Introduction
Gli idrogel sono reti tridimensionali formate da polimeri reticolati idrofili, che sono naturali o sintetici, e caratterizzata da una struttura tridimensionale distintivo. Questi dispositivi sono sempre più interessante nel campo biomedico di drug delivery, l'ingegneria dei tessuti, portatori del gene e sensori intelligenti 1,2. Infatti, il loro elevato contenuto di acqua, come pure le proprietà reologiche e meccaniche li rendono idonei ad imitare microambienti tessuti molli e renderli strumenti efficaci per citochine idrosolubile o la crescita consegna fattore. Uno degli utilizzi più promettenti è come biomateriale iniettabile trasportano cellule e composti bioattivi. Gli idrogel possono migliorare la sopravvivenza delle cellule e il destino delle cellule staminali di controllo tenendo premuto e consegnando precisamente segnali regolatori di cellule staminali in modo rilevante fisiologico, come osservato in in vitro e in esperimenti in vivo 3,4. Il vantaggio principale di questo è la possibilitàmantenere cellule iniettate nella zona di inoculazione (in situ), minimizzando la quantità di cellule che lascia la zona e extravasates nel torrente circolatorio, migrando tutto il corpo e perdere l'obiettivo di destinazione 5. La stabilità delle reti idrogel tridimensionali è dovuto suoi siti di reticolazione, formate da legami covalenti o forze di coesione tra le catene polimeriche 6.
In questo quadro, ortogonale chimica selettiva applicata a catene polimeriche è uno strumento versatile in grado di migliorare le prestazioni di idrogel 7. Infatti, la modifica di polimeri con opportuni gruppi chimici potrebbe contribuire a fornire proprietà meccaniche chimiche appropriate, fisica e migliorare la vitalità cellulare e il loro uso nella formazione di tessuto. Allo stesso modo, tra le tecniche per caricare cellule o fattori di crescita nella matrice del gel, l'uso del peptide RGD permette miglioramenti nella adesione cellulare e la sopravvivenza. RGD è un tripeptide compostodi arginina, glicina e acido aspartico, che è di gran lunga il più efficace e spesso impiegato tripeptide grazie alla sua capacità di affrontare più di un recettore adesione cellulare e il suo impatto biologica sulla ancoraggio delle cellule, il comportamento e la sopravvivenza 8,9. In questo lavoro, la sintesi di idrogel RGD-funzionalizzato è studiato con l'obiettivo di progettare reti caratterizzate da sufficienti proprietà biochimiche per un microambiente delle cellule ospitale.
L'uso di radiazione a microonde nella sintesi idrogel offre una semplice procedura per minimizzare le reazioni collaterali e di ottenere velocità di reazione più elevate e rendimenti in un periodo di tempo più breve rispetto ai processi termici convenzionali 10. Questo metodo non richiede fasi di purificazione e rese idrogel sterili a causa delle interazioni dei polimeri e l'assenza di solvente organico nel sistema di reazione 11. Pertanto, si garantisce elevate percentuali di RGD collegati alla rete polimerica perché no modifications sono tenuti ai gruppi chimici dei polimeri coinvolti nella formazione di gel. gruppi carbossilici, da PAA e carbomer, e gruppi idrossilici, da PEG e agarosio, danno luogo alla struttura tridimensionale idrogel attraverso una reazione di policondensazione. I polimeri citati sono utilizzati per la sintesi degli idrogel nelle lesioni del midollo spinale trattamenti riparazione 12. Questi dispositivi, come riportato nel precedente opere 13,14, presentano un'elevata biocompatibilità e proprietà meccaniche e chimico-fisiche che assomigliano a quelli di molti tessuti viventi e in natura tissotropica. Inoltre, essi rimangano localizzati in situ, in corrispondenza della zona di iniezione.
In questo lavoro, PAA gruppi carbossilici vengono modificati con un residuo alchino (figura 1), e un composto RGD-azide viene sintetizzata sfruttando la reattività del gruppo terminale tripeptide -NH 2 con un composto chimico preparato con struttura (CH 2) n - N 3 (<strong> Figura 2). Successivamente, il PAA modificato reagisce con il derivato RGD-azide attraverso CuAAC click reazione 15-17 (Figura 3). L'uso di rame (I) catalizzatore comporta notevoli miglioramenti sia la velocità di reazione e la regioselettività. La reazione CuAAC è ampiamente utilizzato nella sintesi organica e nella scienza dei polimeri. Esso combina alta efficienza e un'alta tolleranza ai gruppi funzionali, ed è influenzato dalla uso di solventi organici. Una alta selettività, un tempo di reazione veloce e semplice procedura di purificazione consentono l'ottenimento di polimeri stella, copolimeri a blocchi o catene innesto frazioni desiderate 18. Questa strategia scatto consente di modificare polimeri dopo la polimerizzazione per personalizzare le proprietà fisico-chimiche a seconda dell'applicazione finale biochimico. Le condizioni sperimentali CuAAC sono facilmente riproducibile (la reazione è insensibile all'acqua, mentre l'ossidazione del rame può verificarsi minimamente), e la natura ditriazolo formata assicura la stabilità del prodotto. L'uso di rame metallico può essere considerato un punto critico, per il suo potenziale effetto tossico sulle cellule e nel microambiente biologico, ma la dialisi è utilizzato come metodo di purificazione per consentire la completa rimozione dei residui catalitici. Infine, PAA modificato RGD è utilizzato nella sintesi idrogel (figura 4) e le proprietà fisico-chimiche delle reti risultanti sono indagati, al fine di verificare il potenziale funzionalità di questi sistemi come cellule o farmaci vettori.
Figura 1: PAA modificato sintesi alkyne Uno schema di PAA funzionalizzazione con il gruppo alkyne;. "n" indica i monomeri con gruppo carbossilico reagendo con propargylamine. Clicca qui per vedereuna versione più grande di questa figura.
Figura 2:.. RGD-azide sintesi La sintesi di derivato RGD-azide Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Clicca reazione Schema di reazione click tra RGD-azide derivato e alchini-PAA.. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Hydrogel SyntESI. RGD funzionalizzato procedura di sintesi idrogel. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Protocol
Nota: Le sostanze chimiche sono utilizzate come ricevuto. Linear RGD è stato acquistato, ma può essere preparato in fase solida serie Fmoc peptide di sintesi 16,19. I solventi sono di grado analitico. La dialisi richiede l'uso di membrane con un M w pari a 3.500 Da cut-off. I composti sintetizzati sono caratterizzati da spettri 1 H NMR registrati su uno spettrometro 400 MHz usando cloroformio (CDCl 3) o ossido di deuterio (D 2 O) come solventi e spostamenti chimici sono riportati come valori δ in parti per milione. Inoltre, idrogel sono sottoposti ad analisi FT-IR con tecnica KBr pellet e la loro caratterizzazione fisica coinvolge studi gelificazione valutati utilizzando la provetta capovolta a 37 ° C.
1. Sintesi di 4-Azidobutanoyl Cloruro 1
- Sciogliere 500 mg di 4-azidobutanoic acido (3,90 mmol) in 10 ml di diclorometano e 0,5 ml di dimetilformamide.
- Raffreddare la soluzione a 0 ° C, Utilizzando un bagno di ghiaccio.
- Aggiungere 505 ml di cloruro di ossalile (5,85 mmol) a 5 ml di diclorometano e aggiungere lentamente goccia a goccia al sistema di reazione, sotto agitazione.
- Dopo 1 ora a 0 ° C utilizzando un bagno di ghiaccio, tornare a temperatura ambiente.
- Eliminare il solvente a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
- Caratterizzare il prodotto ottenuto mediante spettroscopia 1 H-NMR, sciogliendo il campione in CDCl 3 16.
2. Sintesi di RGD-azide Derivata 2
- Sciogliere 50 mg di RGD (0,145 mmoli) in 1 ml di 1 M NaOH.
- Sciogliere 24 mg di 1 (0,16 mmol) in 2 ml di tetraidrofurano.
- Aggiungere tutta la soluzione RGD di soluzione 1 a gocce a 0 ° C utilizzando un bagno di ghiaccio.
- Ritorno a temperatura ambiente e mescolare durante la notte.
- Aggiungere 1 ml di 1 M HCl.
- Eliminare il solvente a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
- Caratterizzare la OBTained prodotto 1 spettroscopia H-NMR, sciogliendo il campione in D 2 O 16.
3. PAA Acetilene Modifica 3
- Sciogliere 200 mg di 35% w / w soluzione PAA (2,8 mmol) in 15 ml di acqua distillata.
- Aggiungere 15.4 mg di propargylamine cloridrato (0.20 mmol).
- Disciogliere 42,8 mg di 1-idrossibenzotriazolo idrato (HOBt, 0,28 mmol) in 14 ml di una miscela 1: 1 v / v acetonitrile: soluzione acquosa, tramite riscaldamento a 50 ° C.
- Aggiungere tutta la soluzione HOBt alla soluzione di PAA a temperatura ambiente.
- Aggiungere 53,6 mg di ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC, 0,28 mmol) alla miscela di reazione.
- Utilizzare 1 M HCl per regolare il pH a 5,5 e agitare il sistema di reazione notte a temperatura ambiente.
- Dializzare la soluzione. Sciogliere 11.2 g di cloruro di sodio in 2 L di acqua distillata e aggiungere 0,2 ml di 37% w / w HCl. Dializzare la soluzione con una membrana con un M w cut-off di 3,5 kDa.
- Perfola dialisi rm per tre giorni. Cambiare la soluzione di dialisi quotidiana con 2 L di acqua distillata preparata di recente contenente 0,2 ml di 37% w / w HCl.
- Conservare la soluzione finale a -80 ° C. Lyophilize in un liofilizzatore secondo i protocolli del produttore.
- Caratterizzare il polimero funzionalizzato da 1 spettroscopia H-NMR, sciogliendo il campione in D 2 O 16.
4. Sintesi di PAA-RGD Polymer 4
- Sciogliere 78 mg di PAA modificato alkyne 3 (1.083 mmol) in 10 ml di acqua distillata.
- Disciogliere 25 mg del RGD azide 2 derivato (0,0722 mmoli) in 5 ml di tetraidrofurano.
- Aggiungere tutta la soluzione RGD alla soluzione polimerica.
- Aggiungere 2,2 mg di ioduro di rame (0,0116 mmoli) e 2,2 mg di ascorbato di sodio (0.0111 mmol).
- Riflusso la miscela risultante per una notte a 60 ° C, sotto agitazione.
- Raffreddare la miscela a 25 ° C.
- Dialyzvia e la soluzione. Sciogliere 11.2 g di cloruro di sodio in 2 L di acqua distillata e aggiungere 0,2 ml di 37% w / w HCl. Dializzare la soluzione con una membrana con un M w cut-off di 3,5 kDa.
- Eseguire dialisi per tre giorni. Cambiare la soluzione di dialisi quotidiana con 2 L di acqua distillata preparata di recente contenente 0,2 ml di 37% w / w HCl.
- Conservare la soluzione finale a -80 ° C. Lyophilize in un liofilizzatore secondo i protocolli del produttore.
- Caratterizzare il prodotto ottenuto mediante spettroscopia 1 H-NMR, sciogliendo il campione in D 2 O 16.
5. RGD-funzionalizzati idrogel Sintesi
- Preparare il PBS. Sciogliere 645 mg di sale PBS in 50 ml di acqua distillata.
- Miscela 40 mg di carbomer e 10 mg di PAA funzionalizzati 4 in 9 ml di PBS (passo 5.1), a temperatura ambiente, fino a dissoluzione completa (30 min).
- Aggiungere 400 mg di PEG alla soluzione e mantenere agitazione per 45 min.
- Fermare l'agitazione e consentire al sistema di accontentarsi di 30 min.
- Utilizzare 1 N NaOH per aggiustare il pH a 7,4.
- A 5 ml della miscela ottenuta, aggiungere 25 mg di polvere di agarosio.
- Irradiare il sistema con radiazione a microonde a 500 W fino a ebollizione, per un tempo generalmente compreso tra 30 secondi e 1 minuto ed elettromagneticamente riscaldare fino a 80 ° C.
- Lasciare la miscela esposto a temperatura ambiente fino alla temperatura scende a 50 ° C e aggiungere 5 ml di PBS (punto 5.1), in modo da ottenere una soluzione in un rapporto 1: 1 volumetrico.
- Preparare 12 piastra contenente cilindri di acciaio multipozzetto con un diametro di 1,1 cm.
- Prendere 500 microlitri aliquote dalla soluzione e metterle a ciascun cilindri in acciaio.
- Lasciare a riposo per 45 minuti fino a completa gelificazione del sistema.
- Rimuovere i cilindri con una pinza in acciaio inox per ottenere gli idrogel.
6. Caricamento di strumento terapeutico (Drug o cellule)
- ripetere steps 5,1-5,7.
- Quando il composto (già allo stato sol) raggiunge 37 ° C, aggiungere 5 ml della soluzione contenente la coltura soluzione medicinale o cella desiderato, al fine di ottenere un sistema finale in un rapporto 1: 1 volumetrico.
- Ripetere i passaggi 5,9-5,12 per ottenere reti polimerici con biocompounds intrappolate fisicamente all'interno del gel.
7. Hydrogel Caratterizzazione
- Analisi FT-IR
- Dopo formazione del gel, immergere uno degli idrogel sintetizzati in 2,5 ml di acqua distillata per 24 ore.
- Rimuovere i mezzi acquosi in cui è sommerso idrogel e congelare-secco con liquido N 2.
- Laminato campione idrogel secondo la tecnica pellet KBr.
- Aggiungere una spatola piena di KBr in un mortaio di agata. Prendere una piccola quantità di campione idrogel (circa 0,1-2% dell'importo KBr, o appena sufficiente a coprire la punta di spatola) e mescolare con la polvere KBr.
- Macinare il composto fino a quando la polvere è fine ed omogenea. </ Li>
- Utilizzare il kit di pellet di KBr per formare il pellet IR. Pressare la polvere utilizzando una pressa da laboratorio manuale: per 3 min a capacità di pressione pari a 5 tonnellate e poi per 3 min a capacità di pressione di 10 tonnellate.
- Rilasciare la pressione per ottenere il pellet finale omogeneo e trasparente in apparenza. Inserire il pellet nel supporto del campione IR ed eseguire lo spettro 16.
- Studi gelificazione
- Riempire provetta 2 ml con 900 ml di PBS ed equilibrare a 37 ° C.
- Aggiungere 100 microlitri della soluzione polimerica preparata per formare l'idrogel e incubare a 37 ° C.
- Capovolgere la provetta e osservare se il gel fluisce a 1, 2, 5, 10 e 20 min. Registrare il momento in cui il gel non scorre come il tempo di gelificazione.
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Representative Results
Il derivato PAA alchino viene efficacemente sintetizzato da acido poliacrilico e propargylamine, come mostrato in Figura 1 dove n etichette monomeri i cui gruppi carbossilici reagire con l'ammina. L'identità del prodotto è confermata mediante spettroscopia 1 H-NMR. La Figura 5 mostra la 1 H-NMR Spettro di PAA modificato con triplo legame.
Figura 5: 1 H-NMR del PAA modificato alkyne Il segnale relativo alla frazione alkyne viene evidenziato.. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
I segnali della catena polimerica possono essere osservati nel range 2,75-1,50 ppm; mentre un picco a 2.8 0 ppm, rappresentante H di alchini, e un picco a 4,20 ppm, relativo al 2 H del -CH 2, caratterizzano la porzione propargile. Ciò conferma che PAA è stato correttamente modificato. La valutazione del grado di funzionalizzazione alchino è stata effettuata integrando l'area sotto i picchi PAA (impostati a 3,00, a seconda del numero di atomi di idrogeno per monomero) e propargile parte, come illustrato in figura 5. Il grado di funzionalizzazione f è calcolata come:
rappresenta la zona integrale del residuo propargile, la somma dell'area H del alchino (etichettato come 
) E la zona -CH 2 (indicato come 
), Mentreione "src =" / files / ftp_upload / 54445 / 54445eq5.jpg "/> si riferisce all'area integrante dei segnali di polimeri. Il grado di funzionalizzazione è calcolato al 10% ed è considerare soddisfacente secondo la sintesi idrogel, dove PAA deve reagire attraverso i suoi gruppi carbossilici residui a formare la rete 3D. Una resa quantitativa è ottenuto per il polimero modificato 16.
In modo simile, la figura 6 mostra lo spettro 1 H-NMR del prodotto dopo la reazione click CuAAC tra il PAA modificato alchino e RGD-azide. Il picco del triazolo formata a 8,15 ppm conferma che la reazione avviene in una resa quantitativa e RGD è fortemente legato alle catene PAA. La Figura 6 illustra tutti i segnali caratteristici della catena PAA e RGD.
Figura 6:1 H-NMR del RGD legata al PAA. Il segnale di triazolo è indicato (etichettato come "A"). Viene eseguita RGD funzionalizzazione polimero tramite CuAAC reazione click. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
idrogel RGD-funzionalizzati sono preparati mediante reticolazione chimica dei quattro polimeri (PAA, carbomer, agarosio e PEG) mediante polimerizzazione a radicali liberi di micro-onde. Riscaldamento a 80 ° C comporta una mobilità macromero superiore, e quindi migliora le interconnessioni corto raggio tra i gruppi carbossilici ed ossidrilici dei polimeri. La reazione di esterificazione avviene tra questi gruppi funzionali e produce reti locali chiamati "microgel".
Con il procedere di policondensazione, la viscosità del sistema aumenta continuamente, wentre la probabilità di interazione tra macromero siti reattivi diminuisce. Tuttavia, i gruppi funzionali più vicino interagisci ancora efficiente a causa di una mobilità più lenta. La condizione fisico-chimiche risultante è caratterizzata da una "saldatura" tra superfici Microgel che produce la macrostruttura 3D finale dell'idrogel. L'esterificazione, legame idrogeno e carbossilazione sulle catene polimeriche statisticamente più vicino, creando così una struttura eterogenea stabile. Il sistema risultante presenta sol comportamento / gel e si passa a uno stato di gel entro 5 minuti. Questo intervallo di tempo viene indicato come tempo di gelificazione.
La natura chimica degli idrogel RGD-funzionalizzati viene studiata utilizzando un'analisi FT-IR. Figura 7 mostra il confronto tra spettri FT-IR del composto RGD-azide (linea verde), l'idrogel sintetizzato senza funzionalizzazione RGD (linea nera), e l'idrogel con modificazione del peptide (linea blu). Le specifiche idrogelTra sono entrambi caratterizzati da un ampio segnale nelle 3,600-3,200 cm -1 gamma, rappresentante della vibrazione stiramento legami OH residui e da un picco vicino a 2940 centimetri -1 del tratto CH. La convalida che esterificazione si verifica tra i gruppi carbossilici ed ossidrilici polimero è data dai picchi circa 1600 cm -1 e 1400 cm -1, corrispondenti, rispettivamente, al simmetrica e asimmetrica allungamento di CO 2 frazione. Questi picchi sono più visibili nello spettro del idrogel non-funzionalizzato, mentre nello spettro RGD-idrogel sono parzialmente coperti da segnali indicati come bande ammide I e II.
Figura 7:. Confronto di FT-IR spettri FT-IR spettri di RGD (linea verde), idrogel senza funzionalizzazione RGD (linea nera) e idrogel RGD funzionalizzati (linea blu). Ilil segnale relativo al ammide RGD è indicato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
L'allungamento del C = O, etichettato come banda amide I ( "Amide I" in figura 7), presenta un picco a 1650 cm -1 nello spettro tripeptide e viene spostato a circa 1.670 centimetri -1 nel campione RGD-idrogel . La piegatura di NH, relativa a amide II banda ( "Amide II" in Figura 7), può essere registrato con il segnale circa 1.550 cm -1 nello spettro RGD ed è anche riconoscibile nel campione idrogel, a circa 1.600 cm - 1. Poiché non vi sono componenti ammidici nella formulazione idrogel standard, la presenza di picchi di natura ammidico suggerisce che il PAA è davvero funzionalizzato con il RGD ed è in grado di formare un idrogel con siti peptide all'interno della rete polimerica.
Lo spettro FT-IR idrogel mostra anche i picchi relativi alla vibrazione allungamento del COC di legame glicosidico (900-1.000 cm -1 intervallo) tra le unità di monosaccaridi di agarosio e gruppi estere.
Per ottenere comprensione della struttura 3D e le proprietà fisiche e meccaniche di questi idrogel, analisi SEM, gelificazione, gonfiore cinetica e studi reologiche vengono eseguite, come discusso in lavori precedenti 13,20. SEM risultati (Figura 8) mostrano che idrogel sono caratterizzati da una struttura microscopica complesso con alcuni pori più grandi contenenti piccoli pori e alcune reti fibrillari sulle pareti dei pori. Inoltre, la maggior parte dei pori sono interconnessi. La struttura entangled è simile alla rete 3D di idrogel preparati nello stesso modo ma senza funzionalizzazione RGD. Questo dimostra che il RGD non altera la rete polimerica. Usando il test provetta capovolta, l'idrogel sampi solidifica entro 5 minuti, come osservato nel campione idrogel senza RGD funzionalizzazione 21. Questo tempo di gelificazione breve sottolinea la sua idoneità per applicazioni biomediche.
Figura 8:.. Immagini analisi SEM SEM mostrano la morfologia di un campione RGD-funzionalizzati idrogel (A) e un idrogel senza funzionalizzazione (B) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Il rapporto di equilibrio gonfiore indica la capacità di assorbire e trattenere una grande quantità di acqua ed è una delle caratteristiche principali di sistemi idrogel 20,22. I campioni analizzati mostrano una rapida cinetica gonfiore e raggiungono il gonfiore equilibrio entro la prima ora. Il loro moto ondosoing valore di equilibrio Q viene segnalato nel nostro precedente lavoro 16 ed è simile al valore ottenuto dall'analisi degli idrogel senza RGD, confermando che il tripeptide è integrato con la rete polimerica e non crea un'elevata ostacolo al processo di gelificazione.
Con gli studi reologiche, il modulo elastico gel (G') è risultato essere di circa un ordine di grandezza superiore al modulo di perdita (G''), indicando un materiale elastico 23 anziché viscoso ed entrambi sono essenzialmente indipendente dalla frequenza. Valori simili di G'e G'' sono registrati con il campione di gel, senza una modifica peptide 16. Ciò dimostra che la presenza di RGD all'interno della rete polimerica non influenza le proprietà reologiche del materiale, mantenendo le caratteristiche peculiari concorrenti al sistema iniettabili per applicazioni biomediche.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Prof. Maurizio Masi per la discussione proficua e Miss Chiara Allegretti per la modifica della lingua. Autori 'è supportata dal Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2.312.573).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(acrylic acid) solution average Mw ~100,000, 35 wt% in H2O | Sigma Aldrich | 523925 | CAS 9003-01-4 |
| Poly(ethylene glycol) 2,000 | Sigma Aldrich | 84797 | CAS 25322-68-3 |
| Carbomeer 974P | Fagron | 1387083 | |
| Agarose | Invitrogen Corp. | 16500-500 | UltraPure Agarose |
| RGD peptide | abcam | ab142698 | |
| 4-azidobutanoic acid | Aurum Pharmatech | Z-2421 | CAS 54447-68-6 |
| Oxalyl chloride | Sigma Aldrich | O8801 | CAS 79-37-8 |
| Propargylamine hydrochloride 95% | Sigma Aldrich | P50919 | CAS 15430-52-1 |
| Copper(I) iodide | Sigma Aldrich | 3140 | CAS 7681-65-4 |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | Y0000039 | CAS 134-03-2 |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Dialysis Membrane | Spectrum Laboratories, Inc. | 132725 | Spectra/Por 3 Dialysis Membrane Standard RC Tubing MWCO: 3.5 kD |
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