Procedure for Adaptive Laboratory Evolution af mikroorganismer Ved hjælp af en kemostat

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at opnå adaptiv laboratorium udvikling af mikroorganismer under forhold ved hjælp kemostatkultur. Desuden er genomisk analyse af den udviklede stamme diskuteret.

Introduction

Mikroorganismer kan overleve og tilpasse sig forskellige miljøer. Under alvorlig stress, kan tilpasningen ske via opkøb af gavnlige fænotyper ved tilfældige genomiske mutationer og efterfølgende positiv selektion ^1-3. Derfor kan mikrobielle celler tilpasse ved at ændre metaboliske eller regulerende net for optimal vækst, som kaldes "adaptiv evolution". Nylige vigtige mikrobielle tendenser, såsom udbrud af superbugs og forekomsten af ​​robuste mikrobielle stammer, er meget nært beslægtet med adaptive evolution under stressende forhold. Under definerede laboratorieforhold, er vi i stand til at studere mekanismerne i molekylær evolution og endda styre retningen af ​​mikrobiel evolution til forskellige applikationer. I modsætning til flercellede organismer, encellede organismer er velegnede til adaptiv laboratorium evolution (ALE) af følgende grunde: De regenerere hurtigt, de opretholder store befolkningsgrupper, og det er let at oprette og vedligeholde homogeneous miljøer. Kombineret med de seneste fremskridt inden for DNA-sekventering teknikker og avanceret teknologi, ALE giver mulighed for direkte observation af genomiske ændringer, der fører til systemiske lovgivningsmæssige ændringer. Mutations dynamik og en mangfoldighed af befolkningen er også observeres. Genetisk engineering strategier kan bestemmes ud fra en analyse af ALE stammer ^4,5.

Kemostatkultur er en metode, der anvendes til at opnå steady-state-celler og øge produktiviteten i fermenteringsprocesser ^6. Frisk medium tilsættes, og dyrkningsbouillonen høstes under processen (sidstnævnte omfatter medium og biomasse). Langsigtet kemostatkultur imidlertid ændrer steady-state produktivitet af kulturen og bevirker en akkumulering af spontane mutationer og selektion under dyrkning (figur 1a). Under forskellige udvalg tryk (stressfaktorer), er ophobning af mutationer forbedret. En gradvis forøgelse af stress i en langsigtet kemostat giver en kontinuerlig udvalg af mutationer, der arbejder imod de givne stressfaktorer, såsom temperatur, pH, osmotisk tryk, næringsstof sult, oxidation, giftige slutprodukter, osv Colony overførsel fra et fast medium og seriel overførsel fra et flydende medium (gentaget batch-kultur) tillader også forskere at opnå udviklet mikroorganismer (figur 1b og 1c). Selvom kemostatkultur kræver komplicerede metoder, puljen af ​​mangfoldighed (antal gentagelser og befolkningens størrelse) er højere end den, der opnås ved hjælp af koloni overførsel og serielle forflytningsteknikker. Den stabile stress udsættelse for individuelle celler og formindsket variation i den cellulære tilstand under kemostatkultur (steady state) er andre fordele ved ALE sammenlignet med batch kultur-baserede teknikker. Stress-induceret ALE af Escherichia coli udsat for høje succinat- betingelser er indført i denne artikel.

Iles / ftp_upload / 54.446 / 54446fig1.jpg "/>
Figur 1: Metoder til adaptiv laboratorium evolution (A) kemostat;. (B) seriel overførsel (C) koloni overførsel. De øverste figurer illustrerer begrebet metoderne til ALE, og de ​​nederste figurer illustrerer antallet af celler, der voksede i løbet ALE. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. Klargøring af udstyr

1. Opnå en kemostat krukke (150-250 ml) eller en Erlenmeyerkolbe (250 ml) indeholdende en indløbsport og en udløbsport. Tilslut havnene med silicium slange giver mulighed for strømningshastigheder på 10-100 ml / time. Eventuelt bruge en udlufter, et luftudtag port, og temperaturregulerede vand indsugnings- og udstødningsporte.
2. Opnå en indretning egnet til chemostaten krukke, der sørger for omrøring og temperaturkontrol (eller brug en roterende rysteinkubator).
3. Opnå to peristaltiske pumper for at levere frisk medium og indsamle kulturen.
4. Opnå et reservoir jar (10-20 L) indeholdende et medium udløbsport og en luftindløbsport.
5. Opnå silicium slange egnet til fortynding rate (dvs. ID 0,8 mm, flow rækkevidde 0,06-36 ml / min; L / S 13 slanger).

2. Medium Forberedelse og Sterilisation

1. Indledende Medium
   1. Opløs 0,3 g glucose, 0,08 g _NH4Cl, 0,05 g NaCl, 0,75 g Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, og 0,3 g KH ₂ PO ₄ i 90 ml destilleret vand (DW) i en kemostat krukke.
   2. Forsegl kemostat krukke sammen med slangen med klemmer. Må ikke forsegle udluftningshul.
   3. Steriliser kemostat krukke i en autoklave ved 121 ° C i 15 min. Efter sterilisering Opbevar kemostat krukke ved stuetemperatur.
   4. Opløs 0,02 g _MgSO4 · 7H ₂ O, 0,01 g _CaCl2, og 0,1 mg thiamin i 10 ml DW (opløsning A).
   5. Filter opløsning A under anvendelse af en sprøjte og en forud steriliseret injektionssprøjte filter (et 0,45 um pore filter).
   6. Tilsæt opløsning A filtrater til chemostaten krukke.
2. Stress Medium
   1. Opløs 30 g glucose, 8 g _NH4Cl, 5 g NaCl, 75 g Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 30 g KH ₂ PO _4, og 300 g dinatrium hexahydrat (Na ₂ · succinat · 6H <sub> 2 O; stressor anvendt i dette eksperiment) i 9,9 L DW i et reservoir krukke.
   2. Forsegle reservoiret krukke sammen med slangen med klemmer. Må ikke forsegle udluftningshul.
   3. Sterilisere reservoiret krukke i en autoklave ved 121 ° C i 15 min. Efter sterilisering opbevares krukken ved stuetemperatur.
   4. Opløs 2 g _MgSO4 · 7H ₂ O, 1 g _CaCl2, og 10 mg thiamin i 100 ml DW (opløsning A).
   5. Filter opløsning A med en sprøjte og en forud steriliseret injektionssprøjte filter (et 0,45 um pore filter).
   6. Tilsæt opløsning A filtrater til reservoiret krukke.
   7. Aseptisk tilslutte steriliserede silicium slangen til reservoiret krukken og vedhæfte peristaltiske pumper.
3. Høj stress Medium
   1. Forbered mediet som i afsnit 2.2, men med en større koncentration af stressor (dvs. 3-5 g / l højere i succinat tilpasning).
      Bemærk: Denne protokol er for tilpasning til stress thpå kan leveres via mediet. I tilfælde af fysiske stressfaktorer såsom temperatur, agitation eller belysning, bør dyrkningen udformes i overensstemmelse hermed.

3. Indledende Dyrkning

1. Inokulere en enkelt koloni af vildtype E. coli i en 15 ml reagensglas indeholdende 4 ml oprindelige medium.
2. Inkubér reagensglasset i en rysteinkubator i 12 timer ved 37 ° C og 220 rpm.
3. Aseptisk overføres 1 ml forkultur til kemostat krukke.
4. Inkubér chemostaten krukke, leverer til beluftning (luft 50 ml / min) og omrøring (200 rpm) ved 37 ° C i 6 timer.

4. Stress Tilpasning

1. Aseptisk sætte enden af ​​silicium slangen fra pumperne til chemostaten krukke.
2. Start pumpens (10 ml / time eller højere) og indsamle kultur.
   Bemærk: Kulturen skal være i den eksponentielle fase, typisk 4-8 ​​timer efter indledende dyrkning.
3. ChECK den optiske densitet (600 nm) af kulturen fra udløbet slangen.
4. Start indløbs- pumpe (10 ml / time, svarende til en hastighed på fortynding af 0,1 ^time-1).
5. Tjek den optiske densitet af kulturen ved 600 nm fra udløbsslangen hver 24 timer.
6. Betjen kemostat i 96 timer (9,6 gange omsætningen) eller mere. Hvis den optiske densitet er stabil ombytte dette reservoir indeholdende høj stress medium. Hvis den optiske densitet er lavere end 0,2, stoppe fodring indløb pumpe i 6 timer. Genstart indløb pumpe og kontrollere, at den optiske tæthed er over 0,2.
7. Forøg gradvist koncentrationen af ​​stressor ved at skifte til et reservoir indeholdende en højere stressor koncentration.
8. Tag prøver af den tilpassede kultur, når den når en milepæl (fx en stamme tilpasset til 100 g / l succinat stress), og butik for yderligere genomisk analyse.
9. For prøve opbevaring, bland kulturen prøve (0,5 ml) med en steriliseret 80% glycerol solutipå (0,5 ml) og gemme den ved -80 ° C.
   Bemærk: Hvis mikroorganismen erhverver en evne til at nedbryde stressor under ALE-processen, koncentration stressor i fermenteringen krukke er ikke den samme som i den friske reservoir.

5. Single-koloni Isolering af Stress-tilpassede stamme

1. Forbered agarplademedium (1,6% agar) indeholdende samme stressor og i samme koncentration af medium.
2. Plate kulturen udløb (0,1 ml) fra chemostaten, og der inkuberes ved 37 ° C i 16 timer.
3. Pick enkelte kolonier fra pladen under anvendelse af en steril tandstik og pode dem i 15 ml reagensglas, der indeholder samme stressor og på samme medium koncentration som i kemostaten, og der inkuberes i 6 timer.
4. Overføres 1 ml dyrkningsbouillonen i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende 50 ml medium. Harvest 0,5 ml af kulturen bouillon hver en time, og måle OD ved 600 nm. Sammenligne væksten i den tilpassede strain med den for vildtypestammen givet stressor.

Representative Results

For høj-succinat stress tilpasning, vildtype E. coli W3110 stamme blev dyrket i en chemostat ved D = 0,1 ^h-1 i 270 dage (figur 2).

Figur 2: Høj-succinat stress tilpasning af E. coli W3110 hjælp kemostatkultur. Tynde pile angiver de tidspunkter, hvor koncentrationen af stressor blev forøget, og dristige pile angiver de tidspunkter, hvor kulturer blev bevaret. Numre med pile angiver koncentrationerne af stressor, dinatriumsuccinat-hexahydrat. Ændringen i biomasse under ALE og koncentrationerne af stressor er repræsenteret. Figuren blev ændret fra J. Biosci. Bioeng ^7. Klik her for at se en større version af dette tal.

En indledende stressor koncentration på 30 g / L (dinatriumsuccinat hexahydrat) blev gradvist forøget, når kemostatkultur nået en stabil tilstand, indtil koncentrationen af ​​stressor var 160 g / l. Den tilpassede E. coli DST160 stammen (tolerant til 160 g / l dinatriumsuccinat stress) blev erhvervet efter 270 dage. Den DST160 stamme udviste uhæmmet vækst under høj-succinat stress (160 g / L stressor), medens forfader stamme (W3110) viste næsten ingen vækst (figur 3).

Figur 3: Vækst kurver af vildtype (W3110, hvid cirkel) og tilpasset stamme (DST160, sort cirkel) under høj-succinat stress Figuren viser, at den tilpassede stammen voksede straks under høj-succinat stressede vilkår, mens naturen. typen ikke. fejlenstreger indikerer standardafvigelse for tre uafhængige forsøg. Figuren blev ændret fra J. Biosci. Bioeng ^7. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Mikroorganismer er i stand til at tilpasse sig næsten alle miljøer på grund af deres hurtige vækst og genetisk diversitet. Adaptive laboratorium evolution giver mikroorganismer til at udvikle sig under designede betingelser, som giver en måde at vælge individuelle organismer huser spontane mutationer, der er gavnlige under de givne betingelser.

Chemostaten teknik er mere robust for at opnå kunstigt drevet evolution end overførselsteknikken af ​​følgende grunde: (a) en stabil miljø - fordi overførsel teknikker er baseret på batch-kulturer enten på fast eller i flydende medium, miljøet af cellerne varierer under batch kultur, mens den miljømæssige belastning af kemostat er stabil; (B) en større befolkning og en kontinuerlig markering - den større befolkning kemostat giver mere genetisk diversitet end den mindre population af forflytningsteknik. Kontinuerlig udvalg af lmemostat teknik er en hurtigere måde at opnå evolution end intermitterende udvalg af forflytningsteknik. Det er kritisk, at kemostatkultur ikke være forurenet med andre mikroorganismer under ALE procedure, og aseptiske betingelser er nødvendig gennem kemostatkultur. Proceduren for ALE kan ændres ved ændringer af stressfaktorer, såsom oxidativt stress, osmotisk stress og toksisk produkt stress. Der er et par tekniske begrænsninger ALE ved kemostatkultur. Evolution sker tilfældigt; derfor kan forskellige forskere ikke kunne opnå den samme evolutionære resultat, selvom konsekvenserne af mutationer kan være relateret. En anden begrænsning er den udvaskning af kemostatkultur når koncentrationen af ​​stressor øges for hurtigt. Hvis biomassen sænkes til et bestemt beløb (dvs. OD = 0,2 i denne procedure) efter koncentrationen af stressor forøges, bør administration af stressor standses i mindst et par generationer tilgiver stammen tid til at tilpasse.

Den seneste udvikling i genomsekvensering teknologi har hjulpet forståelsen af ​​mutationer, der udvikler som svar på visse stressende forhold. For eksempel kan en DNA-mutation ændrer en bestemt systemisk effekt, der er gavnlig for givet miljø (dvs. tolerance til en toksisk stressor). Således kan ALE bruges til at studere gen funktion eller netværk regulering, eller som råmateriale til "accelereret evolution '. ALE undersøgelser er også nyttige til at simulere udviklingen af ​​antibiotikaresistente bakterier, som angiver de mekanismer, hvorved farlige lægemiddelresistente bakteriestammer opstår. Som bane af evolutionen er indgraveret på genomet, afdække de genetiske ændringer, der fører til de ønskede fænotyper (såsom stress tolerance) er den næste forhindring opnås engang udviklede stammer ^8. Blandt de i øjeblikket tilgængelige næste generations sekventering teknologi, Illumina og Ion Torrent platformer er egnet til påvisning af nukleotidsubstitutioner eller små indels, der forekommer i den udviklede stammer, og begge er overkommelige. Fordi variant detektering indebærer normalt kort læse kortlægning af referencesekvenserne, er afgørende tilgængeligheden af ​​genomet sekvensen af ​​nedarvede stamme. Selv hvis genom-sekvensen af ​​grundlægger stamme er tilgængelig fra offentlige databaser, er det ofte ønskeligt at sekventere den samtidigt med den udviklede en, fordi der kan være nogle yderligere forskelle i faktiske udgangsstamme. Protokoller for mutation identifikation er let tilgængelige via internettet eller en litteratursøgning ^9,10. For eksempel BRESEQ er en specialdesignet pipeline til genomisk analyse af laboratorie-udviklet mikrober bruger næste generations sekventering data ^11. Sammenligninger af den udviklede stammer ved visse milepæle (f.eks i denne repræsentative data, vildtype, DST50, DST100, og DST160) kan give sekvensen af ​​den udviklede stammes og giver indsigt i konsekvenserne af en given stressor. Derfor viden og anvendelser af ALE eksperimenter, kombineret med systemets biologi og identifikation af systemiske forstyrrelse variabler, der forventes i den nærmeste fremtid.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini-chemostat fermentor	Biotron Inc.	-	manufactured by special order
silicon tubing	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.
reservoir jar	Bellco	Media storage bottle	20 L
chemicals	Sigma-Aldrich	-	reagent grade
glucose	Sigma-Aldrich	G5767	ACS reagent
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS reagent, ≥99%
Na2HPO4·2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	ACS reagent, ≥99%
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	230391	ACS reagent, ≥98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	ACS reagent, ≥96%
thiamine·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	reagent grade, ≥99%
Na2·succinate·6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99%