat (eindconcentratie 0,1%) | Bewaren bij 4 ºC. |
| 1,0 ml 100% NP-40 (eindconcentratie 0,2%) | ||
| 50 ml 10X PBS | ||
| gedestilleerd water tot 500 ml | ||
| X-gal kleuroplossing | 1x kaliumferrocyanide | vers bereid elke keer |
| 1x kaliumferricyanide | ||
| 1 mg / ml X-gal | ||
| passende volume met LacZ wasoplossing | ||
| F9 RARE-LacZ bevriezing medium | F9 RARE-LacZ kweekmedium + 5% DMSO | vers bereid elke keer |
Tabel 2. Werken Buffers en Solution Compositions.
Discussion
F9 ZELDZAME LacZ cellijn 14 is een krachtig systeem dat kan worden gebruikt voor detectie van RA door weefselexplantaten 12,14,17,18. Het is gevoelig voor RA concentraties van slechts 100 fM, zonder niet-specifieke respons gedetecteerd in onbehandelde cellen met RA 12,14,18. Bovendien is de reporter cellen reageren op alle trans-RA lineair binnen een bepaald concentratiebereik, zodat het LacZ reactie te kwantificeren en gebruikt om de grootte van RA niveaus 12,14,18 bepalen. De snelle en gemakkelijke RA reporter test hier gepresenteerde maakt gebruik van de F9 RARE-LacZ reporter cellijn voor visualisatie (figuur 2) en relatieve kwantitatieve meting (figuur 3) van de embryo's en neurale stamcellen gekweekte volwassen. Deze reporter systeem maakt vergelijking van RA endogene niveaus tussen individuele monsters, zie figuur 2. Het is gevoelig genoeg om te kunnen detecteren RAdie door afzonderlijke E8.5 embryo (Figuur 2A) en RA geproduceerd door gekweekte neurosferen (figuur 2B). De dosis-afhankelijke respons van deze cellijn in verschillende concentraties RA maakt de kwantificering van RA niveaus (figuur 3A) in de monsters en vergelijking van de relatieve niveaus RA tussen monsters (Figuur 3B). Het is belangrijk op te merken dat de F9 RARE reporter cellijn meet de totale bedrag van de RA die door de weefselmonsters over de incubatietijd. Dit is gelijk aan de netto saldo van RA synthese en afbraak.
Terwijl F9 RARE-LacZ cellen reporter systeem is zeer gevoelig en flexibel zijn er verschillende belangrijke stappen die we om de betrouwbaarheid van het systeem te verzekeren hebben opgenomen. Eerst, zoals getoond in figuur 1, is het belangrijk om de gezondheid van deze cellen door regelmatige passages te behouden zonder dat ze groeien tot samenvloeiing. Ten tweede hebben wij waargenomen later passages vaak incoherentie RA respons, zelfs wanneer de kweken constant gehandhaafd onder selectie met G418. Om deze problemen op te lossen, is het raadzaam om culturen gooi deze na 20 passages en ontdooien van een nieuw flesje. Bovendien moet regelmatig controles worden uitgevoerd om te waarborgen dat de reporter cellen nog sterk reageerden op de aanwezigheid van RA in de media. Ten derde, als de vroege passages tonen slecht of niet-uniforme reactie op RA (Figuur 1B, links), één of meer rondes van subklonering nodig zijn tot sterke responders worden verkregen (Figuur 1B, ch t). Tenslotte voorafgaand aan co-cultuur wordt aanbevolen weefselmonsters zoals embryo's en neurospheres gedissocieerd tot afzonderlijke cellen. We hebben dat dissociatie van de monsters leidt tot consistentere colorimetrische metingen waargenomen. Dit kan komen door een betere verdeling van RA in de kweekputjes, de gedissocieerde cellen in uniformulier contact met de reporter cellen.
Verschillende wijzigingen werden aangebracht in het oorspronkelijke protocol 14. Eerst, RA respons van de F9 RARE-LacZ cellen werden gekwantificeerd door directe vaststelling van de cellen en het meten van de absorptie bij 610 nm in plaats van het verzamelen en analyseren van cellen lysaat voor b-galactosidase activiteit 14. Een andere wijziging is de directe co-cultuur van gedissocieerde monsters met F9 RARE-LacZ voorafgaand aan kwantificering van RA reactie. Vorige methoden gemeld kweken monsters afzonderlijk en het toevoegen van alleen de media van deze culturen tot F9 RARE-LacZ 16,18.
Ondanks zijn dat een krachtig systeem, de F9 RARE-LacZ reporter assay heeft een aantal beperkingen. Een beperking van deze reporter cellijn is dat hoewel het sterk reageert op de aanwezigheid van all-trans RA, reageert ook andere retinezuur isomeren, waaronder 9-cis-RA en 13-cis-RA; ze zijn echter 100-voudig gevoeliger voor all-trans RA bedrijrode de andere isomeren 18. Een andere beperking van dit systeem is dat de lineaire dosis-afhankelijke respons alleen valt tussen 10 -13 M tot 10 M bij -7-RA 14,18; Dus als het vergelijken RA niveaus buiten deze grenzen, kan het nodig zijn om een seriële verdunning van het monster uit totdat de metingen binnen het lineaire bereik vallen. Slot, aangezien dit voornamelijk een colorimetrische test, het eindpunt van kleurontwikkeling zal variëren tussen monsters en experimenten. Aldus is het belangrijk dat een standaardcurve altijd uitgeplaat in parallel voor elk experiment om te gebruiken voor het kwantificeren van de reporter celrespons.
Tot slot hebben we melding gemaakt van het gebruik van het F9 RARE-LacZ RA reporter cellijn RA niveaus kwantitatief te meten in E8.5 embryo's en, niet eerder gemeld, in neurospheres. De veelzijdigheid van dit reportersysteem kan de kwantificatie van RA niveaus toe in vrijwel elke cel of weefseltype en may resulteren in de ontwikkeling van verschillende toepassingen in de toekomst.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain | Jackson Laboratory | 000316 | |
| F9 RARE-LacZ reporter cell line | from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) | ||
| DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES) | ThermoFisher Scientific | 11330-057 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 °C for media preparation |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive |
| G418 | ThermoFisher Scientific | 10131-027 | Store at 4 °C; light-sensitive |
| 2% Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Store at 4 °C |
| B-27 supplement (2 % stock solution) | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation |
| Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1xPBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C |
| Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic | PeproTech | 450-33 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1x PBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C |
| 50% glutaraldehyde | Amresco | M155 | Store at 4 °C |
| Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O) | Sigma Aldrich | D5670 | Store at RT |
| X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside) | Promega | V3941 | Store stock at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 41639 | Store at RT |
| all-trans Retinoic Acid (at-RA) | Sigma Aldrich | R-2625 | Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12605-010 | Store at RT |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200-056 | alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | Store at 4 °C |
| 10x phosphate buffered solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Store at 4 °C |
| Papain | Worthington | LK003176 | Store at 4 °C. |
| Trypsin | Worthington | LS003703 | Store in 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Hyaluronic acid | Calbiochem | 385908 | Store 200 μl aliquots at -20 °C. |
| DNaseI | Worthington | LS002139 | Store in 200 μl aliquots at -20 °C |
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich | K3375 | Store in 200 μl aliquots at -20 °C |
| 95% ethanol | |||
| Mr. Frosty Freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| 10 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
| 10 cm culture dish (cell culture treated) | |||
| 6 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
| 96-well cell culture plates | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| 1.5 ml amber microcentrifuge tubes | |||
| 1.5 ml cryovials | |||
| 37 °C water bath | |||
| surgical scissors | |||
| fine surgical scissors | |||
| no. 5 forceps | |||
| blunt-ended forceps | |||
| scalpel blade | |||
| glass pasteur pipettes | |||
| cotton | |||
| alcohol lamp | |||
| ELISA plate reader | |||
| stereomicroscope |
References
- Vilhais-Neto, G. C., Pourquie, O. Retinoic acid. Curr Biol. 18 (5), R191-R192 (2008).
- Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Science Signalling. 324, 1-3 (2006).
- Lane, M. A., Bailey, S. J. Role of retinoid signalling in the adult brain. Prog Neurobiol. 75 (4), 275-293 (2005).
- Maden, M. Retinoid signalling in the development of the central nervous system. Nat Rev Neurosci. 3 (11), 843-853 (2002).
- Maden, M. Retinoids and spinal cord development. J Neurobiol. 66 (7), 726-738 (2006).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Ang, H. L., Deltour, L., Hayamizu, T. F., Zgombic-Knight, M., Duester, G. Retinoic acid synthesis in mouse embryos during gastrulation and craniofacial development linked to class IV alcohol dehydrogenase gene expression. J Biol Chem. 271 (16), 9526-9534 (1996).
- Ang, H. L., Duester, G. Stimulation of premature retinoic acid synthesis in Xenopus embryos following premature expression of aldehyde dehydrogenase ALDH1. Eur J Biochem. 260, 227-234 (1999).
- Bastien, J., Rochette-Egly, C. Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes. Gene. 328, 1-16 (2004).
- Chatzi, C., Cunningham, T. J., Duester, G. Investigation of retinoic acid function during embryonic brain development using retinaldehyde-rescued Rdh10 knockout mice. Dev Dyn. 242 (9), 1056-1065 (2013).
- Sakai, Y., Drager, U. C. Detection of retinoic acid catabolism with reporter systems and by in situ hybridization for CYP26 enzymes. Methods Mol Biol. 652, 277-294 (2010).
- Yamamoto, M., Drager, U. C., McCaffery, P. A novel assay for retinoic acid catabolic enzymes shows high expression in the developing hindbrain. Dev Biol Res. 107, 103-111 (1998).
- Rossant, J., Zirngibl, R., Cado, D., Shago, M., Giguere, V. Expression of a retinoic acid response element-hsplacZ transgene defines specific domains of transcriptional activity during mouse embryogenesis. Genes & Dev. 5, 1333-1344 (1991).
- Wagner, M., Han, B., Jessel, T. M. Regional differences in retinoid release from embryonic neural tissue detected by an in vitro reporter assay. Development. 116, 55-66 (1992).
- Luo, T., Wagner, E., Crandall, J. E., Drager, U. C. A retinoic-acid critical period in the early postnatal mouse brain. Biol Psychiatry. 56 (12), 971-980 (2004).
- Luo, T., Wagner, E., Grun, F., Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the brain marks formation of optic projections, maturation of the dorsal telencephalon, and function of limbic sites. J Comp Neurol. 470 (3), 297-316 (2004).
- Kelley, M. W., Xu, X. M., Wagner, M. A., Warchol, M. E., Corwin, J. T. The developing organ of Corti contains retinoic acid and forms supernumerary hair cells in response to exogenous retinoic acid in culture. Development. 119, 1041-1053 (1993).
- McCaffery, P., Drager, U. C. Hot spots of retinoic acid synthesis in the developing spinal cord. Proc Natl Acad Sci. 91, 7194-7197 (1994).
- Hu, L., Gudas, L. J. Cyclic AMP analogs and retinoic acid influence the expression of retinoic acid receptor alpha, beta, and gamma mRNAs in F9 teratocarcinoma cells. Mol Cell Biol. 10 (1), 391-396 (1990).
- Martin, G. R. Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis. Science. 209 (4458), 768-776 (1980).
- Strickland, S., Mahdavi, V. The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid. Cell. 15 (2), 393-403 (1978).
- Li, B. I., et al. The orphan GPCR, Gpr161, regulates the retinoic acid and canonical Wnt pathways during neurulation. Dev Biol. 402 (1), 17-31 (2015).
- Hogan, B., Constantini, F., Lacy, E. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 1st, Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Methods Mol Biol. 549, 91-101 (2009).
