Summary
هنا، نقدم بروتوكول للحصول تطور مختبر التكيف من الكائنات الحية الدقيقة في ظل ظروف استخدام الثقافة ناظم كيميائي. أيضا، وتناقش التحليل الجيني لسلالة تطورت.
Introduction
يمكن أن الكائنات الحية الدقيقة على البقاء والتكيف مع بيئات متنوعة. تحت ضغط شديد، يمكن أن يحدث التكيف عن طريق الاستحواذ على الظواهر المفيدة التي كتبها الطفرات الجينومية عشوائية واختيار إيجابية لاحقة 1-3. لذلك، يمكن أن الخلايا الميكروبية التكيف عن طريق تغيير التمثيل الغذائي أو الشبكات التنظيمية للنمو الأمثل، وهو ما يطلق عليه "تطور التكيف". الأخيرة النزعات الميكروبية الهامة، مثل انتشار الجراثيم وحدوث سلالات ميكروبية قوية، ترتبط ارتباطا وثيقا جدا لالتكييفية تطور تحت ظروف ضاغطة. تحت ظروف المختبر محددة، ونحن قادرون على دراسة آليات التطور الجزيئي وحتى التحكم في اتجاه تطور ميكروبات لمختلف التطبيقات. على عكس الكائنات متعددة الخلايا والكائنات وحيدة الخلية هي مناسبة تماما لتطور مختبر التكيف (الرابطة) وذلك للأسباب التالية: أنها تجديد بسرعة، والحفاظ على عدد كبير من السكان، وأنه من السهل لخلق والحفاظ هومبيئات ogeneous. جنبا إلى جنب مع التطورات الحديثة في تقنيات تسلسل الحمض النووي وتقنيات عالية الإنتاجية، الرابطة يسمح لمراقبة مباشرة من التغيرات الجينية التي تؤدي إلى تغييرات تنظيمية النظامية. ديناميات طفرية ومجموعة متنوعة من السكان هي أيضا ملاحظتها. استراتيجيات الهندسة الوراثية يمكن تحديد من تحليل سلالات الرابطة 4،5.
ثقافة ناظم كيميائي هي الطريقة المستخدمة للحصول على خلايا ثابتة للدولة وزيادة الإنتاجية في عمليات التخمير 6. يضاف متوسطة جديدة ويتم حصاد ثقافة مرق أثناء عملية (ويشمل هذا الأخير المتوسطة والكتلة الحيوية). ثقافة ناظم كيميائي على المدى الطويل، ومع ذلك، يتغير الإنتاجية ثابتة للدولة للثقافة ويجلب تراكم الطفرات العفوية والاختيار خلال ثقافة (الشكل 1A). تحت ضغوط الانتقاء مختلفة (الضغوطات)، ومما يعزز تراكم الطفرات. وهناك زيادة تدريجية من التوتر في المدى الطويل يوفر ناظم كيميائي لمجموعة مستمرة من الطفرات التي تعمل ضد الضغوطات معينة، مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة، والضغط الاسموزي والتجويع المغذيات، والأكسدة، والمنتجات النهائية السامة، وما إلى ذلك نقل مستعمرة من وسط صلب ونقل المسلسل من الوسط السائل (المتكررة ثقافة دفعة) تسمح للباحثين للحصول على الكائنات الحية الدقيقة تطورت (الشكل 1B و1C). على الرغم من أن الثقافة ناظم كيميائي يتطلب أساليب معقدة، وتجمع التنوع (عدد مكررات وحجم السكان) أعلى من تلك التي يحصل عليها عن طريق التحويل مستعمرة وتقنيات نقل التسلسلية. تعرض الضغط مستقر إلى الخلايا الفردية وانخفض التباين في دولة الخلوية خلال ثقافة ناظم كيميائي (الحالة المستقرة) هي فوائد أخرى من الرابطة بالمقارنة مع التقنيات المعتمدة ثقافة دفعة واحدة. هو عرض ALE التوتر الناجم عن الإشريكية القولونية يتعرضون لظروف السكسينات عالية في هذه المقالة.
ديزيل / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
الشكل 1: طرق تطور مختبر التكيف (A) ناظم كيميائي؛ (ب) نقل المسلسل؛ (ج) نقل مستعمرة. الأرقام أعلى توضح مفهوم طرق الرابطة، والأرقام السفلية توضح عدد الخلايا التي نمت خلال الرابطة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد المعدات
- الحصول على جرة ناظم كيميائي (150-250 مل) أو دورق مخروطي (250 مل) تحتوي على مدخل الميناء والميناء منفذا. ربط الموانئ مع أنبوب السيليكون السماح لمعدلات تدفق 10-100 مل / ساعة. اختياريا، استخدم فتحة التهوية، ومنفذ منفذ الهواء، ومدخل المياه ومنفذ الموانئ التي تسيطر عليها درجة الحرارة.
- الحصول على جهاز مناسبة لجرة ناظم كيميائي ينص على الانفعالات والتحكم في درجة الحرارة (أو استخدام حاضنة تهتز الدوارة).
- الحصول على اثنين من مضخات تحوي من أجل تقديم متوسطة جديدة وجمع الثقافة.
- الحصول على جرة خزان (10-20 لتر) يحتوي على منفذ ميناء المتوسط ومنفذ مدخل الهواء.
- الحصول على أنبوب السيليكون مناسبة لمعدل التخفيف (أي الرقم 0.8 مم، ومجموعة تدفق ،06-36 مل / دقيقة، L / S 13 الأنابيب).
2. إعداد المتوسطة والتعقيم
- متوسط الأولي
- حل 0.3 غرام غلوكوز، 0.08 ز NH 4الكلورين، 0.05 غرام كلوريد الصوديوم، 0.75 ز نا 2 هبو 4 · 2H 2 O، و 0.3 ز KH 2 PO 4 في 90 مل من الماء المقطر (DW) في جرة ناظم كيميائي.
- ختم جرة ناظم كيميائي جنبا إلى جنب مع الأنابيب باستخدام المشابك. لا ختم تنفيس الهواء.
- تعقيم جرة ناظم كيميائي في الأوتوكلاف في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التعقيم، وتخزين جرة ناظم كيميائي في درجة حرارة الغرفة.
- حل 0.02 غرام MgSO 4 · 7H 2 O، 0.01 غ CaCl 2، و 0.1 ملغ الثيامين في 10 مل DW (حل A).
- حل تصفية باستخدام حقنة ومرشح حقنة تعقيمها قبل (مرشح 0.45 ميكرون المسام).
- إضافة الحل ويرشح لجرة ناظم كيميائي.
- الإجهاد المتوسطة
- حل 30 ز الجلوكوز، 8 ز NH 4 CL، 5 غرام كلوريد الصوديوم، و 75 ز نا 2 هبو 4 · 2H 2 O، 30 ز KH 2 PO 4، و 300 غرام صوديوم السكسينات هيدرات (نا 2 · السكسينات · 6H <فرعية> 2 O؛ الضغوطات المستخدمة في هذه التجربة) في 9.9 L DW في جرة الخزان.
- ختم جرة خزان جنبا إلى جنب مع الأنابيب باستخدام المشابك. لا ختم تنفيس الهواء.
- تعقيم جرة خزان في الأوتوكلاف في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التعقيم، وتخزين جرة في درجة حرارة الغرفة.
- حل ز 2 MgSO 4 · 7H 2 O، 1 غرام CaCl 2، و 10 ملغ الثيامين في 100 مل DW (حل A).
- تصفية حل ومع حقنة ومرشح حقنة تعقيمها قبل (مرشح 0.45 ميكرون المسام).
- إضافة الحل ويرشح لجرة الخزان.
- جو معقم و مطهر ربط أنبوب السيليكون تعقيمها إلى جرة خزان وإرفاق مضخات تحوي.
- الضغط العالية المتوسطة
- إعداد المتوسطة كما في القسم 2.2، ولكن مع زيادة تركيز الإجهاد (أي 3-5 جرام / لتر أعلى في التكيف السكسينات).
ملاحظة: هذا البروتوكول هو التكيف مع الإجهاد عشرفي أن يتم تسليمها عن طريق وسيط. في حالة الضغوطات المادية مثل درجة الحرارة، والإثارة، أو الإضاءة، وينبغي تصميم زراعة وفقا لذلك.
- إعداد المتوسطة كما في القسم 2.2، ولكن مع زيادة تركيز الإجهاد (أي 3-5 جرام / لتر أعلى في التكيف السكسينات).
3. زراعة الأولية
- تلقيح مستعمرة واحدة من النوع البري E. القولونية في أنبوب اختبار 15 مل تحتوي على 4 مل من المتوسط الأولي.
- احتضان أنبوب اختبار في حاضنة تهتز لمدة 12 ساعة على 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة.
- نقل جو معقم و مطهر 1 مل من preculture إلى جرة ناظم كيميائي.
- احتضان جرة ناظم كيميائي، وتوفير للتهوية (الهواء 50 مل / دقيقة) والإثارة (200 دورة في الدقيقة)، عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
4. التأكيد على التكيف
- جو معقم و مطهر توصيل نهاية الأنبوب السيليكون من المضخات لجرة ناظم كيميائي.
- بدء ضخ مخرج (10 مل / ساعة أو أعلى) وجمع الثقافة.
ملاحظة: يجب أن تكون الثقافة في مرحلة الأسي، وعادة 4-8 ساعة بعد زراعة الأولية. - الفصلإيك الكثافة الضوئية (600 نانومتر) من ثقافة من الأنابيب منفذ.
- بدء ضخ مدخل (10 مل / ساعة، أي ما يعادل نسبة التخفيف من 0.1 ساعة -1).
- تحقق الكثافة البصرية للثقافة في 600 نانومتر من منفذ أنابيب كل 24 ساعة.
- تشغيل ناظم كيميائي لمدة 96 ساعة (دوران 9.6 أضعاف) أو أكثر. إذا كانت كثافة بصرية مستقرة، تبادل الخزان الذي يحتوي على متوسط ارتفاع الضغط. إذا كانت الكثافة البصرية أقل من 0.2، والتوقف عن تغذية مضخة مدخل ل6 ساعات. إعادة تشغيل مضخة مدخل وتأكد من أن الكثافة البصرية هي أكثر من 0.2.
- زيادة تدريجية في تركيز الإجهاد عن طريق تغيير إلى خزان يحتوي على تركيز الإجهاد العالي.
- أخذ عينات من ثقافة تكييفها كلما يصل معلما (على سبيل المثال، سلالة تتكيف مع 100 غرام / لتر الإجهاد السكسينات)، ومخزن لمزيد من التحليل الجيني.
- لتخزين العينة، خلط العينة ثقافة (0.5 مل) مع تعقيم 80٪ الجلسرين solutiعلى (0.5 مل)، وتخزينه في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: إذا كانت الكائنات الحية الدقيقة يكتسب القدرة على الحط من الإجهاد أثناء عملية الرابطة، وتركيز الإجهاد في جرة التخمير ليست هي نفسها كما أنه في خزان جديد.
عزل 5. واحد مستعمرة من سلالة تتكيف الإجهاد
- إعداد المتوسطة لوحة أجار (1.6٪ أجار) التي تحتوي على نفس الضغوطات وعلى نفس التركيز من المتوسط.
- لوحة ثقافة منفذ (0.1 مل) من ناظم كيميائي، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
- اختيار المستعمرات واحد من لوحة باستخدام مسواك معقمة وتلقيح لهم في 15 مل من أنابيب الاختبار تحتوي على نفس الضغوطات وفي نفس التركيز المتوسط كما في ناظم كيميائي، واحتضان لمدة 6 ساعات.
- نقل 1 مل من مرق الثقافة في قارورة 250 مل مخروطي يحتوي على 50 مل من المتوسط. الحصاد 0.5 مل من مرق ثقافة كل 1 ساعة، وقياس OD في 600 نانومتر. مقارنة معدل نمو الاجهاد تكييفهان إلى أن من سلالة من النوع البري نظرا لالضغوطات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لارتفاع السكسينات من التوتر التكيف، والبرية من نوع E. كان القولونية W3110 سلالة مثقف في ناظم كيميائي في D = 0.1 ساعة -1 لمدة 270 يوما (الشكل 2).
الشكل 2: عالية السكسينات من التوتر التكيف من E. القولونية W3110 استخدام الثقافة ناظم كيميائي. السهام رقيقة تشير إلى الأوقات التي تم زيادة تركيز الإجهاد، وتشير السهام جريئة الأوقات التي تم الحفاظ عليها الثقافات. الأرقام مع السهام تشير إلى تركيزات من الإجهاد، هيدرات الصوديوم السكسينات. ويمثل التغير في الكتلة الحيوية خلال الرابطة وتركيزات الإجهاد. تم تعديل الرقم من J. Biosci. Bioeng 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد زاد تركيز الإجهاد الأولي من 30 جرام / لتر (ثنائي الصوديوم السكسينات هيدرات) تدريجيا كلما وصلت ثقافة ناظم كيميائي حالة مستقرة، حتى كان تركيز الإجهاد 160 غرام / لتر. هاء تكييفها وقد اكتسب القولونية DST160 سلالة (متسامح إلى 160 غرام / لتر من الإجهاد ثنائي الصوديوم السكسينات) بعد 270 يوما. سلالة DST160 أظهرت نمو غير مطروقة لضغوط عالية السكسينات (160 غرام / لتر الإجهاد)، في حين أظهر سلالة الجد (W3110) أي ما يقرب من النمو (الشكل 3).
الشكل 3: منحنيات النمو من النوع البري (W3110، دائرة بيضاء) وتكييفها سلالة (DST160، دائرة سوداء) تحت ضغط عالية السكسينات-هذا الرقم يدل على ان سلالة تتكيف نما دون تأخير تحت عالية السكسينات الشروط وشدد في حين البرية. نوع لم يفعل ذلك. الخطأوتشير القضبان الانحراف المعياري لثلاث تجارب مستقلة. تم تعديل الرقم من J. Biosci. Bioeng 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الكائنات الدقيقة قادرة على التكيف مع جميع البيئات تقريبا بسبب معدل نموها السريع والتنوع الجيني. تطور مختبر التكيف تمكن الكائنات الدقيقة تتطور في ظل ظروف مصممة، الذي يوفر وسيلة لاختيار الكائنات الفردية إيواء الطفرات العفوية التي تعود بالفائدة تحت ظروف معينة.
تقنية ناظم كيميائي هو أكثر قوة لتحقيق التطور المصطنعة من تقنيات نقل للأسباب التالية: (أ) توفير بيئة مستقرة - بسبب تقنيات نقل تقوم على الثقافات دفعة إما على مادة صلبة أو في وسط سائل، والبيئة من الخلايا تختلف خلال دفعة الثقافة في حين أن الإجهاد البيئي من ناظم كيميائي ثابت. (ب) عدد أكبر من السكان ومجموعة مختارة مستمرة - السكان أكبر من ناظم كيميائي يوفر التنوع الجيني أكثر من السكان أقل من تقنيات نقل. اختيار مستمرة من الفصلتقنية emostat هي أسرع طريقة لتحقيق تطور من اختيار متقطعة من تقنيات نقل. ومن الأهمية بمكان أن ثقافة ناظم كيميائي لا تكون ملوثة بواسطة الكائنات الحية الدقيقة الأخرى أثناء إجراء الرابطة والتى تلزم ظروف معقمة طوال ثقافة ناظم كيميائي. الإجراء الرابطة يمكن تعديلها من قبل تغييرات على الضغوطات، مثل الإجهاد التأكسدي، والتأكيد على ناضح، والإجهاد الناتج السام. وهناك عدد قليل من القيود التقنية إلى الرابطة التي كتبها الثقافة ناظم كيميائي. تطور يحدث بالصدفة. لذلك، قد لا تكون الباحثين مختلفة قادرة على الحصول على نتيجة التطورية ذاتها، على الرغم من أن عواقب الطفرات قد تكون ذات صلة. الحد الآخر هو غسل التدريجي للثقافة ناظم كيميائي عند زيادة تركيز الإجهاد بسرعة كبيرة جدا. إذا انخفضت الكتلة الحيوية إلى كمية معينة (أي OD = 0.2 في هذا الإجراء) بعد زيادة تركيز الإجهاد، يجب أن تتوقف إدارة الإجهاد للأجيال على الأقل بضعة لإعطاء الوقت سلالة للتكيف.
وقد ساعدت التطورات الحديثة في تكنولوجيا ترتيب الجينوم فهم الطفرات التي تتطور استجابة لبعض ظروف ضاغطة. على سبيل المثال، فإن الطفرة الحمض النووي يغير تأثير النظامية خاصة أن يعود بالنفع على بيئة معينة (أي، وتحمل الإجهاد السام). وهكذا، يمكن أن تستخدم للرابطة للدراسة وظيفة الجين أو تنظيم الشبكة، أو كمادة خام ل"تطور المتسارع. دراسات الرابطة هي مفيدة أيضا في محاكاة تطور البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية، مما يدل على الآليات التي تنشأ خطيرة السلالات البكتيرية المقاومة للعقاقير. كما هو منقوش على مسار تطور في الجينوم، كشف التعديلات الوراثية التي تؤدي إلى الظواهر المطلوبة (مثل تحمل الإجهاد) هو عقبة القادمة ويتم الحصول على سلالات أخرى تطورت 8. ومن بين تقنيات التسلسل الجيل المقبل من المتاحة حاليا، بلات البورشيد وايون سيلأشكال هي مناسبة للكشف عن بدائل النوكليوتيدات أو indels الصغيرة التي تحدث في سلالات تطورت، وكلاهما في متناول الجميع. لأن الكشف البديل وعادة ما ينطوي رسم الخرائط قراءة قصيرة للتسلسل المرجعية، وتوافر تسلسل الجينوم من سلالة الأجداد أمر بالغ الأهمية. حتى لو كان تسلسل الجينوم من سلالة مؤسس متاح من قواعد البيانات العامة، غالبا ما يكون من المرغوب فيه أن تسلسل في وقت واحد مع واحد تطورت، لأنه قد تكون هناك بعض الاختلافات إضافية في سلالة الانطلاق الفعلي. تتوفر بسهولة عبر الإنترنت أو البحث الأدب 9،10 بروتوكولات لتحديد الطفرات. على سبيل المثال، BRESEQ هو خط أنابيب صممت خصيصا للتحليل الجيني من الميكروبات تطورت المختبر باستخدام الجيل المقبل من البيانات تسلسل 11. يمكن مقارنات بين سلالات تطورت في بعض المراحل (على سبيل المثال، في هذه البيانات التمثيلية، النوع البري، DST50، DST100، وDST160) توفر سلسلة من سلالة متطورالصورة وتعطي نظرة ثاقبة في عواقب الإجهاد معين. لذلك، من المتوقع المعرفة والتطبيقات من التجارب الرابطة، إلى جانب البيولوجيا النظام وتحديد المتغيرات اضطراب النظامية في المستقبل القريب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | - | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | - | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
References
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
- Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
- Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
- Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15 (2014).
- Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
- Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
