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Neuroscience

E8.5 भ्रूण और neurosphere संस्कृतियों में सापेक्ष retinoic एसिड स्तर के मात्रात्मक मापन F9 दुर्लभ lacZ सेल आधारित रिपोर्टर परख का उपयोग

Published: September 6, 2016 doi: 10.3791/54443
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1,2
1Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Rutgers University, 2Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers University
* These authors contributed equally

Introduction

Retinoic एसिड (आरए) retinol या विटामिन ए की एक मेटाबोलाइट व्युत्पन्न है और कई सेलुलर डीहाइड्रोजनेज 1 के अनुक्रमिक गतिविधि के माध्यम से उत्पादन किया है। इसकी amphiphatic रासायनिक प्रकृति के कारण, यह आसानी से लिपिड झिल्ली पार और एक घुलनशील मॉर्फ़ोजेनेटिक कारक 1 के रूप में कार्य कर सकते हैं। यह एक आवश्यक अणु है कि परमाणु retinoid रिसेप्टर्स के लिए एक ligand के रूप में अभिनय और जीन अभिव्यक्ति 2-10 सक्रिय द्वारा कई विकासात्मक और वयस्क सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है। आरए के बिना, इन आरए रिसेप्टर्स (RARs) डीएनए और repressors के रूप में कार्य में बाँध rares; आरए इन रिसेप्टर्स के लिए बाध्य उन्हें ट्रांसक्रिप्शनल लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति 1,5,6 में जिसके परिणामस्वरूप activators में बदल जाता है।

हालांकि आरए संकेतन मार्ग में अच्छी तरह से पहचाना जाता है, छोटे आकार (~ 300 दा) और रा के amphipathic प्रकृति प्रत्यक्ष ऊतकीय दृश्य और वर्तमान में आरए की माप तकनीकी रूप से अव्यावहारिक 11 में आता है। दीर के लिए एकमात्र तरीकाआरए के स्तर की माप ect उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) 11 का उपयोग ऊतकों के नमूनों से Ra के अलगाव के माध्यम से होता है। यह प्रक्रिया आम तौर विभिन्न नमूनों 12 पूलिंग द्वारा सुविधा के ऊतकों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है। इस प्रकार, इस तकनीक खराब व्यक्तिगत भ्रूण या नमूना / ऊतक की छोटी मात्रा में आरए स्तर की माप के लिए अनुकूल है।

आदेश आरए के सेलुलर समारोह की जांच करने के लिए, कई तरीकों का परोक्ष रूप से आरए की उपस्थिति अनुमान करने के लिए विकसित किया गया है। इन विधियों संवाददाता दुर्लभ अत्यधिक संवेदनशील RAR-बीटा बीटा galactosidase या luciferase 11,13,14 की अभिव्यक्ति ड्राइविंग युक्त सिस्टम का इस्तेमाल करते हैं। ट्रांसजेनिक दुर्लभ lacZ रिपोर्टर रोसंट एट अल। 13 से उत्पन्न माउस सीटू 11,13,15,16 में आरए सिगनल के spatiotemporal क्षेत्रों visualizing के लिए एक आदर्श व्यवस्था है लेकिन मात्रात्मक मापन के लिए अनुपयुक्त है। F9 दुर्लभ lacZ सेल लाइन 14, टी परवह दूसरी ओर, ऊतक explants 11,12,14,17,18 में आरए और आरए स्तरों के मात्रात्मक मापन का पता लगाने के लिए उपयोगी है।

F9 teratocarcinoma कोशिकाओं, अंतर्जात अल्फा बीटा व्यक्त करते हैं, और गामा-retinoic एसिड रिसेप्टर्स 19, और आरए 19-21 से संपर्क के बाद पार्श्विका एण्डोडर्म में भेदभाव आरंभ करें। F9 कोशिकाओं लंबे आरए प्रेरित सेलुलर भेदभाव के लिए एक मॉडल है, यही वजह है कि यह एक आरए संवाददाता परख के लिए एक आदर्श सेल लाइन के रूप में चुना गया था के रूप में स्थापित किया गया है। F9 व्युत्पन्न एसआईएल-15 आरए संवाददाता सेल। वैगनर एट अल द्वारा उत्पन्न लाइन 14 एक ई होता है coli'LacZ जीन 64-बीपी retinoic एसिड प्रतिक्रिया तत्व मानव बीटा retinoic एसिड रिसेप्टर (RAR-बीटा) जीन की (दुर्लभ) की एक प्रति के बहाव। आदेश का चयन और स्थिर क्लोन बनाए रखने के लिए, निर्माण भी G418 की उपस्थिति में एक चयन मार्कर के रूप में अमिनोग्लाईकोसाइड phosphotransferase (NEO आर) जीन होता है। इस का निर्माण सहआरए की उपस्थिति है, जो lacZ धुंधला के माध्यम से देखे जा सकते हैं में बी-galactosidase की inducible अभिव्यक्ति nfers और इस प्रतिक्रिया के बाद हो सकता है वर्णमिति तरीकों 11,12,14,18 का उपयोग मात्रा।

यह अत्यंत बहुमुखी संवाददाता सेल लाइन व्यापक रूप से इस तरह के कर्णावत 17 और भ्रूण मंजिल प्लेट explants 14 के रूप में संवाददाता कोशिकाओं, ऊतकों के नमूनों के साथ सह-संस्कृति के माध्यम से अंतर्जात आरए उत्पादन का पता लगाने में इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, इस संवाददाता लाइन अलग से भ्रूण रीढ़ की हड्डी डोरियों की जमा वर्गों संवर्धन और F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं 18 करने के लिए इन संस्कृतियों से वातानुकूलित मीडिया जोड़कर विकासशील रीढ़ की हड्डी में आरए स्तर की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया है। मात्रा का ठहराव एक मानक एलिसा प्लेट रीडर का उपयोग कर 11,12,18 वर्णमिति पढ़ने के माध्यम से lacZ धुंधला के बाद किया गया था। अन्त में, इस संवाददाता सेल लाइन monitori द्वारा आरए चयापचय एंजाइमों की उपस्थिति का पता लगाने में इस्तेमाल किया गया हैएनजी आरए स्तरों 12,18 में बदल जाता है।

यहाँ हम रिपोर्ट है कि इस संवाददाता सेल लाइन की संवेदनशीलता भी व्यक्ति सह सुसंस्कृत E8.5 भ्रूण से उत्पन्न आरए के स्तर की माप के लिए अनुमति देता है। यह अलग जीनोटाइप के व्यक्तिगत भ्रूण के बीच तुलना में सक्षम बनाता है। एक विशिष्ट उदाहरण के रूप में, Gpr161 एक अनाथ GPCR कि आरए संकेतन मार्ग 22 के माध्यम से हिस्से में neurulation को नियंत्रित करता है, और हम में समग्र आरए स्तरों पर Gpr161 (Gpr161 वीएल) में एक अप्रभावी उत्परिवर्तन के प्रभाव की जांच करने के लिए इस संवाददाता सेल लाइन का उपयोग कर रिपोर्ट भ्रूण। इस के अलावा, बहुमुखी प्रतिभा और आसानी से उपयोग इस संवाददाता प्रणाली की स्वतंत्रता को मापने और, विभिन्न ऊतकों के नमूनों में आरए स्तर की तुलना वयस्क रीढ़ की हड्डी की स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त neurosphere संस्कृतियों में भी करने की अनुमति देता है। यहाँ हम F9 दुर्लभ lacZ आरए प्रतिनिधि के साथ प्रत्यक्ष सह संस्कृति के माध्यम से भ्रूण और neurosphere संस्कृतियों में रिश्तेदार आरए स्तर की मात्रात्मक निर्धारण का वर्णनorter सेल लाइन।

Protocol

सभी जानवर काम को मंजूरी दे दी रटगर्स-RWJMS IACUC तरीकों के अनुसार किया गया था।

1. समाधान और मीडिया तैयारी

  1. प्रति 1 टेबल के रूप में शेयर और बफर समाधान तैयार करें। प्रति 2 टेबल के रूप में काम कर समाधान तैयार करें।

2. संस्कृति और F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं के रखरखाव

  1. विगलन जमे हुए कोशिकाओं
    1. के रूप में 2 टेबल में विस्तृत F9 दुर्लभ lacZ सेल संस्कृति के माध्यम से तैयार करें।
    2. कोट 10 सेमी संस्कृति व्यंजन 0.2% जिलेटिन की 10 मिलीलीटर के साथ (सेल संस्कृति इलाज) आरटी पर 30 मिनट के लिए (2 टेबल देखें)। आसुत जल 10 मिलीलीटर की दो rinses के साथ अतिरिक्त जिलेटिन से धो लें। इसके तत्काल बाद सूखने से जिलेटिन को रोकने के लिए फ्लास्क में F9 दुर्लभ lacZ सेल संस्कृति के माध्यम से 9 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. 3 मिनट - 2 के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में F9 दुर्लभ lacZ 14 कोशिकाओं की एक शीशी पिघलना। प्लेट कोशिकाओं (लगभग 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) लेपित पकवान सी मेंसंस्कृति के माध्यम से 9 मिलीलीटर ontaining। 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति, 5% सीओ 2। अगले दिन मध्यम बदलें।
  2. F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं के रखरखाव
    1. 1:10 के अनुपात में 3 दिन - एक नियमित रूप से पारित होने को बनाए रखने के लिए हर 2।
      नोट: मत देना कोशिकाओं confluency में बढ़ने के रूप में यह उनका भेदभाव का परिणाम देगा।
    2. 80-90% की एक confluency पर संस्कृतियों विभाजित। मीडिया निकालें और (पीबीएस) 1x फॉस्फेट बफर खारा के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें। पीबीएस निकालें और trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, 5 मिनट के लिए सेते हैं। ऊपर और नीचे और विभाजन कोशिकाओं 01:10 पारित होने के लिए संस्कृति के माध्यम से, पिपेट के 9 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. F9 दुर्लभ lacZ प्रकोष्ठों बर्फ़ीली
    1. 80 में F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं से युक्त एक 10 सेमी पकवान Trypsinize - 90% संगम के रूप में कदम 2.2.2 में विस्तृत जानकारी दी। 5 मिनट के लिए 200 XG पर एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और स्पिन में अलग कोशिकाओं स्थानांतरण।
    2. F9 दुर्लभ lacZ एफ के 10 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली निकालेंreezing मध्यम (2 टेबल देखें)। अशेष लेबल cryovials और ठंड कंटेनरों में हस्तांतरण शीशियों में 1 मिलीलीटर। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर हे / एन और हस्तांतरण तरल नाइट्रोजन टैंक को शीशियों में ठंड कंटेनर अगले दिन रखें।

3. E8.5 भ्रूण के विच्छेदन

  1. संभोग पिंजरे सेट-अप और प्लग की जाँच
    1. सेट-अप एक संभोग जोड़ी युक्त एक संभोग पिंजरे। अगले दिन की सुबह, एक योनि प्लग की उपस्थिति के लिए जाँच करें और दिन को नामित एक प्लग 0.5 23 दिन के रूप में पाया जाता है। दिन E8.5, फसल भ्रूण पर।
  2. भ्रूण के विच्छेदन
    1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से बांध बलिदान और स्प्रे 70% इथेनॉल के साथ पेट क्षेत्र (2 टेबल देखें)। एक अनुप्रस्थ पेट शल्य कैंची का उपयोग करके उपरोक्त त्वचा पर कटौती करें और पेट क्षेत्र बेनकाब करने के लिए दो फ्लैप के अलावा (पूर्वकाल और कूल्हों) खींच। एक समान कटौती करेंपेरिटोनियम पर पेट बेनकाब करने के लिए।
    2. ग्रीवा जानें और oviducts से ग्रीवा जारी है और कैंची 23 वर्ष की एक जोड़ी का उपयोग mesometrium। एक 6 सेमी पकवान 10 मिलीलीटर के साथ (गैर सेल में इलाज संस्कृति) में ग्रीवा की जगह 1x पीबीएस अतिरिक्त वसा और रक्त को धोने के लिए। एक और 6 सेमी पीबीएस 1x ताजा 10 मिलीलीटर युक्त डिश के लिए स्थानांतरण।
    3. अलग से एक यह बंद काटने शल्य कैंची का उपयोग करके एक भ्रूण युक्त गर्भाशय। गर्भाशय और पत्या निकालें और भ्रूण कोई दो के जोड़े का उपयोग युक्त जर्दी थैली जारी। 5 संदंश 23।
    4. भ्रूण से अलग जर्दी थैली, और जीनोटाइपिंग के लिए प्रयोग की जाने वाली जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब जर्दी थैली हस्तांतरण। एक विस्तृत बोर टिप के साथ एक P20 पिपेट का प्रयोग करें, trypsin के 10 μl युक्त एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में पूरे भ्रूण हस्तांतरण। बर्फ पर ट्यूब रखें।
    5. दोहराएँ कदम 3.2.3 - 3.2.4 जब तक सभी भ्रूण विच्छेदित कर दिया गया है।
  3. भ्रूण हदबंदी
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर trypsin में भ्रूण युक्त 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों सेते 5 मिनट एंजाइमी हदबंदी की सुविधा के लिए के लिए।
      1. Triturate धीरे भ्रूण के यांत्रिक हदबंदी के लिए एक P20 pipettor का उपयोग, और पूरे 10 μl एक 96 अच्छी तरह से थाली में F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं में से एक अच्छी तरह से एक अलग भ्रूण युक्त मात्रा प्लेट (चढ़ाना F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं के लिए कदम 5.1 देखें एक 96 अच्छी तरह से थाली में)। संस्कृति ओ / एन 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ 2।

4. Laminectomy, वयस्क के विच्छेदन काठ का रीढ़ की हड्डी और neurosphere संस्कृति

  1. laminectomy
    1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से एक वयस्क (P60) माउस बलिदान।
    2. 70% इथेनॉल के साथ पृष्ठीय पक्ष स्प्रे और एक अनुप्रस्थ कटौती शल्य कैंची का उपयोग कर सकते हैं। दोनों फ्लैप (पूर्वकाल और कूल्हों) खींचो अलावा पीठ और कशेरुका स्तंभ बेनकाब करने के लिए।
    3. शल्य कैंची का उपयोग करना, रीढ़ की हड्डी को कवर करने की मांसपेशियों को बंद ट्रिम।रीढ़ की हड्डी की काठ का क्षेत्र जानें, पसलियों के नीचे। कैंची का प्रयोग, इस बिंदु पर रीढ़ तोड़ने के लिए एक गहरा घाव रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए बनाते हैं।
    4. कोई साथ रीढ़ की काठ का क्षेत्र ऊपर खींचो। 5 संदंश इतना है कि रीढ़ की हड्डी के संपर्क में अनुप्रस्थ अनुभाग प्रयोगकर्ता का सामना करना पड़ रहा है। ठीक कैंची के सुझावों का उपयोग, उजागर अंत के 3 बजे के और 9 बजे पदों पर बांस और मांसपेशियों धज्जी। संदंश के साथ कटौती बांस के पृष्ठीय फ्लैप समझ। इन कटौती दुमदारी जारी रखें जब तक काठ का रीढ़ की हड्डी की लंबाई के संपर्क में है।
    5. उपयोग नहीं कर कशेरुकाओं से रीढ़ की हड्डी में रिलीज। 5 के साथ ही समाप्त हो गया कुंद संदंश। DMEM / F12 संस्कृति के माध्यम से 3 मिलीग्राम से युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए रीढ़ की हड्डी स्थानांतरण। जब तक सभी काठ का रीढ़ की हड्डी डोरियों पृथक किया गया है बर्फ पर रखें।
  2. रीढ़ की हड्डी विच्छेदन
    1. एक 6 सेमी डिश में रीढ़ की हड्डी के साथ संस्कृति के माध्यम डालो (गैर सेल संस्कृति इलाज)।
    2. एक stereomicroscope के तहत, कोई दो जोड़े का उपयोग कर ganglia और रक्त वाहिकाओं लोभी द्वारा पृष्ठीय रूट ganglia और रीढ़ की हड्डी खंड के आसपास रक्त वाहिकाओं को हटा दें। 5 संदंश और धीरे से उन्हें रीढ़ की हड्डी से दूर खींच रहा है। कोई माध्यम के साथ एक 6 सेमी डिश के लिए रीढ़ की हड्डी खंड स्थानांतरण और ऊतक कीमा सूक्ष्मता से एक छुरी ब्लेड का उपयोग कर।
    3. 15 मिलीलीटर neurosphere हदबंदी मीडिया के 1 मिलीलीटर युक्त ट्यूब स्थानांतरण कीमा बनाया हुआ ऊतक (2 टेबल देखें)। बर्फ और दोहराने पर ट्यूब रखो कदम 4.2.1 - 4.2.2 जब तक सभी रीढ़ की हड्डी डोरियों संसाधित किया गया है।
    4. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हदबंदी माध्यम में कीमा बनाया हुआ ऊतक युक्त ट्यूबों सेते हैं, की ओर ट्यूब मिश्रण करने के लिए झटका और फिर एक और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। enzymatic पाचन, यांत्रिक हदबंदी के लिए व्यास को कम करने की आग पॉलिश pipettes साथ Triturate के बाद।
      नोट: प्रयोगों प्रदर्शन करने से पहले व्यास को कम करने की आग पॉलिश pipettes तैयार करें। एक गिलास पाश्चर ले लोपिपेट और स्वच्छ कपास के साथ व्यापक अंत प्लग। एक शराब दीपक का उपयोग करना, आग पॉलिश लौ में pipettes के सुझावों के विभिन्न व्यास बनाने के लिए: "नियमित रूप से", "ठीक है", और "अतिरिक्त ठीक"। "नियमित रूप से" पॉलिश pipettes के लिए, व्यास (~ 1 मिमी) घटते बिना किनारों के दौर के लिए लौ में पिपेट के अंत घुमाव। "ठीक" (~> 1 मिमी और> 5 मिमी व्यास) और "अतिरिक्त ठीक" (~ 0.5 मिमी) पॉलिश pipettes बनाने के लिए एक से थोड़ा लंबी अवधि के लिए लौ में पिपेट के अंत घुमाएँ। 0.5 मिमी से कम व्यास के साथ pipettes का प्रयोग न करें।
  3. neurosphere संस्कृति
    1. स्पिन नलियों युक्त 10 मिनट के लिए 200 XG पर रीढ़ की हड्डी के ऊतकों अलग। Neurosphere संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली निकालें (2 टेबल देखें)। एक P1,000 पिपेट एक P200 पिपेट द्वारा पीछा किया हदबंदी की सुविधा के लिए के साथ Triturate।
      नोट: शुरू करने के बुलबुले से बचें,जो सेल व्यवहार्यता कम होगा।
    2. एक hemocytometer में अलग कोशिकाओं के 10 μl हस्तांतरण और एक कोशिका गिनती प्राप्त करते हैं। Neurosphere संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ एक T25 फ्लास्क में 1x10 5/10 एमएल के घनत्व पर प्लेट कोशिकाओं। 7 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2 तक neurospheres दिखाई 24।
  4. neurosphere हदबंदी
    1. neurosphere संस्कृति लीजिए और 15 एमएल ट्यूबों के लिए स्थानांतरण। 10 मिनट के लिए 200 XG पर स्पिन। सतह पर तैरनेवाला 1 मिलीलीटर के पीछे छोड़ने के सबसे निकालें। एक P1,000 विंदुक के साथ Triturate सेल गोली resuspend और एकल कक्षों में neurospheres अलग कर देना। एक hemocytometer में अलग कोशिकाओं के 10 μl हस्तांतरण और एक कोशिका गिनती मिलता है।
    2. प्लेट 1 एक्स 10 5 एक 96 अच्छी तरह से थाली (96 अच्छी तरह से थाली में F9 दुर्लभ lacZ चढ़ाना के लिए खंड 5.1 देखें) में F9 दुर्लभ lacZ में से एक अच्छी तरह से अधिक neurosphere कोशिकाओं अलग। प्लेट प्रतिकृति के रूप में 3 कुओं। संस्कृति ओ / एन 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ 2।

5. E8.5 भ्रूण और रीढ़ की हड्डी Neurospheres की आरए परख

  1. चढ़ाना F9 96 अच्छी तरह से थाली में दुर्लभ lacZ
    1. एक दिन कटाई E8.5 भ्रूण या neurospheres की हदबंदी करने से पहले, कोट आरटी पर 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति 0.2% जिलेटिन की 100 μl के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली। जिलेटिन बाहर महाप्राण और आसुत जल के 200 μl के साथ दो बार कुल्ला।
    2. के रूप में कदम 2.2.2 में विस्तृत Trypsinize F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं 10 सेमी बर्तन में बनाए रखा। प्लेट 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं, लेकिन इस बार G418 के बिना संस्कृति के माध्यम का उपयोग कर।
    3. , Neurospheres (3 कुओं / जीनोटाइप) के साथ ही के लिए तीन प्रतियों में एक मानक वक्र (27 कुओं) - भ्रूण के सह संस्कृति (20, कूड़े आकार पर निर्भर करता है ~ 12) के लिए पर्याप्त कुओं तैयार करें।
  2. F9 दुर्लभ lacZ और E8.5 भ्रूण या रीढ़ की हड्डी Neurospheres के सह-संस्कृति
    1. हार्वेस्ट भ्रूण F9 के शीर्ष पर धारा 3.2 और प्लेट में विस्तृत रूप मेंधारा 5.1 से 96 अच्छी तरह से थाली में दुर्लभ lacZ। इसी तरह, 96 अच्छी तरह से थाली कदम 4.4 में विस्तृत रूप में F9 दुर्लभ lacZ के शीर्ष पर neurospheres और थाली को अलग कर देना। संस्कृति ओ / एन 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ 2।
  3. एक मानक वक्र उत्पन्न
    1. 100 एनएम, 10 एनएम, 1 एनएम, 100 बजे, 10 बजे, 1 बजे, 100 एफएम, पर- के धारावाहिक कमजोर पड़ने से: एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए निम्न सांद्रता के साथ (कम-आरए) सब पार आरए समाधान तैयार आरए शेयर (1 टेबल देखें) F9 दुर्लभ lacZ संस्कृति के माध्यम से।
    2. धारा 5.1 से F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं को सांद्रता-आरए पर इन विभिन्न के 100 μl जोड़ें। इलाज F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं के रूप में नकारात्मक नियंत्रण युक्त कुओं निरुपित। प्रत्येक आरए एकाग्रता और नकारात्मक नियंत्रण कुओं की triplicates तैयार करें। संस्कृति ओ / एन 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ 2।
      नोट: F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं सब पार आरए की सांद्रता में परिवर्तन के लिए एक खुराक पर निर्भर रेखीय ढंग से जवाब।
  4. आरए परख
    1. 96 अच्छी तरह से थाली मानक घटता है और सह संस्कृतियों युक्त हे / एन संस्कृति के बाद, मीडिया को हटाने और 2.5% glutaraldehyde के 100 μl जोड़कर संस्कृतियों को ठीक 15 मिनट, आरटी के लिए (2 टेबल देखें)। लगानेवाला निकालें और पीबीएस 1x 200 μl, धोने प्रति 10 मिनट के साथ दो बार धो लें।
    2. पीबीएस निकालें और lacZ धोने के समाधान के 200 μl के साथ तीन बार धोने, धोने प्रति 10 मिनट (2 टेबल देखें)। तीसरे धोने के दौरान, पन्नी में लपेटा एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक्स-लड़की धुंधला समाधान तैयार (2 टेबल देखें)। गणना कितना धुंधला समाधान की जरूरत है और उचित मात्रा में (200 μl / अच्छी तरह से) तैयार करते हैं।
      नोट: एक्स-लड़की धुंधला समाधान प्रकाश के प्रति संवेदनशील है। तैयारी के बाद 15 मिनट के भीतर धुंधला समाधान का प्रयोग करें।
    3. एक प्लास्टिक कंटेनर काफी बड़ा एक 96 अच्छी तरह से थाली में धारण करने के लिए एक कागज तौलिया आसुत जल के साथ घटा रखकर एक humidified कक्ष तैयार करें। एक्स के 200 μl जोड़े96 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से -gal धुंधला समाधान और एक humidified कक्ष में थाली जगह है।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह से थाली युक्त नीले रंग का वेग के विकास के लिए अनुमति देने के लिए humidified कक्ष सेते हैं। (- 16 घंटा 12) E8.5 भ्रूण के लिए, थाली हे / एन सेते हैं। 8 घंटा - neurosphere संस्कृतियों के लिए, 4 के लिए थाली सेते हैं।
  5. आयुध डिपो के 610 और इमेजिंग पर absorbance पढ़ना
    1. रंग प्रतिक्रिया के बाद, lacZ धुंधला समाधान निकालने और पीबीएस 1x 200 μl के साथ बदलें। 610 एनएम पर absorbance के उपाय रा के रिपोर्टर प्रतिक्रिया यों के लिए एक मानक एलिसा प्लेट रीडर का उपयोग। छवि व्यक्तिगत एक मानक एक कैमरा से लैस stereomicroscope का उपयोग कुओं।

6. F9 दुर्लभ lacZ प्रकोष्ठों के subcloning

  1. जांच की जा रही F9 दुर्लभ lacZ रा के rResponse
    1. किसी भी प्रयोगों शुरू करने से पहले, आरए के लिए F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का परीक्षण करें। प्लेट F9 दुर्लभ lacZ ग96 अच्छी तरह से थाली में एल (धारा 5.1 देखें), और 1 एनएम सब पार retinoic एसिड (कदम 5.3 देखें) जोड़ें। 37 डिग्री सीओ / एन पर एक humidified कक्ष में सेते हैं।
    2. नीले रंग का एक माइक्रोस्कोप का उपयोग वेग के विकास कल्पना। अगर रंग विकास में अच्छी तरह से कोशिकाओं भर में एक समान नहीं है (देखें चित्र 1 बी, बाएं), नीचे विस्तृत subcloning प्रदर्शन करते हैं।
  2. F9 दुर्लभ lacZ प्रकोष्ठों के subcloning
    1. के रूप में कदम 2.2.2 में विस्तृत F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं 10 सेमी बर्तन में सुसंस्कृत विभाजित। 1:10 अनुपात के बजाय, एक 10 सेमी डिश में 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / 10 मिलीलीटर की एक कम बोने घनत्व थाली ऐसी है कि प्रत्येक कॉलोनी में एक एकल F9 दुर्लभ lacZ सेल से उठता अलग कालोनियों के विकास के लिए अनुमति देने के लिए।
    2. दो दिनों के बाद, कोट 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति 0.2% जिलेटिन की 500 μl के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली। जिलेटिन समाधान निकालें और कुओं आसुत जल 500 μl के साथ दो बार कुल्ला। F9 दुर्लभ lacZ सेल संस्कृति के माध्यम से 500 μl के साथ पानी बदलें।
    3. एक कॉलोनी में अच्छी तरह से एक में एक बाँझ P10 विंदुक टिप और हस्तांतरण का उपयोग उठाओ; 24 अलग-अलग कालोनियों प्राप्त करने के लिए इस 24 गुना है। 4 दिन - 37 डिग्री सेल्सियस, 3 के लिए 5% सीओ 2 संस्कृति।
    4. दो 24 अच्छी तरह प्लेटों में अलग-अलग कालोनियों विभाजित। संस्कृति में 2 दिनों के बाद, एक 24 अच्छी तरह से थाली और संस्कृति ओ / एन की एक अच्छी तरह से आरए के 1Nm जोड़ें। धारा 5.4 में विस्तृत उच्च responders के लिए परीक्षण करने के लिए lacZ धुंधला प्रदर्शन करना। प्रत्येक के रंग प्रतिक्रिया कल्पना अच्छी तरह से एक खुर्दबीन के नीचे मजबूत और वर्दी responders निर्धारित करने के लिए।
    5. एक बार एक मजबूत subclone प्रत्युत्तर चुना गया है, अन्य 24 अच्छी तरह से थाली से इसी संस्कृति का विस्तार। इसके अलावा, एक 10 सेमी डिश में है कि कॉलोनी का विस्तार कई शीशियों नीचे फ्रीज धारा 2.3 में विस्तृत, और अन्य सभी कालोनियों त्यागें।
      नोट: मूल कालोनियों के एक चौथाई के बारे में केवल उच्च responders में परिणाम। आमतौर पर, subcloning के पहले दौर वर्दी lacZ धुंधला में परिणाम नहीं करता है और subcloning के बाद में एक दौर के लिए किया जाना चाहिएवर्दी मजबूत responders हासिल करते हैं।

Representative Results

F9 दुर्लभ lacZ रिपोर्टर एक पक्षपाती भ्रूण कार्सिनोमा सेल जिलेटिन लेपित सतह पर हो पंक्ति है। संवाददाता का निर्माण कोशिकाओं बीटा galactosidase। 11,12,14,18 का एक आनुपातिक प्रेरण के साथ रा के मात्रात्मक प्रतिक्रिया करने की अनुमति देता है। इन कोशिकाओं को एक उपकला आकृति विज्ञान (चित्रा 1 ए) प्रदर्शित करते हैं। उनके उच्च दोहरीकरण दर के कारण, यह सिफारिश की है कि इन कोशिकाओं को हर 2 विभाजित किया - 1:10 के अनुपात में 3 दिन। इस संवाददाता सेल लाइन के साथ अपने काम के दौरान हमने देखा है भी G418 के अलावा संस्कृति माध्यम में साथ, आरए करने के लिए इन कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को कमजोर है कि उसके बाद कई मार्ग (चित्रा 1 बी, बाएं), और इस के रिपोर्टर क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं इस सेल लाइन। जवाबदेही का यह नुकसान बाद में मार्ग पर transgene की आंशिक नुकसान के कारण हो सकता है। इस तरह, समय-समय पर subcloning आरए करने के लिए मजबूत और वर्दी responders सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है (चित्रा1 बी, दाएं)।

हालांकि इस सेल लाइन के विभिन्न उपयोगों पहले 12,14-18 प्रकाशित किया गया है, यहाँ बताया कि इस सेल लाइन का उपयोग अलग जीनोटाइप के साथ व्यक्तिगत E8.5 भ्रूण से अंतर्जात आरए के स्तर को मापने के लिए है। में Gpr161 वीएल / वीएल उत्परिवर्तन परिणाम भ्रूण आरए 22 सिगनल कमी आई है। F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं के साथ अलग भ्रूण के सह-संस्कृति से दिखाया गया है, इन Gpr161 वीएल / वीएल भ्रूण जंगली प्रकार littermates (2A चित्रा) की तुलना में अंतर्जात आरए कम कर दिया है। इस संवाददाता सेल लाइन भी यहां बताया की बहुमुखी प्रतिभा की वजह से इन कोशिकाओं के एक उपन्यास का उपयोग वयस्क Gpr161 भार / WT चूहों (चित्रा 2 बी) से प्राप्त neurosphere संस्कृतियों के द्वारा उत्पादित आरए स्तर का पता लगाने के लिए है। इस संवाददाता सेल लाइन अंतर्जात आरए उत्पादन वयस्क रीढ़ की हड्डी की स्टेम कोशिकाओं से कि neurosphere संस्कृतियों का प्रदर्शन करने में सक्षम था। महान रचनाकारधुंधला तीव्रता में erence E8.5 भ्रूण की तुलना में रीढ़ की हड्डी neurospheres के लिए एक बड़ा रिपोर्टर सेल प्रतिक्रिया इंगित करता है। यह बहुत बड़ा आरए समय के साथ neurospheres द्वारा उत्पन्न स्तर E8.5 भ्रूण की तुलना में, जो सच है कि neurosphere संस्कृतियों E8.5 भ्रूण की तुलना में अधिक समरूप हैं और इस प्रकार अधिक आरए उत्पादक कोशिकाओं को रोकने के लिए कारण हो सकता है की वजह से हो सकता है।

संवाददाता कोशिकाओं की एक खुराक पर निर्भर रेखीय प्रतिक्रिया में कम-आरए परिणामों के विभिन्न सांद्रता के अलावा। यह प्रतिक्रिया 610 एनएम पर absorbance पढ़ने के द्वारा colorimetrically मापा जा सकता है। उत्पन्न मानक वक्र तो इस तरह के जंगली प्रकार neurosphere संस्कृतियों (चित्रा 3 ए) या ​​E8.5 भ्रूण (चित्रा 3 बी) के रूप में नमूनों में आरए स्तर, यों इस्तेमाल किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. Maintenance और F9 दुर्लभ lacZ प्रकोष्ठों के subcloning। (ए) F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं के एक चरण विपरीत छवि में दिखाया गया है। और बाद में lacZ-आरए पर 1 एनएम के अलावा के साथ संस्कृतियों की आवधिक परीक्षण 1:10 के अनुपात में - (80% संगम मोटे तौर पर 70) (ख) इन कोशिकाओं ~ 10 घंटा का दोहरीकरण समय है और हर 3 दिन पारित किया जाना चाहिए। धुंधला हो जाना सुनिश्चित करने के लिए संस्कृतियों आरए (दाएं) को मजबूत और वर्दी responders रहने के लिए किया जाना चाहिए। गरीब और गैर वर्दी responders (बाएं) के मामले में, subcloning किया जाना चाहिए। स्केल 100 माइक्रोन सलाखों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 की lacZ धुंधला सह सुसंस्कृत नमूने (Dissociated E8.5 भ्रूण / Neurospheres) और F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं। (ए) E8.5 माउस भ्रूण विभिन्न जीनोटाइप के एस अलग और F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं के शीर्ष पर चढ़ाया गया। LacZ 24 घंटा धुंधला हो जाना बाद में अंतर्जात आरए करने के लिए F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं सह सुसंस्कृत नमूने द्वारा उत्पादित की प्रतिक्रिया के दृश्य के लिए अनुमति देता है। कमी आई है अंतर्जात आरए में Gpr161 वीएल उत्परिवर्तन के परिणाम के रूप में संवाददाता कोशिकाओं के कम प्रतिक्रिया द्वारा कल्पना। (बी) वाम। वयस्क रीढ़ की हड्डी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से सुसंस्कृत neurospheres के एक चरण विपरीत छवि में दिखाया गया है। सही। वयस्क Gpr161 गुम्मट / गुम्मट रीढ़ की हड्डी से निकाली गई Neurospheres अलग और F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं के शीर्ष पर चढ़ाया गया। LacZ धुंधला निम्नलिखित नीले वेग की उपस्थिति इन neurospheres में अंतर्जात आरए की उपस्थिति का संकेत। neurosphere और E8.5 भ्रूण सह संस्कृतियों के बीच तीव्रता धुंधला में अंतर E8.5 भ्रूण से neurospheres में आरए वर्तमान की अधिक से अधिक स्तर का संकेत मिलता है। स्केल 100 माइक्रोन सलाखों।लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. मानक वक्र और आरए स्तर के वर्णमिति मात्रा। F9 दुर्लभ lacZ संवाददाता सेल लाइन की प्रतिक्रिया एक मानक एलिसा प्लेट रीडर का उपयोग 610 एनएम पर colorimetrically मापा जा सकता है। (ए) प्रतिनिधि मानक के सापेक्ष आरए स्तरों यों इस्तेमाल वक्र जंगली प्रकार neurosphere संस्कृति है। (बी) के सह-सुसंस्कृत E8.5 भ्रूण से रिश्तेदार आरए स्तरों की मात्रा। एन = 3; * पी <0.05, छात्र की टी परीक्षण। त्रुटि सलाखों SEM। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एसटूसीके बफ़र / समाधान अवयव जमा करने की स्थिति
10% सोडियम deoxycholate monohydrate (सी 24 h 39 नाव 4 · एच 2 ओ) 100 मिलीलीटर DH 2 हे में 10 मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस
1 एम मैग्नीशियम क्लोराइड (2 MgCl) आरटी
100x पोटेशियम ferrocyanide (कश्मीर 4 [फे (सीएन) 6] · 3H 6 ओ) 10 मिलीलीटर DH में 2.12 जी 2 ओ अंधेरे में आरटी
100x पोटेशियम ferricyanide (कश्मीर 3 [फे (सीएन) 6]) 10 मिलीलीटर DH में 1.64 जी 2 ओ अंधेरे में आरटी
20 मिलीग्राम / एमएल एक्स-लड़की (5 ब्रोमो-4-क्लोरो-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) 20 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान बनाने के लिए 5 मिलीलीटर डाइमिथाइल formamide जोड़ने -20 डिग्री सेल्सियस
10 मिमी (3 मिलीग्राम / एमएल) सभी टी.आर.retinoic एसिड ans 16.67 मिलीलीटर पूर्ण इथेनॉल में 50 मिलीग्राम भंग। 1 मिलीलीटर aliquots तैयार करें। -80 अंधेरे में डिग्री सेल्सियस, 1.5 मिलीग्राम एम्बर microcentrifuge ट्यूब में
papain 7 मिलीलीटर HBSS में एक शीशी भंग 4 डिग्री सेल्सियस

तालिका 1 बफ़र और समाधान रचनाएँ।

वर्किंग बफ़र / समाधान अवयव जमा करने की स्थिति
F9 दुर्लभ lacZ सेल संस्कृति के माध्यम से 50 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (अंतिम एकाग्रता 10%) फिल्टर बाँझ।
5 मिलीलीटर 100x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम सान्द्र 1X) 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
4मिलीलीटर 50 मिलीग्राम / एमएल G418 (अंतिम सान्द्र 0.4 मिलीग्राम / एमएल)
500 मिलीलीटर DMEM के लिए / F-12 (एल glutamine और HEPES के साथ)
0.2% जिलेटिन 25 मिलीलीटर 2.0% जिलेटिन 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
80 मिलीलीटर आसुत जल
अच्छी तरह मिलाएं
70% इथेनॉल 30 मिलीलीटर 95% इथेनॉल स्प्रे बोतल में रखें।
70 मिलीलीटर आसुत जल आरटी पर स्टोर
Neurosphere हदबंदी मध्यम 1 मिलीलीटर 20U papain ताजा हर समय तैयार
100 μl 13 मिलीग्राम / एमएल trypsin
100 μl 7 मिलीग्राम / एमएल hyaluronic एसिड
28 μl 10 मिलीग्राम / एमएल DNaseI
50 μl 4mg / एमएल kynurenic एसिड
Neurosphere संस्कृति के माध्यम से DMEM / F-12 (एल glutamine और HEPES के साथ) ताजा हर समय तैयार
2% B-27 के पूरक
20 एनजी / एमएल fibroblast वृद्धि कारक (FGF)
20ng epidermal वृद्धि कारक (EGF)
2.5% glutaraldehyde 250 μl 50% glutaraldehyde ताजा हर समय तैयार
4750 μl 1x पीबीएस
LacZ धोने समाधान 0.5 मिलीलीटर 10% deoxycholate (अंतिम सान्द्र 0.1%) 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
1.0 मिलीलीटर 100% एनपी 40 (अंतिम सान्द्र 0.2%)
50 मिलीलीटर 10X पीबीएस
500 मिलीलीटर के लिए आसुत जल
एक्स-लड़की धुंधला समाधान 1x पोटेशियम ferrocyanide ताजा हर समय तैयार
1x पोटेशियम ferricyanide
1 मिलीग्राम / एमएल एक्स-लड़की
उचित मात्रा को lacZ धोने समाधान का उपयोग
F9 दुर्लभ lacZ ठंड माध्यम F9 दुर्लभ lacZ संस्कृति के माध्यम + 5% DMSO ताजा हर समय तैयार

तालिका 2 कार्य बफ़र और समाधान रचनाएँ।

Discussion

F9 दुर्लभ lacZ सेल लाइन 14 एक शक्तिशाली प्रणाली है कि आरए का पता लगाने के ऊतक explants 12,14,17,18 द्वारा उत्पादित के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह 100 एफएम के रूप में के रूप में कम आरए सांद्रता के प्रति संवेदनशील है, कोई गैर विशिष्ट प्रतिक्रिया आरए 12,14,18 के साथ इलाज कोशिकाओं में पाया के साथ। इसके अलावा, संवाददाता कोशिकाओं एकाग्रता की एक विशिष्ट श्रेणी के भीतर एक रेखीय ढंग से सब पार आरए का जवाब है, इस प्रकार की अनुमति lacZ प्रतिक्रिया मात्रा निर्धारित और आरए स्तरों 12,14,18 की भयावहता को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। त्वरित और आसान आरए संवाददाता यहाँ प्रस्तुत परख भ्रूण और सुसंस्कृत वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के दृश्य (चित्रा 2) और रिश्तेदार मात्रात्मक माप (चित्रा 3) के लिए F9 दुर्लभ lacZ संवाददाता सेल लाइन का इस्तेमाल करता है। इस संवाददाता प्रणाली व्यक्तिगत नमूनों के बीच अंतर्जात आरए स्तर, के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है की तुलना की अनुमति देता है। यह काफी संवेदनशील आरए पता लगाने के लिए सक्षम हो जाता हैव्यक्तिगत E8.5 भ्रूण (2A चित्रा) के साथ-साथ आरए सुसंस्कृत neurospheres (चित्रा 2 बी) द्वारा उत्पादित द्वारा उत्पन्न। आरए की सांद्रता अलग-अलग करने के लिए इस सेल लाइन की खुराक पर निर्भर प्रतिक्रिया के नमूने (चित्रा 3 बी) के बीच नमूनों में आरए स्तर (चित्रा 3 ए) की मात्रा का ठहराव के साथ ही रिश्तेदार आरए के स्तर की तुलना करने के लिए अनुमति देता है। ऐसा नहीं है कि F9 दुर्लभ संवाददाता सेल लाइन आरए की कुल राशि ऊष्मायन के समय के साथ ऊतक के नमूने से उत्पन्न उपायों नोट करना महत्वपूर्ण है। इस आरए संश्लेषण और अपचय का शुद्ध संतुलन के बराबर है।

जबकि F9 दुर्लभ lacZ सेल संवाददाता प्रणाली अत्यधिक संवेदनशील और बहुमुखी है, वहाँ कई महत्वपूर्ण समस्या निवारण चरणों कि हम इस प्रणाली की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने में शामिल हो रहे हैं। पहला, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, यह महत्वपूर्ण है उन्हें जी की अनुमति के बिना नियमित मार्ग से इन कोशिकाओं के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए हैconfluency करने के लिए पंक्ति। दूसरा, हमने देखा है बाद में मार्ग असंगत आरए प्रतिक्रियाओं में परिणाम देते हैं, भले ही संस्कृतियों लगातार G418 के साथ चयन के तहत रखा जाता है। इस समस्या के निवारण के लिए, यह 20 मार्ग के बाद संस्कृतियों त्यागने और एक नई शीशी पिघलना करने के लिए सिफारिश की है। इसके अलावा, नियमित जांच सुनिश्चित करने के लिए कि रिपोर्टर कोशिकाओं को अभी भी मीडिया में आरए की उपस्थिति को मजबूत responders हैं प्रदर्शन किया जाना चाहिए। तीसरा, जल्दी मार्ग आरए (चित्रा 1 बी, बाएं), एक या subcloning के कई दौर के लिए गरीब या गैर वर्दी प्रतिक्रिया प्रदर्शित यदि आवश्यक हो सकता है जब तक मजबूत responders (चित्रा 1 बी, righ टी) प्राप्त कर रहे हैं। अन्त में, सह संस्कृति करने से पहले, यह सिफारिश की है कि इस तरह के भ्रूण और neurospheres के रूप में ऊतकों के नमूनों एकल कक्षों को अलग कर रहे हैं। हम और अधिक सुसंगत वर्णमिति माप में नमूने के परिणाम की कि हदबंदी मनाया गया है। यह एक और भी संस्कृति कुओं में आरए के वितरण के कारण हो सकता है, के रूप में अलग कोशिकाओं यूनी में हैंसंवाददाता कोशिकाओं के साथ फार्म से संपर्क करें।

कई संशोधनों के भी मूल प्रोटोकॉल 14 में किए गए थे। सबसे पहले, F9 दुर्लभ lacZ कोशिकाओं की आरए प्रतिक्रिया सीधे कोशिकाओं फिक्सिंग और 610 एनएम पर absorbance को मापने के बजाय कोशिकाओं को इकट्ठा और ख-galactosidase गतिविधि के लिए 14 lysate का विश्लेषण करके मात्रा निर्धारित किया गया। एक अन्य संशोधन आरए प्रतिक्रिया की मात्रा का ठहराव के लिए पहले F9 दुर्लभ lacZ के साथ अलग नमूनों की प्रत्यक्ष सह संस्कृति है। पिछले विधियों अलग नमूने संवर्धन और F9 के लिए दुर्लभ-lacZ 16,18 इन संस्कृतियों से ही मीडिया को जोड़ने की सूचना दी।

अपने जा रहा है एक शक्तिशाली प्रणाली के बावजूद, F9 दुर्लभ lacZ संवाददाता परख कई सीमाएं हैं। इस संवाददाता सेल लाइन की एक सीमा है कि यह सब पार आरए की उपस्थिति के लिए दृढ़ता से प्रतिक्रिया करता है, हालांकि, यह भी 9-सीआईएस आरए और 13-सीआईएस आरए सहित अन्य retinoic एसिड isomers के लिए प्रतिक्रिया करता है; हालांकि, वे सब पार आरए कंपनियों को और अधिक संवेदनशील 100 गुना कर रहे हैंअन्य isomers 18 के लिए लाल। इस प्रणाली के लिए एक और सीमा रैखिक खुराक पर निर्भर प्रतिक्रिया केवल 10 -7 के लिए 10 -13 मीटर के बीच होती है एम-आरए 14,18; इस प्रकार, इन सीमाओं के बाहर आरए स्तर की तुलना करते हैं, तो यह जरूरी है कि जब तक माप रैखिक सीमा के भीतर गिर नमूने के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करने के लिए हो सकता है। अन्त में, क्योंकि यह मुख्य रूप से एक वर्णमिति परख है, रंग विकास के समापन बिंदु के नमूने और प्रयोगों के बीच अलग अलग होंगे। इस प्रकार, यह है कि एक मानक वक्र हमेशा क्रम में हर एक प्रयोग के लिए समानांतर में चढ़ाया जा संवाददाता सेल प्रतिक्रिया की मात्रा का ठहराव के लिए इसका इस्तेमाल करने के लिए महत्वपूर्ण है।

अंत में, हम F9 दुर्लभ lacZ आरए संवाददाता सेल लाइन के उपयोग को सूचित किया है E8.5 भ्रूण में मात्रात्मक आरए के स्तर को मापने के लिए और, पहले unreported, neurospheres में। इस संवाददाता प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा वास्तव में किसी भी कोशिका या ऊतक प्रकार में आरए स्तर की मात्रा का ठहराव अनुमति हो सकती है, और एमप्र भविष्य में विभिन्न अनुप्रयोगों के विकास में परिणाम।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain Jackson Laboratory 000316
F9 RARE-LacZ reporter cell line from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia)
DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES) ThermoFisher Scientific 11330-057
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified ThermoFisher Scientific 26140-079 Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 °C for media preparation
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive
G418 ThermoFisher Scientific 10131-027 Store at 4 °C; light-sensitive
2% Gelatin Sigma Aldrich G1393 Store at 4 °C
B-27 supplement (2 % stock solution) ThermoFisher Scientific 17504-044 Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation
Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09 Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1xPBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C
Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic PeproTech 450-33 Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1x PBS; prepare working concentrations by diluting with 1x PBS; store at -20 °C
50% glutaraldehyde Amresco M155 Store at 4 °C
Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O) Sigma Aldrich D5670 Store at RT
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside) Promega V3941 Store stock at -20 °C 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich 41639 Store at RT
all-trans Retinoic Acid (at-RA) Sigma Aldrich R-2625 Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12605-010 Store at RT
0.25% trypsin-EDTA ThermoFisher Scientific 25200-056 alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14170-112 Store at 4 °C
10x phosphate buffered solution (PBS) ThermoFisher Scientific 10010-023 Store at 4 °C
Papain Worthington LK003176 Store at 4 °C. 
Trypsin Worthington LS003703 Store in 1 ml aliquots at -20 °C.
Hyaluronic acid  Calbiochem 385908 Store 200 μl aliquots at -20 °C. 
DNaseI Worthington LS002139 Store in 200 μl aliquots at -20 °C
Kynurenic acid Sigma Aldrich K3375 Store in 200 μl aliquots at -20 °C
95% ethanol
Mr. Frosty Freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001
10 cm culture dish (non-cell culture treated)
10 cm culture dish (cell culture treated)
6 cm culture dish (non-cell culture treated)
96-well cell culture plates
1.5 ml microcentrifuge tubes
1.5 ml amber microcentrifuge tubes
1.5 ml cryovials
37 °C water bath
surgical scissors
fine surgical scissors
no. 5 forceps
blunt-ended forceps
scalpel blade
glass pasteur pipettes
cotton
alcohol lamp
ELISA plate reader
stereomicroscope

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References

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E8.5 भ्रूण और neurosphere संस्कृतियों में सापेक्ष retinoic एसिड स्तर के मात्रात्मक मापन F9 दुर्लभ lacZ सेल आधारित रिपोर्टर परख का उपयोग
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Ababon, M. R., Li, B. I., Matteson,… More

Ababon, M. R., Li, B. I., Matteson, P. G., Millonig, J. H. Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay. J. Vis. Exp. (115), e54443, doi:10.3791/54443 (2016).

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