We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.
microfluidic जांच (एमएफपी) तरल पदार्थ के nanoliter मात्रा सीमित द्वारा जैविक substrates पर स्थानीय रसायन शास्त्र के प्रदर्शन की सुविधा। एमएफपी, श्रेणीबद्ध hydrodynamic प्रवाह कारावास (hHFC) की एक विशेष कार्यान्वयन का प्रयोग, कई तरल पदार्थ एक साथ एक सब्सट्रेट के साथ संपर्क में लाया जाता है। स्थानीय रासायनिक क्रिया और तरल आकार देने hHFC का उपयोग कर, स्थानीय स्तर पर lysing और कोशिकाओं को हटाने के द्वारा सेल पैटर्न बनाने के लिए शोषण किया जाता है। एमएफपी की स्कैनिंग की क्षमता का उपयोग करके, सेल monolayers के उपयोगकर्ता परिभाषित पैटर्न बनाया जाता है। इस प्रोटोकॉल तेजी से, वास्तविक समय और स्थानिक नियंत्रित सेल patterning, जो चयनात्मक सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति दे सकते सक्षम बनाता है।
उनके पैतृक वातावरण में, जैविक ऊतकों में कोशिकाओं को उनके विकास, संगठन, और विकास के निर्देशन जैव रासायनिक और शारीरिक संकेतों की एक सीमा मानता है। इन संकेतों को समझना सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत के चुनिंदा जांच की आवश्यकता है। इस patterning सेल monolayers के लिए तरीकों का विकास जरूरी है। तरीके संस्कृति (patterning) में ज्यामितीय अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं को कोशिका जीव विज्ञान में भौतिक और रासायनिक संकेतों के व्यापक पढ़ाई के लिए सक्षम है। Patterning सेल परतों के लिए मौजूदा तरीकों में से अधिकांश 1 – 4 सतहों पर सेल आसंजन प्रोटीन जमा करने या substrates पर चयनात्मक विकास के लिए microfabricated स्टेंसिल के प्रयोग पर निर्भर करते हैं। इसके विपरीत, यहाँ हम एक विधि के लिए तेजी से बगल में पैटर्न सेल monolayers, यानी, कोशिकाओं संस्कृति में मौजूद है, monolayer के चयनित क्षेत्रों में कोशिकाओं को हटाने के द्वारा। तरीके कि प्रदर्शन ऐसी subtractive patterning 5 – 9 usually एक लेजर का उपयोग कर, अनजाने में जीवित कोशिकाओं को प्रभावित करने के लिए विशेष substrates, सतह के उपचार, जटिल ऑपरेशन, शारीरिक संपर्क या पृथक आवश्यकता होती है। हम यहाँ एक microfluidic जांच (एमएफपी) 10,11, एक गैर संपर्क स्कैनिंग microfluidic प्रौद्योगिकी है कि hydrodynamically एक सब्सट्रेट पर एक तरल किनारा का उपयोग करें। एमएफपी का एक महत्वपूर्ण घटक (चित्रा 1) microfabricated सिर microchannels युक्त है। जुड़े मंच नियंत्रण और दृश्य और प्रतिक्रिया (चित्रा 2) के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप स्कैनिंग के लिए तरल नियंत्रण के लिए सिरिंज पंप, चरणों के होते हैं। अपनी बुनियादी विन्यास में, एमएफपी सिर एक प्रसंस्करण तरल और कुछ विसर्जन तरल (चित्रा 3) के साथ मिलकर इंजेक्शन प्रसंस्करण तरल aspirating के लिए अन्य इंजेक्शन लगाने के लिए शीर्ष पर छिद्र के साथ दो microchannels, एक शामिल हैं। एमएफपी आपरेशन के दौरान, सुप्रीम सब्सट्रेट से एक निश्चित दूरी पर है। जब आकांक्षा प्रवाह की दर (क्यूए) sufficie हैइंजेक्शन प्रवाह की दर (क्यू i), यानी की तुलना में अधिक है ntly, क्यू एक: क्यू मैं ≥ 2.5, प्रसंस्करण तरल सब्सट्रेट पर ही सीमित है। यह एक hydrodynamic प्रवाह कारावास (एचएफसी) में यह परिणाम है। जो इस क्षेत्र में प्रसंस्करण तरल सब्सट्रेट के साथ सीधे संपर्क में है पदचिह्न करार दिया है। (≈ 10 -2 आरई) ठेठ परिचालन की स्थिति के लिए, एचएफसी के भीतर प्रसंस्करण तरल के प्रवाह को एक कम रेनॉल्ड्स संख्या के द्वारा होती है और एक उच्च पेक्लेट संख्या (पे ≈ 10 2)। यह संवहन रासायनिक प्रजातियों के बड़े पैमाने पर स्थानांतरण के प्राथमिक मोड होने के साथ लामिना शासन में तरल प्रवाह निकलता है। प्रवाह प्रसूति के लिए संख्यात्मक और विश्लेषणात्मक मॉडल कहीं वर्णित 12 – 14।
इस पत्र में, हम कई प्रसंस्करण तरल पदार्थ एक साथ सीमित के दृष्टिकोण है, जो कहा जाता है श्रेणीबद्ध एचएफसी (hHFC) 14 का उपयोग करें। एमएफपी साथ hHFC को लागू करने के लिए, दो additionaएल छिद्र इंजेक्शन और आकांक्षा के एक माध्यमिक स्रोत प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं। यह एक दूसरे तरल भीतर एक तरल सीमित करने के लिए सक्षम बनाता है। भीतर से (प्रोसेसिंग) तरल लाभ बाहरी (परिरक्षण) तरल द्वारा सब्सट्रेट पर आवारा मलबे से परिरक्षित जा रहा है। इसके अलावा, hHFC दो मोड में संचालन की अनुमति देता: (i) नेस्ट मोड, जिसमें आंतरिक एचएफसी संपर्क सतह (चित्रा 3 बी), और (ii) pinched मोड, जिसमें आंतरिक तरल खो देता में प्रसंस्करण तरल संपर्क और केवल बाहरी तरल सब्सट्रेट (चित्रा 3 सी) के साथ संपर्क में है। दो मोड के बीच स्विच उपयोगकर्ताओं के प्रभाव या सब्सट्रेट प्रसंस्करण को रोकने के लिए अनुमति देता है और सिर से सतह की खाई को नियंत्रित करने से या इंजेक्शन के प्रवाह के बीच अनुपात (क्यू I2 / क्यू i1) को बदलने के द्वारा हासिल की है। दिए गए चैनल ज्यामिति के लिए, सब्सट्रेट पर प्रसंस्करण तरल के प्रवाह की स्थिति पदचिह्न (चित्रा 3 डी) नियमन के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। सोडियम hydrऑक्साइड (NaOH) कोशिकाओं lyse करने के भीतरी प्रसंस्करण तरल के रूप में प्रयोग किया जाता है, और lysate लगातार सतह से aspirated है। क्योंकि प्रसंस्करण तरल पदार्थ की रासायनिक प्रभाव भीतरी एचएफसी पदचिह्न के लिए स्थानीय कर रहे हैं, सन्निकट कक्षों, बेफिक्र रहते हैं जो सेल सेल बातचीत के spatiotemporal के अध्ययन की अनुमति देता है। एमएफपी की स्कैनिंग कार्यक्षमता सेल पैटर्न के उपयोगकर्ता परिभाषित geometries (चित्रा 4) के निर्माण की अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रसंस्करण तरल रूप में NaOH के चुनाव को नीचे की ओर डीएनए विश्लेषण (चित्रा 7) रह सकते हैं।
हम सेल monolayers के subtractive patterning कि स्थानिक परिभाषित सेल पैटर्न की तेजी पीढ़ी सक्षम बनाता है के लिए एक बहुमुखी प्रोटोकॉल उपस्थित थे। सेल monolayers के चुनिंदा सेल hHFC में प्रसंस्करण तरल रूप में NaOH का उपयोग किया जाता है। NaOH तत्क्षण प्रोटीन कोशिका झिल्ली में निहित denatures। हम lysate के बहाव के प्रसंस्करण सुनिश्चित करने के लिए NaOH के 50 मिमी एकाग्रता का उपयोग करें। यह एकाग्रता अधिक तेजी से सेल को हटाने के लिए बढ़ाया जा सकता है, बशर्ते lysate डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण एक उद्देश्य नहीं है। hHFC सुनिश्चित करता है कि सेल monolayer के असंसाधित आसपास के क्षेत्रों अप्रभावित रहते हैं और या तो पैटर्न के विस्तार या कोशिकाओं के अन्य संपत्तियों की जांच कर लिए उपलब्ध हैं।
सेल हटाने की दर दोनों रसायन शास्त्र और कतरनी प्रवाह द्वारा प्रस्तुत की एक समारोह है। हम रसायन विज्ञान प्रमुख सेल हटाने के लिए प्रवाह दरों का परिचालन सीमा का चयन करें। 20 & # – 10 की स्कैनिंग वेग181; मीटर / सेकंड 6 के एक NaOH इंजेक्शन प्रवाह की दर का उपयोग कर – 8 μl / मिनट 'तेजी' subtractive patterning की सुविधा के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। सेल हटाने की तीव्र दर कुछ चुनौतियों सतह मुद्रण द्वारा सामना आधारित patterning दृष्टिकोण 20,21 संबोधित करते हैं। इन विधियों, उदाहरण के लिए, स्थानिक परिभाषित क्षेत्रों में कोशिकाओं के विकास को सीमित करने के लिए सूक्ष्म संपर्क मुद्रण और कोशिकाओं के बाद बोने पैटर्न के माध्यम से प्राप्त करने के लिए कोशिका आसंजन प्रोटीन के चुनिंदा बयान से एक तंत्र की आवश्यकता है। वे कम throughput द्वारा सीमित है और पैटर्न पीढ़ी के लिए कई अनुक्रमिक चरणों के साथ ही प्रत्येक पैटर्न के लिए एक नया स्टैंसिल / डाक टिकट की आवश्यकता होती है। वर्णित विधि परिभाषित क्षेत्रों पर कोशिकाओं के चुनिंदा विकास की आवश्यकता नहीं है, और मुद्रण के विपरीत subtractive patterning प्रदर्शन से कई सीमाओं पर काबू, जबकि सेल संस्कृति सब्सट्रेट के किसी भी अतिरिक्त उपचार की आवश्यकता नहीं है।
प्रोटोकॉल इस पत्र में उल्लिखित, patterning सेल monolayers के throughput के साथवृद्धि हुई है, जबकि उत्पन्न पैटर्न के तत्काल दृश्य प्रतिक्रिया प्राप्त करने के। इस पैटर्न के वास्तविक समय संशोधन की सुविधा। इस तरह के नियंत्रण परिदृश्य में जो सतह पर एक दिया सेल व्यवहार्यता सजातीय नहीं है में महत्वपूर्ण हो सकता है। विधि का एक अन्य लाभ यह है कि एक ही सिर और रसायन शास्त्र जिससे एक नमूनों सेल monolayer पैदा करने में शामिल कदम की संख्या को कम करने, कई पैटर्न उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
सिर में चैनलों और सिर ज्यामिति के आयामों के आवेदन की जरूरतों के हिसाब से बढ़ाया जा सकता है, इस प्रकार patterning के संकल्प पर नियंत्रण की अनुमति देता है। वर्तमान काम में सभी प्रयोगों तय एपर्चर आयामों के साथ एक एमएफपी सिर का उपयोग कर, विशेष रूप से आंतरिक छिद्र के साथ 100 × 100 माइक्रोन और बाहरी छिद्र पर 200 × 100 माइक्रोन पर प्रदर्शन किया गया। बड़ा बाहरी छिद्र के साथ इस डिजाइन से छिद्र के clogging बिना hHFC के सतत संचालन सुनिश्चित करने के लिए चुना गया थाआवारा सेल मलबे। हम सेल हटाने में सफल परिणाम के साथ भीतरी एपर्चर आयामों के साथ सिर का परीक्षण किया है 50 × 50 माइक्रोन और उन दोनों के बीच 50 माइक्रोन रिक्ति,। छोटे छिद्र का प्रयोग करें, 10 × 10 माइक्रोन से नीचे 10 माइक्रोन अंतर के साथ, एक छोटे पदचिह्न आकार (~ 30 × 30 माइक्रोन) के लिए स्केलिंग की अनुमति होगी, इस प्रकार patterning में एक उच्च संकल्प सक्षम करने से। हम परिचालन मुद्दों मनाया एपर्चर छोटे से कम 10 माइक्रोन आकार के साथ की वजह से विविक्त clogging करने के लिए। क्योंकि इस तरह के परिचालन कठिनाइयों के, 100 माइक्रोन संकल्प की वर्तमान सीमा है और इस तरह वर्णित तकनीक की एक सीमा है। हालांकि, हम इस hHFC के तरल को आकार देने की क्षमता का उपयोग कर पता कर सकते हैं। हमने दिखा दिया है कि सेल को हटाने का संकल्प क्यू I2 / क्यू I1 को नियंत्रित करने से एपर्चर आयामों का सेट दिया के लिए देखते जा सकता है (चित्रा 4 बी) और शीर्ष करने वाली सब्सट्रेट खाई 10,14। वर्तमान काम में इस्तेमाल किया चरणों 100 एनएम का एक न्यूनतम कदम आकार की है।इन चलाया मापदंडों का एक संयोजन पदचिह्न आकार और स्कैनिंग दूरी के संदर्भ में सेल हटाने के स्थानिक संकल्प में सुधार कर सकते हैं।
नमूनों सह संस्कृतियों विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच विशेष सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए वांछित हैं, अनुक्रमिक बोने और patterning प्रोटोकॉल का वर्णन का उपयोग किया जा सकता है। अंत में, उच्च गुणवत्ता के amplifiable डीएनए डीएनए में विलक्षण चोटी से, lysate से प्राप्त किया जा सकता स्पष्ट रूप वक्र (7 चित्रा देखें) पिघला। हम चारों ओर 1.6 एक भी पदचिह्न (लगभग 300 कोशिकाओं) qPCR का उपयोग करते हुए, जो सैद्धांतिक उम्मीद (6-8 पीजी / सेल) के करीब है से एनजी के एक डीएनए मात्रा का मूल्यांकन किया। यह कई डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं के लिए है, जबकि किसी भी डीएनए अलगाव तरीकों का उपयोग हो गईं उपयुक्त निकाले डीएनए की एक मात्रा इंगित करता है। इस के लिए रास्ते खुल संवर्धित कोशिकाओं की जांच कर रही स्थानीय डीएनए विश्लेषण के आधार पर। hHFC की क्षमता तरल पदार्थ आकार देने के लिए भी एसी पर जीवित कोशिकाओं और प्रोटीन जमा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताtivated सतहों, जो subtractive patterning और अनुक्रमिक सह संवर्धन इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत के साथ संयोजन में संस्कृति substrates पर जटिल सेल और सेल मैट्रिक्स पैटर्न के निर्माण के लिए सक्षम बनाता है। बहुमुखी प्रतिभा और सेल monolayers की hHFC आधारित subtractive patterning और निकाले कोशिकाओं पर डीएनए विश्लेषण प्रदर्शन करने की संभावना के द्वारा प्रदान नियंत्रण, जीव के लिए सेट सेल बातचीत से जुड़े spatially हल अध्ययन करने के लिए एक नया शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European Research Council (ERC) Starting Grant, under the 7th Framework Program (Project No. 311122, BioProbe). We thank Dr. Julien Autebert and Marcel Buerge for technical assistance and discussions during the development of the protocol and the platform. Prof. Petra Dittrich (ETH Zurich), Prof. Bradley Nelson (ETH Zurich), Dr. Bruno Michel and Dr. Walter Riess are acknowledged for their continuous support.
Materials | |||
Microfluidic Probe (MFP) | NA | NA | Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research – Zürich |
Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers | ThermoFisher scientific, USA | 154461 | 2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm^2 and capable of holding upto 3 ml of media volume |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals and cell lines used | |||
Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B | SigmaAldrich chemicals, USA | S5881, 252859, E9884, R6626 | Chemicals used for processing and shielding liquids |
Proteinase K | Qiagen, Germany | 19131 | protease to digest denatuired proteins |
Deconex 16 Plus | Bohrer Chemie, Switzerland | NA | Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning. |
DNA away | ThermoFisher scientific, USA | 7010 | Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases. |
DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement | ThermoFisher scientific, USA | 10566-016 | Culturing medium for epithelial cells. |
CellTracker Green CMFDA dye | ThermoFisher scientific, USA | C7025 | Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours. |
CellTracker Orange CMRA dye | ThermoFisher scientific, USA | C34551 | |
β-actin genomic primers for qPCR | Integrated DNA technologies, USA | NA | Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR. |
MCF7 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-22 | Cell lines used to produce co-cultures. |
MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-26 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment and fluidic connections | |||
Motorized high precision stages | Custom machined components. Linear axis motors from LANG GmBH, Germany | Customized linear axis stages from LT series | 3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port. |
Syringes | Hamilton, Switzerland | 1700 TLLX series | Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range. |
Nemesys low pressure syringe pumps | cetoni GmbH, Germany | NA | Component of pumping station. |
Circular M1-connector | Dolomite microfluidics, United Kingdom | 3000051 | Interface between vias in MFP head and tubing |
Tilt/rotation stage Goniometer | OptoSigma, USA | KKD-25C | Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex |
DS Fi2 HD color camera (CCD) | Nikon, Switzerland | NA | Controlled using DS-U3 controller unit |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Win – Commander | LANG GmBH, Germany | NA | Stage control software. |
Qmix Elements | cetoni GmbH, Germany | NA | Pump control software. |
NIS Elements | Nikon, Switzerland | NA | Basic research module for image acquisition and analysis. |