Summary
ここでは、ケモスタット培養を使用した条件下での微生物の適応実験室進化を取得するためのプロトコルを提示します。また、進化した株のゲノム解析について説明します。
Introduction
微生物が生存し、多様な環境に適応することができます。重度のストレスの下では、適応はランダムなゲノム変異とそれに続く正の選択1-3により有益な表現型の買収を経て発生する可能性があります。したがって、微生物細胞は、「適応進化」と呼ばれる最適な成長のために代謝または調節ネットワークを変更することにより、適合させることができます。このようなスーパーバグや堅牢な微生物株の発生の発生などの最近の重要な微生物の傾向は、非常に密接にストレスの多い条件下での適応進化に関連しています。定義された実験室条件の下で、我々は分子進化のメカニズムを研究、さらには様々なアプリケーションのための微生物の進化の方向を制御することができます。多細胞生物とは異なり、単細胞生物は、次のような理由から、適応実験室進化（ALE）に適しています：彼らは多くの人口を維持するため、すぐに再生成し、それはホーンを作成し、維持するのは簡単ですogeneous環境。 DNA配列決定技術と高スループット技術の最近の進歩と組み合わせることで、ALEは、全身規制の変更につながるゲノム変化を直接観察することができます。変異動態と人口の多様性も観測可能です。遺伝子工学戦略はALE株4,5の分析から決定することができます。
ケモスタット培養は定常状態の細胞を取得し、発酵工程6の生産性を増加させるために使用される方法です。新鮮な培地を加え、培養液は、工程（後者は、媒体とバイオマスを含む）中に回収されます。長期ケモスタット培養は、しかし、文化の定常状態の生産性を変化させ、培養物（ 図1a）の間に自然突然変異と選択の蓄積をもたらします。様々な選択圧（ストレス）下で、突然変異の蓄積が促進されます。長期的にストレスの緩やかな増加ケモスタットは、コロニーの固体培地からの転送と、液体媒体からシリアル転送（繰り返しなど 、温度、pH、浸透圧、栄養飢餓、酸化、有毒な最終製品として、与えられたストレス因子に対して機能変異の連続選択を提供しますバッチ培養）は、研究者が進化した微生物（ 図1Bおよび1C）を取得することを可能にします。ケモスタット培養は、複雑な方法が必要ですが、多様性のプール（複製と集団サイズの数）は、コロニー転送とシリアル転送技術によって得られるものよりも高くなっています。個々の細胞への安定的なストレス暴露とケモスタット培養物（定常状態）の間、細胞状態の変化を減少させたバッチ培養ベースの技術と比較して、ALEの他の利点です。高コハク酸条件にさらされた大腸菌のストレス誘発ALEは、この記事で紹介されています。
ジル/ ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
図1：適応実験室進化の方法 （A）ケモスタット;。 （B）シリアル転送。 （C）コロニー転送。トップ数字はALEのための方法の概念を示し、下部の図は、ALEの間に成長した細胞の数を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.機器の準備
- 入口ポートと出口ポートを含むケモスタットジャー（150〜250 ml）または三角フラスコ（250ml）に取得します。シリコンチューブ10〜100ミリリットル/ hrの流量を可能にするとポートを接続します。任意に、エアベント、吹出口、および温度制御された水の入口および出口ポートを使用します。
- 攪拌および温度制御を提供するケモスタットジャーに適した装置を得る（または回転振とう培養器を使用します）。
- 新鮮な培地を提供し、文化を収集するために、2つの蠕動ポンプを取得します。
- 媒体排出口と吸気口を含む貯蔵瓶（10〜20 L）を得ます。
- 希釈率（; L / S 13チューブすなわち 、ID 0.8ミリメートル、流量範囲0.06〜36ミリリットル/分）に適したシリコンチューブを入手します。
2.ミディアム調製と滅菌
- 初期ミディアム
- 0.3グラムのグルコース0.08 gでNH 4を溶解Cl、0.05グラムのNaCl、0.75グラムのNa 2 HPO 4・2H 2 O、および0.3グラムのKH 2 PO 4 90 mlの蒸留水ケモスタットジャー中（DW）。
- クランプを使用してチューブと一緒にケモスタットジャーを封印。通気口を密閉しないでください。
- 121℃で15分間オートクレーブ中でケモスタットの瓶を滅菌します。滅菌後、室温でケモスタットjarファイルを格納します。
- 0.02 gでのMgSO 4・7H 2 O 0.01グラムのCaCl 2、及び10mlのDW（溶液A）中の0.1mgのチアミンを溶解します。
- シリンジおよび予め滅菌シリンジフィルター（0.45μmの細孔のフィルター）を使用してフィルタソリューションA。
- Aは、ケモスタットジャーにろ液溶液を加えます。
- ストレスミディアム
- 30gのグルコース8 gでNH 4 Clで5 gでのNaCl 75 G 2のNa HPO 4・を溶解2H 2 O、30gのKH 2 PO 4、300gをコハク酸二ナトリウム六水和物（ 硫酸ナトリウム・コハク・6H <サブ> 2 O;貯留瓶で9.9 L DWで、この実験で使用したストレッサー）。
- クランプを使用してチューブと一緒に貯留瓶を密封します。通気口を密閉しないでください。
- 121℃で15分間オートクレーブ内の貯留瓶を滅菌します。滅菌後、室温でjarファイルを格納します。
- 2 gでのMgSO 4・7H 2 O、1gのCaCl 2を、100mlのDW（溶液A）中の10 mgのチアミンを溶解します。
- シリンジおよび予め滅菌シリンジフィルター（0.45μmの孔径フィルタ）のフィルタ溶液A。
- Aが貯留瓶に濾液溶液を加えます。
- 無菌的に貯留瓶に滅菌シリコンチューブを接続し、蠕動ポンプを取り付けます。
- 高ストレスミディアム
- セクション2.2のようにメディアを準備したが、ストレッサーの高い濃度で（ すなわち 、コハク酸適応3-5 G / L以上）。
注：このプロトコルは、ストレス番目への適応のためのものですATは、媒体を介して配信することができます。例えば、温度、攪拌、または照明などの物理的ストレス因子の場合には、栽培はそれに応じて設計する必要があります。
- セクション2.2のようにメディアを準備したが、ストレッサーの高い濃度で（ すなわち 、コハク酸適応3-5 G / L以上）。
3.初期栽培
- 野生型E.の単一コロニーを接種します初期の培地4mlを含有する15mLの試験管中で大腸菌 。
- 37℃で12時間および220 rpmで振盪インキュベーター中で試験管をインキュベートします。
- 無菌的に転送ケモスタット瓶に前培養液の1ミリリットル。
- 6時間37℃で、通気（空気50ml /分）、撹拌（200rpm）しを提供する、ケモスタットの瓶をインキュベートします。
4.ストレス適応
- 無菌的ケモスタットジャーにポンプからシリコンチューブの端を接続します。
- 出口ポンプ（10ミリリットル/時以上）を起動し、文化を集めます。
注意：文化は、通常、4-8時間の初期培養後、対数期にあるべきです。 - Chの出口管から培養物の光学密度（600 nm）をECK。
- （0.1時間-1の希釈率に対応した10ミリリットル/時）入口ポンプを起動します。
- 24時間毎にチューブコンセントから600nmでの培養物の光学密度を確認してください。
- 96時間（9.6倍の売上高）以上のためのケモスタットを操作します。光学濃度が安定している場合、高負荷培地を含有するリザーバーを交換します。光学濃度が0.2未満である場合には、6時間供給入口ポンプを停止させます。入口ポンプを再起動し、光学濃度が0.2以上であることを確認してください。
- 徐々に高いストレッサー濃度を含有するリザーバーに変更することにより、ストレッサーの濃度を高めます。
- それはマイルストーンに到達するたびに適応文化のサンプルを取る（ 例えば 、100グラム/ Lのコハク酸ストレスに適応株）さらなるゲノム解析のために、と店。
- サンプル保存のために、滅菌した80％グリセロールsolutiで培養試料（0.5ミリリットル）を混ぜます（0.5ミリリットル）に、-80℃で保管してください。
注：微生物がALE処理中にストレッサーを分解する能力を取得した場合、発酵ジャーの中ストレッサー濃度は、新鮮な貯水池のものと同じではありません。
ストレスに適応した株の5シングルコロニーの分離
- 同じストレッサーを含む寒天平板培地（1.6％寒天）を準備し、媒体の同一濃度で。
- ケモスタットからの出口文化（0.1 ml）をプレートし、16時間37℃でインキュベートします。
- 滅菌爪楊枝を用いてプレートから単一コロニーを選択し、同じストレッサーを含む15ミリリットル試験管内およびケモスタットと同じ中濃度でそれらを接種し、6時間インキュベートします。
- 転写培地50 mlを含む250 mlの三角フラスコに培養液1 mlです。収穫培養液0.5ミリリットル毎に1時間、および600nmでのODを測定します。適応straiの成長率を比較ストレッサー与えられた野生型株のものとn個。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
高コハク酸のストレス適応のため、野生型E.大腸菌 W3110株は、D = 0.1時間-1 270日間（ 図2）でケモスタットで培養しました。
図2：Eの高コハク酸ストレス適応ケモスタット培養を使用して大腸菌 W3110。細い矢印は、ストレッサーの濃度が増加した時刻を示し、太い矢印は、培養物を保存した時刻を示しています。矢印の付いた数字は、ストレッサー、コハク酸二ナトリウム六水和物の濃度を示しています。 ALE中のバイオマスの変化とストレッサーの濃度が表現されます。この図は、Jから変更されましたBiosci。 Bioeng 7は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ストレッサーの濃度は160グラム/ Lになるまでケモスタット培養は、定常状態に到達するたびには30g / L（コハク酸二ナトリウム六水和物）の初期ストレッサ濃度を徐々に増加させました。適応E. （コハク酸二ナトリウムストレスの160グラム/ Lに対して耐性） 大腸菌 DST160株を270日後に買収されました。祖先株（W3110）は、ほぼ無成長（ 図3）を示したDST160株は、高コハク酸ストレス（160グラム/ Lのストレッサー）の下で阻害されていない成長を示しました。
図3：野生型（W3110、白丸）の成長曲線とは、高コハク酸ストレス下株（DST160、黒丸）を適応図は適応株は野生ながら高コハク酸の下で遅滞なくストレス条件を成長したことを示しています。種類はしませんでした。エラーバーは、3つの独立した実験の標準偏差を示します。この図は、Jから変更されましたBiosci。 Bioeng 7は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
微生物は、それらの急速な成長率と遺伝的多様性のほとんどすべての環境に適応することが可能です。適応研究室の進化は、与えられた条件の下で有益な自然突然変異を保有する生物個体を選択する方法を提供している、設計条件の下で進化した微生物を可能にします。
ケモスタット法は、以下の理由により転送技術より人工的に駆動される進化を達成するために、より堅牢である：（a）定常環境 - 転写技術は、固体のまたは液体培地のいずれかでバッチ培養に基づいているため、細胞の環境は、バッチ中に変化します文化ケモスタットの環境ストレスが安定している一方で、 （b）はより大きな集団と連続選択 - ケモスタットのより大きな集団は、転送技術の小さい人口よりも多くの遺伝的多様性を提供します。 CHの連続選択emostat技術は、転送技術の断続的な選択よりも進化を達成するためのより高速な方法です。ケモスタット培養は、ALE手順の間に他の微生物によって汚染されないことが重要であり、無菌状態をケモスタット培養全体で必要とされます。 ALE手順は、酸化ストレス、浸透圧ストレス、および毒性産物のストレスなどのストレス要因の変化により変更することができます。ケモスタット培養によるALEにはいくつかの技術的な制限があります。進化は偶然に起こります。変異の結果は関連するかもしれないが、したがって、異なる研究者は、同じ進化の結果を得ることができないかもしれません。ストレッサーの濃度があまりにも急速に増加したとき別の制限は、ケモスタット培養のウォッシュアウトです。バイオマスは、一定量（ すなわち 、OD =この手順で0.2）に減少した場合ストレッサーの濃度を増加させた後、ストレッサーの投与は、少なくともいくつかの世代のために停止する必要があります適応する歪み時間を与えます。
ゲノム配列決定技術における最近の開発は、一定のストレスの多い状況に応じて開発変異の理解を助けています。例えば、DNAの変異は、与えられた環境（有毒なストレッサーにすなわち 、許容誤差）に有益な特定の全身的な効果を変化させます。したがって、ALEは、遺伝子機能またはネットワーク制御を研究するために使用される、または「加速進化」の原料としてもよいです。 ALEの研究はまた、抗生物質耐性菌の発生をシミュレートする危険な薬剤耐性菌株が発生するメカニズムを示すのに有用です。進化の軌跡を（そのようなストレス耐性など）を所望の表現型をもたらす遺伝的変化を暴く、ゲノムに刻まれているように、一度進化株は8を得ている次の障害となっています。現在入手可能な次世代シーケンシング技術の中で、イルミナとイオントレントプラットフォームは、ヌクレオチド置換または進化株において生じる小さなインデルの検出に適しており、両方が手頃な価格です。変異型の検出は、通常、参照配列の短読みマッピングを含むので、祖先株のゲノム配列の可用性は非常に重要です。創設者株のゲノム配列は、公共のデータベースから入手可能であっても、実際の出発株ではいくつかの追加の違いが存在する可能性があるので、進化したものと同時に、それを配列決定することが望ましい場合が多いです。変異を同定するためのプロトコルは、Webや文献検索9,10を介して容易に入手することができます。例えば、BRESEQは次世代配列決定データ11を用いて、実験室進化した微生物のゲノム解析のために特別に設計されたパイプラインです。 （例えば、この代表的なデータ、野生型、DST50、DST100、およびDST160で）特定のマイルストーンで進化した株の比較は進化株のシーケンスを提供することができますsおよび、与えられたストレッサーの影響への洞察を与えます。したがって、知識とシステム生物学および全身摂動変数の識別と相まってALE実験のアプリケーションは、近い将来に期待されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | - | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | - | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
References
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
- Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
- Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
- Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15 (2014).
- Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
- Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
