We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.
미세 유체 프로브 (MFP)는 액체의 나노 리터 볼륨을 한정하여 생물학적 기판에 지역 화학을 수행 용이하게한다. 복합기, 계층 유체 흐름 제한 (hHFC)의 한 특정의 구현을 사용하여, 복수의 액체를 동시에 기판과 접촉하게된다. hHFC를 사용하여 로컬 화학적 작용 및 액체 정형 로컬 용균 세포를 제거함으로써 세포의 패턴을 만들기 위해 이용된다. 복합기의 스캔 기능을 이용하여, 세포 단일 층의 사용자 정의 패턴이 생성됩니다. 이 프로토콜은 빠르게 실시간 선택적 세포 – 세포 및 세포 – 기질 상호 작용을 연구 할 수 있도록 공간적으로 제어 된 세포의 패터닝을 가능하게한다.
그 나라의 환경에서, 생체 조직에서의 세포 성장, 조직 및 발달을 유도 생화학 적 및 물리적 큐의 범위를 인식. 이러한 신호를 이해하는 것은 세포 – 세포 및 세포 – 기질 상호 작용을 선택적으로 조사를 필요로한다. 이는 패터닝 세포 단층 방법의 개발을 필요로한다. 방법 문화 (패턴)에 기하학적으로 별도의 다른 세포 유형의 세포 생물학에 물리적, 화학적 단서의 폭 넓은 연구를 할 수 있습니다. 패터닝 세포층의 현재 방식은 대부분 1-4은 표면에 세포 접착 성 단백질을 증착하거나 기판 상에 선택 성장을위한 미세 스텐실 사용에 의존한다. 대조적으로, 여기에 우리는 단일 층의 선택된 영역에서 셀을 제거함으로써, 문화에 빠르게 패턴 셀, 즉 현장에서 단일 층, 세포를 방법을 제시한다. 9 usua – 같은 감산 패턴 (5)을 수행하는 방법에서야 실수 생균 영향을 레이저를 이용하여 특수 기판, 표면 처리, 복잡한 동작을 물리적 접촉 또는 제거를 필요로한다. 우리는 여기에 미세 프로브 (MFP) 10, 11, 유체 역학적으로 기판 상에 액체를 한정하는 비접촉 스캐닝 마이크로 유체 기술을 사용한다. 복합기의 한 가지 중요한 구성 요소는 마이크로 채널을 포함하는 미세 가공 헤드 (도 1)이다. 관련 플랫폼 제어 및 시각화 및 피드백 (그림 2)에 대한 거꾸로 현미경을 스캔하기위한 주사기 액체 제어를위한 펌프 단계로 구성되어 있습니다. 그 기본 구성에있어서, MFP 헤드는 처리 액 및 일부 침지 액체 (도 3a)과 함께 사출 처리 액을 흡인하기위한 다른 주입 정점에 구멍 두 마이크로 하나를 포함한다. MFP 동작 동안, 정점의 기판으로부터 고정 된 거리에있다. 되면 흡입 유량 (QA)이있다 sufficie즉, 주입 유량 (Q의 I) ntly보다 높은 Q A : Q 난 ≥ 2.5, 처리 액을 기판 상에 한정된다. 이것은 유체 유동 제한 (HFC)을 초래한다. 처리 액이 기판과 직접 접촉하는 영역의 면적을 지칭한다. 통상적 인 동작 조건의 경우, HFC 내의 처리 액의 흐름이 저 레이놀즈 수 특징 (≈ 10-2 재) 높은 Péclet 번호 (PE ≈ 10 2). 이 대류 화학 종의 물질 전달의 기본 모드 인 상태 층류 정권에서 액체 흐름을 의미한다. (14) – 흐름 감금에 대한 수치와 분석 모델은 다른 곳에서 12 설명되어 있습니다.
본 논문에서는 계층 HFC (hHFC) (14)라고 동시에 구속 다중 처리 액체의 접근 방식을 사용합니다. 복합기와 hHFC을 구현하려면, 두 additiona난 구멍은 주입과 흡입의 보조 소스를 제공하기 위해 필요하다. 이것은 제 2 액체 내에서 하나의 액체를 한정하기 위해 우리가 할 수 있습니다. 으로부터 내측 (처리) 액체 이점 외측 (차폐) 액에 의해 기판 상에 부유 먼지로부터 보호된다. 또한 hHFC 두 가지 모드에서 동작 수는 (i) 중첩 모드되는 내측 HFC 접촉 표면 (도 3b) 및 (ii) 상기 핀치 모드가되는 내부 액체 상실의 처리 액 접촉 바깥 쪽의 액체는 기판 (도 3c)와 접촉한다. 두 모드 사이의 전환은 사용자가 효과 나, 기판 처리를 중지 할 수 있으며, 헤드에 대한 표면의 간격을 제어함으로써, 또는 분사 흐름 사이의 비율 (Q의 I2 / Q는 I1)를 변화시킴으로써 달성된다. 소정의 채널 구조의 경우, 기판 상에 처리 액의 풋 프린트는 유동 조건 (도 3D)을 조절함으로써 제어 될 수있다. 나트륨 히드 록 사이드산화물 (수산화 나트륨) 세포를 용해시키기 위하여 내부 처리 액으로 사용하고, 용 해물을 연속적으로 표면으로부터 흡입된다. 처리 액의 화학적 효과 HFC 내부 공간에 국소되므로, 인접 셀은 세포 – 세포 상호 작용의 시공간 연구를 허용하는 교란 남아있다. MFP의 스캐닝 기능은 셀 패턴의 사용자 정의 된 형상 (도 4)의 생성을 허용한다. 또한, 처리 액의 NaOH 등의 선택은 하류 DNA 분석 (도 7)를 수용한다.
우리는 공간적으로 정의 셀 패턴의 신속한 생성을 가능 세포 단층의 감산 패터닝 다목적 프로토콜을 제시한다. 세포 단일 층의 선택적 용해가 hHFC의 처리 액으로의 NaOH를 사용하여 수행된다. NaOH의 순간적 세포막에 포함되는 단백질을 변성시킨다. 우리는 해물의 다운 스트림 처리를 보장하기 위해 NaOH를 50 mM의 농도의 사용을 권장합니다. 이 농도를 제공 해물 하류 처리 대물없고,보다 신속한 세포 제거를 위해 증가 될 수있다. hHFC는 세포 단층의 처리되지 않은 주변 지역은 영향을받지과 패턴을 확장하거나 세포의 다른 속성을 프로빙 중 하나를 사용할 수 있습니다 보장합니다.
셀 제거율 흐름에 의해 제공되는 화학 전단의 함수이다. 우리는 지배적 화학 셀을 제거하도록 유량의 동작 범위를 선택한다. 20 & # – (10)의 스캔 속도181; m / 6의 NaOH를 주입 유량을 사용하여 초 – 8 μL / min으로 급속 '감산 패터닝을 용이하게하기 위해 사용된다. 세포 제거의 빠른 속도 기반의 패터닝 (20, 21)에 근접 표면 인쇄가 직면 한 몇 가지 문제를 해결합니다. 이러한 방법은 미세 접촉 인쇄 패턴을 수득 셀 후속 시드를 통해 세포 부착 단백질을 선택적으로 증착하여, 예를 들어, 공간적으로 정의 된 영역에있는 세포의 성장을 제한하는 메커니즘을 필요로한다. 그들은 낮은 처리량에 의해 제한 및 패턴 생성에 대한 몇 가지 순차적 단계뿐만 아니라 각 패턴에 대한 새로운 스텐실 / 스탬프를 필요로한다. 세포 배양 기판의 추가적인 처리를 필요로하지 않는 반면에 기재된 방법은, 정의 된 영역에 대한 세포의 선택적 성장을 요구하고, 인쇄 달리 감산 패터닝을 수행함으로써 몇몇의 한계를 극복하지 않는다.
이 문서에 설명 된 프로토콜, 패터닝 세포 단층의 처리량생성 된 패턴의 즉각적인 시각적 피드백을 얻는 동안 증가한다. 이것은 패턴의 실시간 수정을 용이하게한다. 이러한 제어는 주어진 표면에 세포 생존 능력이 균일하지 않은 시나리오에 중요 할 수 있습니다. 상기 방법의 또 다른 장점은 동일한 헤드가 화학하여 패터닝 세포 단일 층을 생성에 관련된 단계의 수를 감소시키는 복수의 패턴을 생성하는데 사용될 수 있다는 것이다.
헤드의 채널 헤드 구조의 치수는 이에 따라 패터닝의 해상도를 제어 할 수 있도록, 애플리케이션의 요구 사항에 따라 확장 할 수있다. 현재 작업의 모든 실험은 200 × 100 μm의 100 × 100 μm의 바깥 쪽 구멍에서 내부 구멍으로 특히, 고정 조리개 크기를 가진 MFP 헤드를 사용하여 수행 하였다. 큰 외부 구멍이 설계에 의해 구멍 막힘없이 hHFC의 연속 동작을 보장하기 위해 선택되었다부유 세포 파편. 우리는 세포 제거에 성공 결과, 내부 구멍 크기 50 × 50 μm의 사이 50 μm의 간격을 머리를 테스트했습니다. 아래 10 × 10 μm의 10 μm의 간격으로 작은 구멍의 사용은, 따라서 패턴의 높은 해상도를 가능하게, 더 작은 풋 프린트 크기 (~ 30 × 30 μm의)에 스케일링을 허용합니다. 조리개 인해 미립자에서 막힘에보다 작은 10 μm의 크기와 우리는 운영 문제를 관찰했다. 이러한 동작으로 인해 어려움 100 μm의 해상도의 전류 제한 및 기재된 기술 이에 제한이다. 그러나, 우리는 hHFC의 액체 성형 능력을 사용하여이 문제를 해결 할 수있다. 우리는 셀 제거의 해상도 Q I2 / I1 Q를 제어하여 개구 치수의 주어진 세트에 대해 조정될 수 있음을 보여 주었다 (도 4B를)과 정점 – 대 – 기판 간격 10,14. 현재 작업에 사용되는 단계는 100nm의 최소 스텝 사이즈를 갖는다.이러한 제어 파라미터들의 조합은 풋 프린트 크기 및 주사 거리의 관점에서 셀 제거의 공간 분해능을 향상시킬 수있다.
패터닝 공동 배양 상이한 세포 유형 간의 특정 세포 – 세포 상호 작용을 연구하는 것이 요구되는 경우, 순차 시드 및 패터닝 기술 된 프로토콜을 사용하여 수행 될 수있다. 마지막으로, 고품질의 증폭 DNA는 DNA의 단일 피크로 명백한 바와 같이, 용 해물로부터 수득 될 수 곡선 (도 7 참조) 용융. 우리는 약 1.6 이론적 기대 (6-8 페이지 / 셀)에 가까운 qPCR에를 사용하여 단일 풋 프린트 (약 300 세포)에서 ng를의 DNA의 양을 평가 하였다. 이것은 어떤 DNA 분리 방법의 사용을 미연에 방지하면서 여러 다운 스트림 처리에 적합한 추출 된 DNA의 양을 나타낸다. 이것은을위한 길 열어 배양 된 세포의 프로빙 지역의 DNA 분석을 기반. 액체 형상 hHFC 능력은 AC에 대한 생균 및 단백질을 증착하는데 사용될 수있다이 프로토콜에서 제공 감산 패터닝 순차적 공동 배양과 함께 배양 기판에 조립 전지 셀 매트릭스 패턴의 생성을 가능 tivated 표면. 범용성 및 hHFC 기반 감산 세포 단층의 패턴 추출 된 세포 DNA의 분석을 수행 할 수있는 가능성에 의해 제공되는 제어가 세포 상호 작용을 포함하는 공간 분해 연구를 수행하기 위해 생물학 설정 강력한 새로운 툴을 제공한다.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European Research Council (ERC) Starting Grant, under the 7th Framework Program (Project No. 311122, BioProbe). We thank Dr. Julien Autebert and Marcel Buerge for technical assistance and discussions during the development of the protocol and the platform. Prof. Petra Dittrich (ETH Zurich), Prof. Bradley Nelson (ETH Zurich), Dr. Bruno Michel and Dr. Walter Riess are acknowledged for their continuous support.
Materials | |||
Microfluidic Probe (MFP) | NA | NA | Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research – Zürich |
Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers | ThermoFisher scientific, USA | 154461 | 2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm^2 and capable of holding upto 3 ml of media volume |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals and cell lines used | |||
Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B | SigmaAldrich chemicals, USA | S5881, 252859, E9884, R6626 | Chemicals used for processing and shielding liquids |
Proteinase K | Qiagen, Germany | 19131 | protease to digest denatuired proteins |
Deconex 16 Plus | Bohrer Chemie, Switzerland | NA | Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning. |
DNA away | ThermoFisher scientific, USA | 7010 | Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases. |
DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement | ThermoFisher scientific, USA | 10566-016 | Culturing medium for epithelial cells. |
CellTracker Green CMFDA dye | ThermoFisher scientific, USA | C7025 | Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours. |
CellTracker Orange CMRA dye | ThermoFisher scientific, USA | C34551 | |
β-actin genomic primers for qPCR | Integrated DNA technologies, USA | NA | Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR. |
MCF7 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-22 | Cell lines used to produce co-cultures. |
MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-26 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment and fluidic connections | |||
Motorized high precision stages | Custom machined components. Linear axis motors from LANG GmBH, Germany | Customized linear axis stages from LT series | 3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port. |
Syringes | Hamilton, Switzerland | 1700 TLLX series | Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range. |
Nemesys low pressure syringe pumps | cetoni GmbH, Germany | NA | Component of pumping station. |
Circular M1-connector | Dolomite microfluidics, United Kingdom | 3000051 | Interface between vias in MFP head and tubing |
Tilt/rotation stage Goniometer | OptoSigma, USA | KKD-25C | Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex |
DS Fi2 HD color camera (CCD) | Nikon, Switzerland | NA | Controlled using DS-U3 controller unit |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Win – Commander | LANG GmBH, Germany | NA | Stage control software. |
Qmix Elements | cetoni GmbH, Germany | NA | Pump control software. |
NIS Elements | Nikon, Switzerland | NA | Basic research module for image acquisition and analysis. |