Procédure d'adaptation Laboratoire de l'évolution de Microorganismes Utilisation chémostat

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir adaptatif évolution en laboratoire de micro-organismes dans des conditions à l'aide de la culture chemostat. En outre, l'analyse génomique de la souche évoluée est discutée.

Introduction

Les microorganismes peuvent survivre et s'adapter à des environnements divers. En cas de stress sévère, l' adaptation peut se produire via l' acquisition de phénotypes bénéfiques par des mutations génomiques aléatoires et la sélection positive ultérieure ^1-3. Par conséquent, les cellules microbiennes peuvent adapter en changeant métabolique ou les réseaux de régulation pour une croissance optimale, qui est appelé «l'évolution adaptative". tendances microbiennes importantes récentes, telles que les épidémies de superbactéries et l'apparition de souches microbiennes robustes, sont très étroitement liés à l'évolution adaptative dans des conditions stressantes. Dans des conditions de laboratoire définies, nous sommes en mesure d'étudier les mécanismes de l'évolution moléculaire et même de contrôler la direction de l'évolution microbienne pour diverses applications. Contrairement à des organismes multicellulaires, les organismes unicellulaires sont bien adaptés à l'évolution de laboratoire adaptatif (ALE) pour les raisons suivantes: ils régénèrent rapidement, ils maintiennent des populations importantes, et il est facile de créer et maintenir homenvironnements ogeneous. Combiné avec les récentes avancées dans les techniques de séquençage de l'ADN et des technologies à haut débit, ALE permet l'observation directe des changements génomiques qui conduisent à des changements réglementaires systémiques. la dynamique de mutation et la diversité de la population sont également observables. Stratégies de génie génétique peuvent être déterminées à partir de l'analyse des souches d'ale ^4,5.

Culture Chemostat est une méthode utilisée pour obtenir des cellules à l' état ​​stable et d' augmenter la productivité dans les processus de fermentation ^6. Du milieu frais est ajouté et le bouillon de culture est récolté pendant le processus (celui-ci comprend en moyenne et la biomasse). Culture chemostat à long terme, cependant, modifie la productivité à l' état ​​stable de la culture et provoque l'accumulation de mutations spontanées et la sélection lors de la culture (figure 1a). Sous diverses pressions de sélection (facteurs de stress), l'accumulation de mutations est améliorée. Une augmentation progressive de stress dans un long terme chémostat prévoit une sélection continue de mutations qui agissent contre les facteurs de stress donnés, tels que la température, le pH, la pression osmotique, des substances nutritives inanition, l' oxydation, des produits finaux toxiques, etc. , le transfert des colonies à partir d' un milieu solide et le transfert en série à partir d' un milieu liquide (répété culture discontinue) permettent également aux chercheurs d'obtenir des micro - organismes évolués (figure 1b et 1c). Bien que la culture chemostat nécessite des méthodes compliquées, la piscine de la diversité (nombre de répétitions et de la taille de la population) est supérieure à celle obtenue par transfert des colonies et des techniques de transfert de série. L'exposition au stress stable à des cellules individuelles et une diminution de la variation de l'état cellulaire pendant la culture chemostat (état stable) sont les autres avantages de l'ALE par rapport aux techniques basées sur la culture par lots. ALE Le stress induit par des Escherichia coli soumis à des conditions succinate élevées est introduit dans cet article.

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Figure 1: Méthodes d'évolution de laboratoire adaptatif (A) Chemostat;. (B) transfert en série; (C) transfert des colonies. Les chiffres supérieurs illustrent le concept des méthodes pour ALE, et les chiffres inférieurs illustrent le nombre de cellules qui se sont développées au cours ALE. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

1. Équipement Préparation

1. Obtenir un récipient chimiostatique (150-250 ml) ou d'un Erlenmeyer (250 ml) contenant un orifice d'entrée et un orifice de sortie. Connectez les ports avec des tubes de silicium permettant des taux de 10-100 ml / h de débit. En option, utiliser un évent, un orifice de sortie d'air et des orifices d'entrée et sortie d'eau à température contrôlée.
2. Obtenir un dispositif approprié pour le pot de chemostat qui fournit pour l'agitation et de la température (ou utiliser un incubateur agitateur rotatif).
3. Obtenir deux pompes péristaltiques afin d'offrir un milieu frais et de percevoir la culture.
4. Obtenir un pot de réservoir (10 à 20 L) contenant un orifice de sortie de fluide et un orifice d'entrée d'air.
5. Obtenir un tube de silicium pour le taux de dilution (c. -à- ID 0,8 mm, plage de débit de 0,06 à 36 ml / min; L / S 13 tubes).

2. Moyen Préparation et stérilisation

1. Medium initial
   1. Dissoudre 0,3 g de glucose, 0,08 g de NH ₄Cl, 0,05 g de NaCl, 0,75 g de Na ₂ HPO ₄ .2H ₂ O, et 0,3 g de KH ₂ PO ₄ dans 90 ml d' eau distillée (DW) dans un récipient chimiostatique.
   2. Sceller le bocal en chemostat avec le tuyau à l'aide des pinces. Ne pas sceller l'évent.
   3. Stériliser le pot de chemostat dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 min. Après stérilisation, stocker le pot de chemostat à la température ambiante.
   4. Dissoudre 0,02 g de MgSO ₄ · 7H ₂ O, 0,01 g de CaCl _2, et 0,1 mg de thiamine dans 10 ml DW (solution A).
   5. Une solution de filtration à l'aide d'une seringue et d'un filtre à seringue pré-stérilisé (un filtre de 0,45 um de pores).
   6. Ajouter la solution A filtrats dans le pot de chemostat.
2. stress Medium
   1. Dissoudre 30 g de glucose, 8 g de NH ₄ Cl, 5 g de NaCl, 75 g de Na ₂ HPO ₄ .2H ₂ O, 30 g de KH ₂ PO ₄ et 300 g de succinate disodique hexahydraté (Na ₂ · succinate .6H <sub> 2 O; le facteur de stress utilisé dans cette expérience) dans 9,9 L DW dans un pot de réservoir.
   2. Sceller le pot de réservoir avec le tuyau à l'aide des pinces. Ne pas sceller l'évent.
   3. Stériliser le pot de réservoir dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 min. Après stérilisation, stocker le pot à la température ambiante.
   4. Dissoudre 2 g MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1 g de CaCl _2, et 10 mg de thiamine dans 100 ml DW (solution A).
   5. Une solution de filtre avec une seringue et d'un filtre à seringue pré-stérilisé (un filtre à pores de 0,45 um).
   6. Ajouter la solution A filtrats dans le pot de réservoir.
   7. Aseptique connecter le tube de silicium stérilisé pour le pot de réservoir et fixer les pompes péristaltiques.
3. Haut-stress moyen
   1. Préparer le milieu comme dans la section 2.2, mais avec une plus grande concentration de stresseur (ie, 3-5 g / L plus élevé dans l'adaptation succinate).
      Remarque: Ce protocole est pour l'adaptation à une contrainte eà peut être livré via le support. Dans le cas des facteurs de stress physiques tels que la température, l'agitation ou l'illumination, la culture doit être conçu en conséquence.

3. Culture initiale

1. Inoculer une seule colonie de type sauvage E. coli dans un tube à essai de 15 ml contenant 4 ml de milieu initial.
2. Incuber le tube à essai dans un incubateur à agitation par secousses pendant 12 heures à 37 ° C et à 220 tours par minute.
3. transfert aseptique 1 ml de préculture au pot chemostat.
4. Incuber le pot de chemostat, prévoyant l'aération (air 50 ml / min) et l'agitation (200 rpm), à 37 ° C pendant 6 heures.

4. Stress Adaptation

1. Aseptique connecter l'extrémité du tube de silicium à partir des pompes à la jarre de chemostat.
2. Démarrer la pompe de sortie (10 ml / h ou plus) et recueillir la culture.
   Remarque: La culture doit être en phase exponentielle, généralement 4-8 heures après la culture initiale.
3. ChEck la densité optique (600 nm) de la culture de la tubulure de sortie.
4. Démarrer la pompe d'entrée (10 ml / h, ce qui correspond à un taux de dilution de 0,1 h ^-1).
5. Vérifier la densité optique de la culture à 600 nm à partir de la tubulure de sortie toutes les 24 heures.
6. Faire fonctionner le chemostat pendant 96 heures (chiffre d'affaires de 9,6 fois) ou plus. Si la densité optique est stable, échanger le réservoir contenant le milieu de stress élevé. Si la densité optique est inférieure à 0,2, arrêter la pompe d'entrée d'alimentation pendant 6 heures. Redémarrez la pompe d'entrée et vérifier que la densité optique est supérieure à 0,2.
7. Augmenter graduellement la concentration du facteur de stress en changeant à un réservoir contenant une concentration plus élevée de facteur de stress.
8. Prélever des échantillons de la culture adaptée chaque fois qu'il atteint une étape importante (par exemple, une souche adaptée à 100 g / L stress succinate), et un magasin pour une analyse génomique.
9. Pour le stockage de l'échantillon, mélanger l'échantillon de culture (0,5 ml) avec un stérilisée 80% de glycérol solutisur (0,5 ml) et le stocker à -80 ° C.
   Remarque: si le micro-organisme acquiert une capacité de dégrader le facteur de stress au cours du procédé ALE, la concentration du facteur de force dans le récipient de fermentation ne sont pas les mêmes que dans le réservoir frais.

5. unique colonie d'isolement de la souche adaptée au stress

1. Préparer le milieu de plaque de gélose (1,6% de gélose) contenant le même facteur de stress et à la même concentration du milieu.
2. La culture de la plaque de sortie (0,1 ml) à partir du chemostat, et incuber à 37 ° C pendant 16 heures.
3. Prélever des colonies uniques à partir de la plaque à l'aide d'un cure-dent stérile et inoculer 15 ml dans les tubes à essai contenant le même facteur de stress et à la même concentration que dans le milieu chémostat, et laisser incuber pendant 6 heures.
4. Transférer 1 ml de bouillon de culture dans un erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de milieu. Récolte 0,5 ml du bouillon de culture, toutes les 1 h, et de mesurer la DO à 600 nm. Comparer le taux de l'strai adapté de croissancen à celle de la souche de type sauvage étant donné le stresseur.

Representative Results

Pour haute succinate adaptation au stress, le type sauvage E. coli W3110 a été cultivé dans un chemostat à D = 0,1 h ^-1 pendant 270 jours (Figure 2).

Figure 2: High-succinate adaptation au stress de E. coli W3110 en utilisant la culture chemostat. flèches minces indiquent les moments où la concentration de stresseur a été augmenté, et les flèches en gras indiquent les moments où les cultures ont été conservées. Les nombres avec des flèches indiquent les concentrations de l'agent stresseur, succinate disodique hexahydraté. La variation de la biomasse au cours ALE et les concentrations de facteurs de stress sont représentés. Le chiffre a été modifié à partir de J. Biosci. Bioeng ^7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Une concentration de stresseur initiale de 30 g / L (succinate disodique hexahydraté) a été progressivement augmentée chaque fois que la culture chemostat a atteint un état d'équilibre, jusqu'à ce que la concentration de stresseur était de 160 g / L. E. adapté coli souche DST160 (tolérante à 160 g / L de stress disodique succinate) a été acquis après 270 jours. La souche DST160 a affiché une croissance désinhibée sous contrainte haute succinate (160 g / L stresseur), tandis que la souche ancêtre (W3110) a montré presque pas de croissance (Figure 3).

Figure 3: courbes de type sauvage (W3110, cercle blanc) Croissance et souche adaptée (DST160, cercle noir) sous contrainte haute succinate La figure montre que la souche adaptée a grandi sans délai sous haute succinate conditions de stress tandis que le sauvage. Type n'a pas. L'erreurles barres indiquent l'écart-type de trois expériences indépendantes. Le chiffre a été modifié à partir de J. Biosci. Bioeng ^7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les microorganismes sont capables d'adapter à presque tous les environnements en raison de leur taux de croissance rapide et de la diversité génétique. évolution de laboratoire Adaptive permet des micro-organismes à évoluer dans des conditions conçues, ce qui fournit un moyen de sélectionner les organismes individuels hébergeant des mutations spontanées qui sont bénéfiques dans les conditions données.

La technique de chemostat est plus robuste pour réaliser l'évolution entraînée artificiellement que les techniques de transfert pour les raisons suivantes: (a) un environnement stable - parce que les techniques de transfert sont basés sur des cultures en lots, soit sur solide ou dans un milieu liquide, l'environnement des cellules varie au cours de lot la culture tandis que la contrainte environnementale du chemostat est stable; (B) une population plus importante et une sélection continue - la population plus importante de l'chemostat offre une plus grande diversité génétique que la petite population de techniques de transfert. sélection continue de la chtechnique emostat est un moyen plus rapide pour atteindre l'évolution que la sélection intermittente des techniques de transfert. Il est essentiel que la culture chemostat ne soit pas contaminée par d'autres micro-organismes au cours de la procédure d'ALE, et des conditions d'asepsie sont nécessaires tout au long de la culture chemostat. La procédure d'ALE peut être modifié par des changements aux facteurs de stress, tels que le stress oxydatif, stress osmotique, et le stress de produit toxique. Il y a quelques limitations techniques aux ALE par la culture chemostat. Evolution a lieu par hasard; par conséquent, différents chercheurs peuvent ne pas être en mesure d'obtenir le même résultat de l'évolution, bien que les conséquences des mutations pourraient être liées. Une autre limite est le wash-out de la culture chemostat lorsque la concentration de stresseur est augmentée trop rapidement. Si la biomasse est réduite à une certaine quantité ( par exemple DO = 0,2 dans cette procédure) , après la concentration du facteur de stress est augmentée, l' administration du facteur de stress doit être interrompue pendant au moins quelques générations àdonner le temps de contrainte d'adaptation.

Les développements récents dans la technologie de séquençage du génome ont contribué à la compréhension des mutations qui se développent en réponse à certaines conditions stressantes. Par exemple, une mutation de l' ADN modifie un effet systémique particulier qui est bénéfique pour l'environnement donné ( par exemple, la tolérance à un stress toxique). Ainsi, ALE peut être utilisée pour étudier la fonction des gènes ou la régulation des réseaux, ou comme matière première pour 'évolution accélérée ». Des études ALE sont également utiles pour simuler le développement de bactéries résistantes aux antibiotiques, ce qui indique les mécanismes par lesquels des souches bactériennes résistantes aux médicaments dangereux se posent. Comme la trajectoire de l' évolution est gravé sur le génome, en découvrant les altérations génétiques qui conduisent à des phénotypes souhaités (tels que la tolérance au stress) est le prochain obstacle souches une fois évolué sont obtenus ^8. Parmi les technologies de séquençage de nouvelle génération actuellement disponibles, le plat Illumina et Ion Torrentles formes sont adaptées à la détection de substitutions de nucleotides ou des indels qui se produisent dans les souches évoluées, et les deux sont abordables. Parce que la détection de la variante implique généralement de courte lire la cartographie des séquences de référence, la disponibilité de la séquence du génome de la souche ancestrale est cruciale. Même si la séquence du génome de la souche fondatrice est disponible à partir des bases de données publiques, il est souvent souhaitable de séquencer en même temps que celui évolué, car il pourrait y avoir quelques différences supplémentaires dans la souche de départ réelle. Protocoles pour l' identification de la mutation sont facilement disponibles via le web ou une recherche documentaire ^9,10. Par exemple, BRESEQ est un pipeline spécialement conçu pour l' analyse génomique des microbes en laboratoire évolué en utilisant la prochaine génération des données de séquençage ^11. La comparaison des souches évoluées à certaines étapes (par exemple, dans ces données représentatives, type sauvage, DST50, DST100 et DST160) peuvent fournir la séquence de la souche évoluées et de donner un aperçu des conséquences d'un stresseur donné. Par conséquent, les connaissances et les applications des expériences ALE, associées à la biologie des systèmes et l'identification des variables systémiques de perturbation, sont attendus dans un avenir proche.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini-chemostat fermentor	Biotron Inc.	-	manufactured by special order
silicon tubing	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.
reservoir jar	Bellco	Media storage bottle	20 L
chemicals	Sigma-Aldrich	-	reagent grade
glucose	Sigma-Aldrich	G5767	ACS reagent
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS reagent, ≥99%
Na2HPO4·2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	ACS reagent, ≥99%
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	230391	ACS reagent, ≥98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	ACS reagent, ≥96%
thiamine·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	reagent grade, ≥99%
Na2·succinate·6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99%