Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para obter a evolução adaptativa laboratório de microrganismos em condições usando cultura quemostato. Além disso, é discutida análise genômica da estirpe evoluiu.

Introduction

Os microrganismos podem sobreviver e se adaptar a diversos ambientes. Sob forte estresse, a adaptação pode ocorrer por meio de aquisição de fenótipos benéficos por mutações genómicas aleatórias e posterior selecção positiva ^1-3. Portanto, as células microbianas podem se adaptar mudando metabólica ou redes de regulação para o crescimento ideal, que é chamado de "evolução adaptativa". tendências microbianas importantes recentes, como surtos de superbactérias e a ocorrência de cepas microbianas robustos, estão intimamente relacionadas com adaptativa evolução sob condições estressantes. Em condições de laboratório definidos, somos capazes de estudar os mecanismos de evolução molecular e até mesmo controlar a direção da evolução microbiana para várias aplicações. Ao contrário de organismos multicelulares, organismos unicelulares estão bem adaptados à evolução laboratório adaptativo (ALE), pelas seguintes razões: eles regeneram rapidamente, eles manter grandes populações, e é fácil de criar e manter homambientes ogeneous. Combinado com os recentes avanços em técnicas de sequenciação de ADN e tecnologias de alto rendimento, ALE permite a observação direta de alterações genômicas que levam a mudanças regulatórias sistémicos. dinâmica de mutação e uma diversidade da população também são observáveis. Estratégias de engenharia genética pode ser determinado a partir da análise de estirpes de AEA ^4,5.

Cultura em quimiostato é um método usado para obter as células em estado estacionário e aumentar a produtividade em processos de fermentação ^6. Adiciona- se meio fresco e caldo de cultura é colhida durante o processo (este último inclui médio e de biomassa). Quimiostato cultura de longo prazo, no entanto, muda a produtividade de estado estacionário da cultura e provoca a acumulação de mutações espontâneas e selecção durante a cultura (Figura 1a). Sob várias pressões de seleção (estressores), o acúmulo de mutações é reforçada. Um aumento gradual de estresse em um longo prazo quimiostato prevê uma selecção contínua de mutações que trabalham contra os factores de stress dadas, tais como temperatura, pH, pressão osmótica, inanição nutriente, oxidação, produtos finais tóxicos, etc. Colony transferência a partir de um meio sólido e de transferência em série de um meio líquido (repetido cultura lote) também permitirá aos investigadores obter microorganismos evoluídos (Figura 1B e 1C). Embora a cultura em quimiostato requer métodos complicados, a piscina de diversidade (número de repetições, e o tamanho da população) é maior do que a obtida por técnicas de transferência em série de transferência de colónia e. A exposição ao estresse estável para células individuais e diminuição da variação no estado celular durante a cultura em quimiostato (estado estacionário) são outros benefícios do ALE em comparação com técnicas baseadas em culturas de diluição. ALE induzida pelo estresse de Escherichia coli submetida a altas condições succinato é introduzido neste artigo.

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Figura 1: Métodos de laboratório evolução adaptativa (A) quimiostato;. (B) a transferência de série; (C) a transferência de colónia. As figuras de topo ilustrar o conceito dos métodos para ALE, e as figuras de fundo ilustrar o número de células que cresceram durante a ALE. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Preparação Equipamento

1. Obter um frasco quimiostato (150-250 ml) ou num balão de Erlenmeyer (250 ml) contendo uma abertura de entrada e uma porta de saída. Ligue as portas com tubo de silicone que permite taxas de fluxo de 10-100 ml / hr. Opcionalmente, usar um respiradouro de ar, uma porta de saída de ar, e portas de entrada e saída de água de temperatura controlada.
2. Obter um dispositivo adequado para o frasco quimiostato que fornece para agitação e controlo da temperatura (ou usar um incubador com agitação rotativa).
3. Obter duas bombas peristálticas de modo a fornecer meio fresco e recolher a cultura.
4. Obter um frasco reservatório (10-20 L) contendo um orifício de saída médio e uma porta de entrada de ar.
5. Obter tubo de silicone adequado para a taxa de diluição (isto é, identificação de 0,8 milímetros, a gama de fluxo 0,06-36 mL / min; L / S 13 tubos).

2. Médio Preparação e Esterilização

1. meio inicial
   1. Dissolve-se 0,3 g de glucose, 0,08 g _de NH ₄Cl, 0,05 g de NaCl, 0,75 g de Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, e 0,3 g _de KH ₂ PO ₄ em 90 ml de água destilada (DW) em um frasco de quimiostato.
   2. Selar o frasco quemostato junto com a tubulação usando grampos. Não selar a abertura de ar.
   3. Esteriliza-se o frasco quimiostato numa autoclave a 121 ° C durante 15 min. Após a esterilização, armazenar o frasco quimiostato à temperatura ambiente.
   4. Dissolve-se 0,02 g de MgSO ₄ · 7H ₂ O, 0,01 g _{de CaCl2,} e 0,1 mg de tiamina em 10 ml de DW (solução A).
   5. Filtrar a solução A, utilizando uma seringa e um filtro de seringa pré-esterilizados (um filtro de 0,45 um de poro).
   6. Adicionar a solução A filtrados para o frasco quemostato.
2. Média Tensão
   1. Dissolve-se 30 g de glucose, 8 g _de NH ₄ Cl, 5 g de NaCl, 75 g de Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 30 g _de KH ₂ PO _4, e 300 g de succinato dissódico hexa-hidratado (Na ₂ · · succinato 6H <sub> 2 O; o estressor utilizado neste experimento) em 9,9 L DW em um frasco reservatório.
   2. Selar o frasco reservatório junto com a tubulação usando grampos. Não selar a abertura de ar.
   3. Esteriliza-se o frasco reservatório em autoclave a 121 ° C durante 15 min. Após a esterilização, armazenar o frasco à temperatura ambiente.
   4. Dissolve-se 2 g de MgSO ₄ 7H ₂ O ·, 1 g _{de CaCl2,} e 10 mg de tiamina em 100 ml de DW (solução A).
   5. Filtrar a solução A com uma seringa e um filtro de seringa pré-esterilizados (um filtro de 0,45 um de poro).
   6. Adicionar a solução A filtrados para o frasco reservatório.
   7. Assepticamente conectar o tubo de silicone esterilizados para o frasco reservatório e anexar as bombas peristálticas.
3. Médio-Alto estresse
   1. Prepare o meio como na secção 2.2, mas com uma maior concentração de estressor (ou seja, 3-5 g / L maior na adaptação succinato).
      Nota: Este protocolo é para adaptação a um estresse thno pode ser entregue através do meio. No caso de factores de stress físicos, tais como a temperatura, agitação, ou iluminação, o cultivo deve ser concebido em conformidade.

3. cultivo inicial

1. Inocular uma única colônia de tipo selvagem E. coli em um tubo de ensaio de 15 mL contendo 4 mL de meio inicial.
2. Incubar o tubo de ensaio num incubador com agitação durante 12 h a 37 ° C e 220 rpm.
3. Transfira assepticamente 1 ml de pré-cultura para o frasco quemostato.
4. Incubar o frasco quimiostato, fornecendo para arejamento (ar de 50 ml / min) e agitação (200 rpm), a 37 ° C durante 6 h.

Adaptação 4. Estresse

1. Assepticamente ligue a extremidade do tubo de silicone das bombas para o frasco quemostato.
2. Inicie a bomba de saída (10 ml / h ou superior) e recolher a cultura.
   Nota: A cultura deve estar na fase exponencial, tipicamente 4-8 horas após o cultivo inicial.
3. CHeck a densidade óptica (600 nm) da cultura a partir do tubo de saída.
4. Iniciar a bomba de entrada (10 ml / h, correspondendo a uma taxa de diluição de 0,1 hr ^-1).
5. Verifique a densidade óptica da cultura a 600 nm da tomada da tubagem a cada 24 h.
6. Operar o quimiostato durante 96 horas (volume 9,6 vezes) ou mais. Se a densidade óptica é estável, trocar o reservatório que contém o meio de alta tensão. Se a densidade óptica é inferior a 0,2, parar a bomba de entrada alimenta durante 6 h. Reinicie a bomba de entrada e verifique se a densidade óptica é superior a 0,2.
7. Aumentar gradualmente a concentração do estressor alterando a um reservatório que contém uma concentração mais elevada estressor.
8. Retirar amostras da cultura adaptada quando ela atinge um marco (por exemplo, uma estirpe adaptada a 100 g / L de stress succinato), e armazenamento para posterior análise genómica.
9. Para o armazenamento da amostra, misturar a amostra de cultura (0,5 ml) com um soluti esterilizado glicerol 80%na (0,5 ml) e armazená-lo a -80 ° C.
   Nota: Se o microorganismo adquire a capacidade de degradar o estressor durante o processo de ALE, a concentração estressor no frasco de fermentação não é a mesma que no reservatório fresco.

5.-colônia Único isolamento da estirpe adaptada-Stress

1. Preparar o meio da placa de agar (1,6% de agar) contendo a mesma estressor e na mesma concentração do meio.
2. Placa da cultura de saída (0,1 ml) a partir do quimiostato, e incuba-se a 37 ° C durante 16 horas.
3. Escolha colónias isoladas da placa utilizando um palito esterilizado e inocular-los em 15 ml de tubos de ensaio que contêm o mesmo estressor e na mesma concentração forma como no quimiostato, e incuba-se durante 6 h.
4. Transferir 1 ml do caldo de cultura num balão de Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio. Colheita de 0,5 ml do caldo de cultura a cada um de RH, e medir a DO a 600 nm. Compare a taxa de crescimento do strai adaptadaN ao da estirpe de tipo selvagem dado o estressor.

Representative Results

Para adaptação ao estresse de alta succinato, o tipo selvagem E. coli W3110 estirpe foi cultivada num quimiostato em D = 0,1 h ^-1 durante 270 dias (Figura 2).

Figura 2: adaptação ao estresse de alta succinato de E. coli W3110 usando cultura quemostato. setas finas indicam os tempos em que a concentração de estressor foi aumentada, e as setas em negrito indicam os tempos em que as culturas foram preservados. Números com setas indicam as concentrações do estressor, hexa-hidrato de succinato dissódico. A mudança na biomassa durante a cerveja e as concentrações de estressor são representados. A figura foi modificado a partir do J. Biosci. Bioeng ^7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma concentração estressor inicial de 30 g / L (succinato dissódico hexa-hidratado) foi gradualmente aumentada sempre que a cultura em quimiostato atingiu um estado estacionário, até que a concentração de estressor foi de 160 g / L. A E. adaptado coli estirpe DST160 (tolerante a 160 g / L de estresse succinato dissódico) foi adquirido depois de 270 dias. A estirpe DST160 exibiu crescimento não inibido sob o esforço de alta succinato (160 g / L estressor), enquanto que a estirpe ancestral (W3110) mostrou que quase nenhum crescimento (Figura 3).

Figura 3: Curvas de crescimento do tipo selvagem (W3110, círculo branco) e adaptado estirpe (DST160, círculo preto) sob estresse de alta succinato A figura mostra que a estirpe adaptada cresceu sem demora, sob de alta succinato condições de tensão, enquanto o selvagem. tipo não o fez. O erroas barras indicam o desvio padrão de três experiências independentes. A figura foi modificado a partir do J. Biosci. Bioeng ^7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Os microrganismos são capazes de se adaptar a quase todos os ambientes, devido à sua rápida taxa de crescimento e diversidade genética. evolução laboratório adaptável permite microorganismos a evoluir em condições destinadas, que fornece uma maneira de selecionar organismos individuais que abrigam mutações espontâneas que são benéficos nas condições dadas.

A técnica quimiostato é mais robusto para a realização evolução de forma artificial do que as técnicas de transferência, pelas seguintes razões: (a) um ambiente constante - porque as técnicas de transferência são baseados em culturas em lote, quer em sólido ou em meio líquido, o meio ambiente das células varia durante lote cultura enquanto que o stress ambiental do quimiostato é constante; (B) uma população maior e uma selecção contínua - a maior população do quimiostato fornece mais diversidade genética do que a população menor de técnicas de transferência. seleção contínua do chtécnica emostat é um caminho mais rápido para alcançar a evolução do que a seleção intermitente de técnicas de transferência. É crítico que a cultura em quimiostato não ser contaminado por outros microorganismos durante o procedimento ALE, e são necessárias condições assépticas durante todo a cultura em quimiostato. O procedimento ALE pode ser modificado por alterações ao stress, tais como o stress oxidativo, o stress osmótico, o stress e produto tóxico. Existem algumas limitações técnicas para ALE por cultura quemostato. A evolução acontece por acaso; por conseguinte, diferentes investigadores pode não ser capaz de obter o mesmo resultado evolucionária, embora as consequências de mutações pode estar relacionada. Outra limitação é a de wash-out de cultura em quimiostato, quando a concentração de estressor é aumentada muito rapidamente. Se a biomassa é reduzido para um determinado valor (isto é, DO = 0,2 neste procedimento) após a concentração de estressor é aumentada, a administração do estressor deve ser interrompido por pelo menos algumas gerações paradar tempo para adaptar estirpe.

Desenvolvimentos recentes na tecnologia de sequenciamento do genoma têm ajudado a compreensão das mutações que se desenvolvem em resposta a certas condições estressantes. Por exemplo, uma mutação no DNA altera um efeito sistémico particular que é benéfico para o ambiente dada (isto é, tolerância a um estressor tóxico). Assim, ALE pode ser utilizado para estudar a função do gene ou regulação da rede, ou como uma matéria-prima para 'evolução acelerada ". estudos Ale, também são úteis para simular o desenvolvimento de bactérias resistentes aos antibióticos, indicando os mecanismos pelos quais surgem estirpes bacterianas resistentes aos medicamentos perigosos. Como a trajetória da evolução é gravado sobre o genoma, descobrindo as alterações genéticas que levam aos fenótipos desejados (como a tolerância ao estresse) é o próximo obstáculo estirpes vez evoluídos são obtidos ^8. Entre as tecnologias de sequenciamento de próxima geração atualmente disponíveis, o plat Illumina e Ion Torrentformas são adequados para a detecção de pequenas substituições de nucleótidos ou indels que ocorrem nas estirpes evoluídos, e ambos são acessíveis. Como a detecção variante envolve geralmente mapeamento curto-lido das sequências de referência, a disponibilidade da sequência do genoma da estirpe ancestral é crucial. Mesmo que a sequência do genoma da estirpe fundador é disponível a partir de bases de dados públicas, é muitas vezes desejável para sequenciar o simultaneamente com o um evoluído, porque pode haver algumas diferenças adicionais na estirpe de partida real. Protocolos para identificação de mutação estão facilmente disponíveis através da web ou uma busca na literatura ^9,10. Por exemplo, BRESEQ é um gasoduto especialmente concebidos para a análise genômica de micróbios evoluiu em laboratório usando a próxima geração de dados de sequenciamento ^11. As comparações das cepas evoluíram em determinados marcos (por exemplo, nesta dados representativos, tipo selvagem, DST50, DST100 e DST160) pode fornecer a sequência da estirpe evoluídas e dar dicas sobre as consequências de um determinado estressor. Portanto, o conhecimento e aplicações de experimentos ALE, juntamente com a biologia do sistema e a identificação de variáveis ​​de perturbação sistêmicos, são esperados no futuro próximo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini-chemostat fermentor	Biotron Inc.	-	manufactured by special order
silicon tubing	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.
reservoir jar	Bellco	Media storage bottle	20 L
chemicals	Sigma-Aldrich	-	reagent grade
glucose	Sigma-Aldrich	G5767	ACS reagent
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS reagent, ≥99%
Na2HPO4·2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	ACS reagent, ≥99%
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	230391	ACS reagent, ≥98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	ACS reagent, ≥96%
thiamine·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	reagent grade, ≥99%
Na2·succinate·6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99%