Prosedyre for Adaptive Laboratory Utviklingen av mikroorganismer ved hjelp av en kjemostat

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å skaffe adaptive laboratorium evolusjon av mikroorganismer under forhold som bruker kjemostatkultur. Dessuten er diskutert genomisk analyse av utviklet seg belastning.

Introduction

Mikroorganismer kan overleve og tilpasse seg ulike miljøer. Under alvorlig stress, kan tilpasning skje via oppkjøpet av gunstige fenotyper av tilfeldige genomiske mutasjoner og påfølgende positiv utvelgelse ^1-3. Derfor kan mikrobielle celler tilpasse ved å endre metabolske eller regulatoriske nettverk for optimal vekst, som kalles "adaptiv evolusjon". Nylige viktige mikrobielle tendenser, slik som utbrudd av super og forekomsten av robuste mikrobestammer, er meget nært beslektet med adaptive evolution under stressbetingelser. Under definerte laboratorieforhold, er vi i stand til å studere mekanismene for molekylær evolusjon og selv styre retningen av mikrobiell evolusjon for ulike bruksområder. I motsetning til flercellede organismer, encellede organismer er godt egnet til adaptive laboratorium evolusjon (ALE) av følgende grunner: de regenerere raskt, de opprettholde store bestander, og det er lett å lage og vedlikeholde homogeneous miljøer. Kombinert med nylige fremskritt i DNA-sekvensering teknikker og high-throughput teknologier, gjør ALE for direkte observasjon av genomisk endringer som fører til systemiske regulatoriske endringer. Mutasjons dynamikk og et mangfold av befolkningen er også observerbar. Genetic Engineering strategier kan bli bestemt fra analysen av ALE-stammer ^4,5.

Kjemostatkultur er en metode som brukes for å oppnå steady-state celler og øke produktiviteten i gjæringsprosessen ^6. Friskt medium blir tilsatt og kulturmediet høstes i løpet av prosessen (den sistnevnte omfatter medium og biomasse). Long-term kjemostatkultur imidlertid endrer steady-state produktivitet av kulturen og forårsaker akkumulering av spontane mutasjoner og valg i kultur (figur 1a). Under forskjellige seleksjonstrykk (stressorer), er akkumulering av mutasjoner forbedret. En gradvis økning av stress i en langsiktig kjemostat sørger for en kontinuerlig utvalg av mutasjoner som virker mot de gitte stressfaktorer, for eksempel temperatur, pH, osmotisk trykk, nærings sult, oksidasjon, giftige sluttprodukter, etc. Colony overføring fra et fast medium og serieoverføring fra et flytende medium (gjentatt batch kultur) også gi forskerne utviklet mikroorganismer (Figur 1b og 1c). Selv om kjemostatkultur krever kompliserte metoder, pool av mangfoldet (antall replikasjoner og populasjonsstørrelse) er høyere enn den som oppnås ved koloni-overføring og serieoverføringsteknikker. Den stabile stresset eksponering mot enkeltceller og redusert variasjon i celle tilstand under kjemostatkultur (steady state) er andre fordeler med ALE forhold til batch kulturbaserte teknikker. Stress-indusert ALE av Escherichia coli som utsettes for høye succinat betingelser er innført i denne artikkelen.

iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
Figur 1: Metoder for adaptive laboratorium evolusjon (A) kjemostat;. (B) seriell overføring; (C) koloni overføring. Den øverste tallene illustrerer konseptet av metodene for ALE, og de ​​nederste tallene illustrerer antall celler som vokste under ALE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. Utstyr Forberedelser

1. Oppnå en kjemostat krukke (150-250 ml) eller en Erlenmeyer-kolbe (250 ml) inneholdende en innløpsport og en utløpsport. Koble portene med silikonrøret slik at for strømningshastigheter på 10 til 100 ml / time. Eventuelt bruke en luftventilen, en luftutløp port, og temperaturkontrollert vann innløps- og utløpsportene.
2. Skaff en enhet som passer for kjemostaten krukke som sørger for agitasjon og temperaturkontroll (eller bruk en roterende risteinkubator).
3. Skaff to slangepumper for å levere ferskt medium og samle kulturen.
4. Skaff et reservoar krukke (10-20 L) som inneholder et medium utgangsport og en luftinnløpsåpning.
5. Oppnå silisium slange egnet for fortynning hastighet (dvs. ID 0,8 mm, strømningsområdet 0,06 til 36 ml / min; L / S 13 tubing).

2. Medium Forberedelse og Sterilisering

1. initial Medium
   1. Løs opp 0,3 g glukose, 0,08 g NH ₄Cl, 0,05 g NaCl, 0,75 g Na ₂ HPO ₄ · 2 H ₂ O, og 0,3 g KH _{2PO 4} i 90 ml destillert vann (DW) i en kjemostat krukke.
   2. Tett kjemostat krukke sammen med slangen ved hjelp av klemmer. Ikke steng lufteventilen.
   3. Steriliser kjemostat glasset i en autoklav ved 121 ° C i 15 min. Etter sterilisering lagre kjemostat glasset ved romtemperatur.
   4. Oppløs 0,02 g _MgSO4 · 7H ₂ O, 0,01 g _CaCl2, og 0,1 mg tiamin i 10 ml DW (oppløsning A).
   5. Filter oppløsning A ved bruk av en sprøyte og et forhåndssterilisert sprøytefilter (et 0,45 pm pore-filter).
   6. Tilsett løsningen A filtratene til kjemostaten glasset.
2. Stress Medium
   1. Oppløs 30 g glukose, 8 g _NH4CI, 5 g NaCl, 75 g Na ₂ HPO ₄ · 2 H ₂ O, 30 g KH _{2PO 4,} og 300 g dinatrium-suksinat-heksahydrat (Na ₂ · succinat · 6H <sub> 2 O; at belastningen anvendt i dette eksperiment) i 9,9 L DW i et reservoar krukke.
   2. Tett reservoaret krukke sammen med slangen ved hjelp av klemmer. Ikke steng lufteventilen.
   3. Steril reservoaret glasset i en autoklav ved 121 ° C i 15 min. Etter steriliseringen, å lagre glasset ved romtemperatur.
   4. Oppløs 2 g _MgSO4 · 7H _2O, 1 g _CaCl2, og 10 mg tiamin i 100 ml DW (oppløsning A).
   5. Filter oppløsning A med en sprøyte og et forhåndssterilisert sprøytefilter (et 0,45 pm pore-filter).
   6. Tilsett løsningen A filtratene til reservoaret glasset.
   7. Aseptisk koble sterilisert silikon slangen til reservoaret glasset og fest slangepumper.
3. Høy spenning Medium
   1. Klargjør medium som i avsnitt 2.2, men med en større konsentrasjon av stressfaktor (dvs. 3-5 g / l høyere i succinat tilpasning).
      Merk: Denne protokollen er for tilpasning til en stress thpå kan leveres via mediet. Når det gjelder fysiske belastninger som temperatur, omrøring, eller belysning, bør dyrking være utformet tilsvarende.

3. Første Dyrking

1. Inokulere en enkelt koloni av villtype E. coli i et 15 ml prøverør inneholdende 4 ml opprinnelige medium.
2. Inkuber reagensglasset i en risteinkubator i 12 timer ved 37 ° C og 220 rpm.
3. Aseptisk overførings 1 ml forkultur til kjemostat jar.
4. Inkuber kjemostat glasset, gir for lufting (luft 50 ml / min) og omrøring (200 rpm) ved 37 ° C i 6 timer.

4. Stress Adaptation

1. Aseptisk koble enden av silikonrøret fra pumpene til kjemostaten glasset.
2. Starter utløpspumpen (10 ml / t eller høyere) og samles kultur.
   Merk: Den kulturen skal være i den eksponensielle fase, typisk 4-8 ​​timer etter innledende dyrking.
3. ChEck den optiske densitet (600 nm) av kulturen fra utløpsrøret.
4. Start innløpspumpe (10 ml / time, tilsvarende en hastighet på fortynning av 0,1 ^hr-1).
5. Sjekk den optiske tetthet av kulturen ved 600 nm fra utløpsrøret hver 24 timer.
6. Betjene kjemostat for 96 timer (9,6 ganger omsetningen) eller mer. Dersom den optiske tetthet er stabil, utveksle det reservoar som inneholder den høyt stress medium. Dersom den optiske densitet er lavere enn 0,2, stoppe den mater innløpspumpe i 6 timer. Start inntakspumpen og sjekk at den optiske tettheten er over 0,2.
7. Gradvis økning av konsentrasjonen av at belastningen ved å bytte til et reservoar inneholdende en høyere konsentrasjon stressfaktor.
8. Ta prøver av tilpasset kulturen når den når en milepæl (for eksempel en belastning tilpasset til 100 g / l succinate stress), og butikken for ytterligere genomisk analyse.
9. For oppbevaring av prøver, bland kulturen prøven (0,5 ml) med en sterilisert 80% glycerol solutipå (0,5 ml) og lagre det ved -80 ° C.
   Merk: Hvis mikroorganisme får en evne til å nedbryte stressor under ALE prosessen, er at belastningen konsentrasjonen i gjæring glasset ikke den samme som i den ferske reservoaret.

5. Single-koloni Isolasjon av Stress-tilpasset Strain

1. Fremstille agar-plate-medium (1,6% agar) inneholdende den samme stressfaktoren og ved samme konsentrasjon av medium.
2. Plate utløps kultur (0.1 ml) fra kjemostaten, og inkuber ved 37 ° C i 16 timer.
3. Plukke enkeltkolonier fra platen ved hjelp av en steril tannpirker og inokulere dem i 15 ml prøverør inneholdende den samme stressfaktoren og i det samme medium-konsentrasjon som i kjemostaten, og inkuberes i 6 timer.
4. Overføre 1 ml av kulturbuljongen inn i en 250 ml Erlenmeyerkolbe inneholdende 50 ml medium. Avling 0,5 ml av dyrkningsbuljongen hver 1 time, og måle OD ved 600 nm. Sammenligne veksten av tilpasset Strain til den for villtype-stammen gitt stressfaktoren.

Representative Results

For høy succinate stresset tilpasning, villtype E. coli W3110-stamme ble dyrket i en kjemostat ved D = 0,1 hr ^-1 for 270 dager (figur 2).

Figur 2: High-succinate stresset tilpasning av E. coli W3110 bruker kjemostatkultur. Tynne piler indikerer gangene hvor konsentrasjonen av stressor ble økt, og fet piler indikerer gangene hvor kulturer ble bevart. Tall med piler indikerer konsentrasjonen av stressfaktoren, dinatrium-succinat heksahydrat. Endringen i biomassen i løpet av ALE og konsentrasjonene av stressfaktor er representert. Figuren ble endret fra J. Biosci. Bioeng ^7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

En innledende stresskonsentrasjon på 30 g / L (dinatrium suksinat heksahydrat) ble gradvis øket når den kjemostatkultur nådd en stabil tilstand, inntil konsentrasjonen av stress var 160 g / l. Den tilpassede E. coli-stamme DST160 (tolerant til 160 g / l av dinatrium-succinat stress) ble ervervet etter 270 dager. Den DST160 stammen oppviste inhibert vekst under høy-suksinat belastning (160 g / l stressfaktor), mens den stamfar stamme (W3110) viste nesten ingen vekst (figur 3).

Figur 3: Vekst kurver av villtype (W3110, hvit sirkel) og tilpasset belastning (DST160, svart sirkel) under høy succinate stresset Figuren viser at den tilpasses stammen vokste uten forsinkelse under høyt-succinate stressede forhold mens naturen. typen ikke. feilenlinjer indikerer standardavvik for tre uavhengige eksperimenter. Figuren ble endret fra J. Biosci. Bioeng ^7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Mikroorganismer er i stand til å tilpasse seg nesten alle miljøer på grunn av sin raske vekst og genetisk mangfold. Adaptive laboratorium evolusjon gjør at mikroorganismer å utvikle seg i henhold til designet forhold, som gir mulighet til å velge individuelle organismer som bærer spontane mutasjoner som er gunstig under de gitte forhold.

Kjemostaten teknikken er mer robust for å oppnå kunstig drevet evolusjon enn overføringsteknikker av følgende grunner: (a) en jevn miljø - fordi overførings teknikkene er basert på satskulturer, enten på faststoff eller i flytende medium, miljø av cellene varierer i løpet batch kultur samtidig som miljø stress kjemostaten er jevn; (B) en større befolkning og et kontinuerlig valg - en større populasjon på kjemostaten gir mer genetisk mangfold enn mindre befolkning av overføringsteknikker. Kontinuerlig utvalg av chemostat teknikken er en raskere måte å oppnå evolusjon enn intermitterende utvalg av overføringsteknikker. Det er viktig at den kjemostatkultur ikke være forurenset av andre mikroorganismer i løpet av ALE prosedyren, og aseptiske betingelser kreves i hele kjemostatkultur. Den ALE Fremgangsmåten kan modifiseres ved endringer i stressfaktorer, som oksidativt stress, osmotisk stress, og giftig produkt stress. Det er noen tekniske begrensninger til ALE av kjemostatkultur. Evolution foregår ved en tilfeldighet; Derfor kan forskjellige forskere ikke være i stand til å oppnå den samme evolusjonære resultat, selv om konsekvenser av mutasjonene kan være relatert. En annen begrensning er den utvasking av kjemostatkultur når konsentrasjonen av stressfaktoren økes for raskt. Når biomassen er redusert til en viss mengde (dvs. OD = 0.2 i denne prosedyre) etter konsentrasjonen av stressfaktoren økes, bør administrering av at belastningen bli stanset i minst noen få generasjonergi belastningen tid til å tilpasse seg.

Den siste utviklingen i genomsekvensering teknologi har bidratt til forståelsen av mutasjoner som oppstår i respons til visse stressende forhold. For eksempel, en DNA-mutasjon endrer en bestemt systemisk effekt som er gunstig for den gitte miljø (dvs. toleranse til et giftig stressfaktor). Således kan ALE brukes til å studere genfunksjon eller nettverk regulering, eller som et råmateriale for 'akselerert utvikling ". ALE studier er også nyttige ved simulering av utviklingen av antibiotika-resistente bakterier, som angir de mekanismer som farlige legemiddelresistente bakteriestammer oppstå. Som banen til evolusjon er gravert på genomet, avdekke genetiske endringer som fører til de ønskede fenotyper (som stresstoleranse) er neste hinder gang utviklet seg stammer oppnås ^8. Blant de tilgjengelige neste generasjons sekvensering teknologier, Illumina og Ion Torrent platformer er egnet for påvisning av nukleotidsubstitusjoner eller små indels som oppstår i de utviklede stammer, og begge er rimelig. Fordi variant deteksjon innebærer vanligvis kort-les kartlegging av referansesekvensene, er tilgjengeligheten av genomet sekvensen av nedarvet belastning avgjørende. Selv om genomsekvensen til legger stamme er tilgjengelig fra offentlige databaser, er det ofte ønskelig å sekvensere det samtidig med det utviklet seg en, fordi det ikke kan være noen ytterligere forskjeller i selve utgangsstammen. Protokoller for mutasjon identifikasjon er lett tilgjengelig via Internett eller et litteratursøk ^9,10. For eksempel er BRESEQ en spesialdesignet rørledning for genomisk analyse av laboratorie utviklet seg mikrober som bruker neste generasjons sekvensering av data ^11. Sammenligninger av de utviklede stammer på visse milepæler (for eksempel i denne representative data, vill type, DST50, DST100, og DST160) kan gi sekvensen av det utviklede belastnings og gi innsikt i konsekvensene av et gitt stressor. Derfor, kunnskap og anvendelser av ALE eksperimenter, kombinert med system biologi og identifisering av systemiske perturbasjonsteknikker variabler, er ventet i nær fremtid.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini-chemostat fermentor	Biotron Inc.	-	manufactured by special order
silicon tubing	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.
reservoir jar	Bellco	Media storage bottle	20 L
chemicals	Sigma-Aldrich	-	reagent grade
glucose	Sigma-Aldrich	G5767	ACS reagent
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS reagent, ≥99%
Na2HPO4·2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	ACS reagent, ≥99%
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	230391	ACS reagent, ≥98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	ACS reagent, ≥96%
thiamine·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	reagent grade, ≥99%
Na2·succinate·6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99%