We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.
Den mikroflödessystem sond (MFP) underlättar utförande av lokal kemi på biologiska substrat genom att begränsa nanolitervolymer vätskor. Använda en speciell implementering av MFP, den hierarkiska hydrodynamiskt flöde förlossningen (hHFC), multipla vätskor samtidigt bringas i kontakt med ett substrat. Lokal kemisk påverkan och flytande formning med hjälp av hHFC, utnyttjas för att skapa cellmönster genom lokalt lyse och avlägsna celler. Genom att utnyttja scanning förmåga MFP är användardefinierade mönster av cellmonolager skapas. Detta protokoll möjliggör snabb, realtid och spatialt kontrollerad cell mönstring, vilket kan tillåta selektiv cell-cell och cell-matrix interaktionsstudier.
I sin naturliga miljö, celler i biologiska vävnader upplever en rad biokemiska och fysiska signaler som styr deras tillväxt, organisation och utveckling. Att förstå dessa signaler kräver selektiv undersökning av cell-cell och cell-matrix-interaktioner. Detta gör det nödvändigt att utveckla metoder för mönstring cellmonoskikt. Metoder för att geometriskt skilda olika celltyper i odling (mönstring) möjliggör breda studier av fysikaliska och kemiska signaler i cellbiologi. De flesta av de nuvarande metoder för mönstring cellager 1-4 beror på att deponera cellvidhäftningsproteiner på ytor eller använda mikrofabricerade schabloner för selektiv tillväxt på substrat. I kontrast, här presenterar vi en metod för att snabbt mönstercellmonoskikt in situ, det vill säga, celler i odling, genom att ta bort celler i valda områden av monoskiktet. Metoder som utför sådana subtraktiv mönstring 5-9 usually kräver specialiserad substrat, ytbehandling, komplicerad operation, fysisk kontakt eller ablation med hjälp av en laser, oavsiktligt påverkar levande celler. Vi här använder en mikroflödessond (MFP) 10,11, en beröringsfri skanning mikroflödesteknik som hydrodynamiskt begränsar en vätska på ett substrat. En viktig komponent i MFP är mikrofabricerade huvudet innehåller mikro (Figur 1). Den tillhörande plattformen består av sprutpumpar för vätskeregler, scener för avsökning kontroll och ett omvänt mikroskop för visualisering och återkoppling (figur 2). I sin grundkonfiguration innefattar MFP huvudet två mikrokanaler med öppningar i apex, en för injicering av en behandlingsvätska och den andra för att aspirera den injicerade behandlingsvätskan tillsammans med viss nedsänkning vätska (figur 3A). Under MFP drift är toppen på ett fast avstånd från underlaget. När aspirationsflödeshastigheten (Qa) är sufficiently högre än injektionsflödeshastigheten (Q i), det vill säga, Qa: Qi ≥ 2,5, processvätskan är begränsad på substratet. Detta resulterar i ett hydrodynamiskt flöde inneslutning (HFC). Den region i vilken processvätskan är i direkt kontakt med substratet benämnes fotavtryck. För normala driftsförhållanden, är flödet av processvätskan inuti HFC kännetecknas av ett lågt Reynolds tal (Re ≈ 10 -2) och en hög Péclet nummer (Pe ≈ 10 2). Detta innebär vätskeflöden i laminärt regim med konvektion är det primära sättet att massöverföring av kemiska ämnen. De numeriska och analytiska modeller för flödes förlossning beskrivs någon annanstans 12-14.
I detta dokument använder vi tillvägagångssätt samtidigt begränsande flera processvätskor, som kallas hierarkisk HFC (hHFC) 14. För att genomföra hHFC med MFP, två additional öppningar behövs för att ge en sekundär källa injektions och aspiration. Detta gör det möjligt för oss att begränsa en vätska i en andra vätska. De inre (bearbetning) flytande förmåner från att avskärmas från strö skräp på substratet genom yttre (avskärmning) vätska. Dessutom hHFC möjliggör drift i två lägen: (i) den kapslade läget, där processvätskan i de inre HFC i kontakt med ytan (figur 3B), och (ii) den strypta läget, i vilket den inre vätskan förlorar kontakt och endast den yttre vätskan är i kontakt med substratet (figur 3C). Växla mellan de två lägena tillåter användare att utföra eller stoppa behandlingen av substratet och uppnås genom att styra head-to-yta gap eller genom att ändra förhållandet mellan injektionsströmmarna (Q i2 / Q i1). För en given kanalgeometri, kan fotavtryck av processvätskan på substratet styras genom modulering av flödesförhållanden (figur 3D). natrium-hydroxid (NaOH) används som det inre processvätskan för att lysera cellerna, och lysatet kontinuerligt aspireras från ytan. Eftersom de kemiska effekterna av processvätskan är lokaliserade till den inre HFC fotavtryck, de intilliggande cellerna förblir oberörd, som tillåter Spatiotemporal studier av cell-cell-interaktioner. Skannings funktionalitet MFP möjliggör skapandet av användardefinierade geometrier av cellmönster (Figur 4). Vidare är valet av NaOH som processvätska rymmer nedströms DNA-analys (Figur 7).
Vi presenterar en mångsidig protokoll för subtraktiv mönstring av cellmonoskikt som möjliggör snabb generering av rumsligt definierade cellmönster. Selektiv lysis av cellmonoskikt utförs med användning av NaOH som processvätskan i hHFC. NaOH denaturerar momentant de proteiner som finns i cellmembranet. Vi rekommenderar användning av 50 mM koncentration av NaOH för att säkerställa nedströms bearbetning av lysatet. Denna koncentration kan ökas för snabbare cell avlägsnande, förutsatt lysat nedströms behandling är inte ett mål. Den hHFC säkerställer att de obearbetade omgivande områden av cellmonoskiktet förblir opåverkade och är tillgängliga för antingen expandera mönster eller sondera andra egenskaper hos cellerna.
Hastigheten för avlägsnande cell är en funktion av både kemin och skjuvning presenteras av flödet. Vi väljer en räckvidd på flödeshastigheter för att ha kemi dominerande cell bort. Avsökningshastigheter av 10-20 & #181; m / sek med användning av en NaOH insprutningsflödeshastighet på 6-8 l / min används för att underlätta "snabb" subtraktiv mönstring. Den snabba hastigheten för avlägsnande cell tar några utmaningar som ytan utskrift möter baserat mönstring närmar 20,21. Dessa metoder kräver en mekanism för att begränsa tillväxten av celler i rumsligt avgränsade områden, t ex genom selektiv avsättning av cellvidhäftningsproteiner via mikro-kontakttryckning och efterföljande ympning av celler för att erhålla mönstret. De begränsas av låg genomströmning och kräver flera på varandra följande steg för mönstergenerering samt en ny stencil / stämpel för varje mönster. Den beskrivna metoden kräver inte selektiv tillväxt av celler på definierade områden, och övervinner flera begränsningar genom att utföra subtraktiv mönstring i motsats till utskrift, utan att kräva någon ytterligare behandling av cellodlings-underlaget.
Med det protokoll som beskrivs i detta dokument, genomströmningen av mönstringscellmonoskiktökas, och samtidigt erhålla omedelbar visuell feedback av mönstret genereras. Detta underlättar realtids modifiering av mönstren. En sådan kontroll kan vara avgörande i situationer där cellviabilitet på en given yta är inte homogen. En annan fördel med förfarandet är att samma huvud och kemi kan användas för att generera flera mönster, vilket minskar antalet steg som är involverade i generering av ett mönstrat cellmonoskiktet.
Dimensionerna på kanalerna i huvudet och geometri kan skalas i enlighet med kraven i ansökan, vilket möjliggör kontroll över upplösningen av mönstringen. Alla experiment i det pågående arbetet utfördes med hjälp av en MFP huvud med fasta dimensioner bländare, särskilt med inre öppningar på 100 x 100 pm och yttre öppningar på 200 x 100 pm. Denna design med större yttre öppningar valdes för att säkerställa kontinuerlig drift av hHFC utan att täppa till de hål genomströ celldebris. Vi har testat huvuden med inre öppningsmått 50 × 50 pm och 50 pm avståndet mellan dem, med lyckat resultat i avlägsna cell. Användning av mindre öppningar, ner till 10 x 10 ^ m med 10 um mellanrum, skulle tillåta skalning till en mindre fotavtryck storlek (~ 30 × 30 um), vilket möjliggör en högre upplösning i mönstring. Vi observerade operativa frågor med öppningsstorlekar mindre än 10 pm på grund av igensättning av partiklar. På grund av sådana operativa svårigheter är 100 ^ m den aktuella gränsen för upplösning och därmed en begränsning av den beskrivna tekniken. Men vi kan lösa detta genom att använda flytande formnings förmåga hHFC. Vi har visat att upplösningen för avlägsnande cell kan ställas in för en given uppsättning av öppningsdimensioner genom att styra Q I2 / Q I1 (figur 4b) och spetsen till substratgapet 10,14. Stegen som används i det pågående arbetet har en minsta stegstorlek på 100 nm.En kombination av dessa styrbara parametrar kan förbättra den rumsliga upplösningen i avlägsnande cell i termer av fotavtrycket storlek och avsökningsavståndet.
Om mönstrade co-kulturer önskas för att studera specifika cell-cell interaktioner mellan olika celltyper, kan utföras sekventiell sådd och mönstring med hjälp av det protokoll som beskrivs. Slutligen kan amplifierbar DNA av hög kvalitet erhållas från lysatet, som framgår av singularis topp i DNA smältkurvan (se figur 7). Vi utvärderade ett DNA kvantitet av cirka 1,6 ng från en enda fotavtryck (ca 300 celler) med användning av qPCR, vilket är nära den teoretiska förväntan (6-8 pg / cell). Detta tyder på en kvantitet av det extraherade DNA lämplig för flera nedströmsprocesser medan man undviker användning av DNA-isoleringsmetoder. Detta öppnar möjligheter för DNA-analys-baserade lokala sondering av odlade celler. Förmågan hos hHFC att forma vätskor kan också användas för att avsätta levande celler och proteiner på acaktiveras ytor, vilket i kombination med den subtraktiva mönstring och sekventiell sam-odling presenteras i detta protokoll möjliggör skapandet av komplexa cell- och cell-matrix mönster på kultursubstrat. Den mångsidighet och kontrollen som tillhandahålls av hHFC-baserad subtraktiv mönstring av cellmonoskikt och möjligheten att utföra DNA-analys på de extraherade cellerna, ger ett kraftfullt nytt verktyg inställd på biologer att utföra rumsligt upplösta studier med cellinteraktioner.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European Research Council (ERC) Starting Grant, under the 7th Framework Program (Project No. 311122, BioProbe). We thank Dr. Julien Autebert and Marcel Buerge for technical assistance and discussions during the development of the protocol and the platform. Prof. Petra Dittrich (ETH Zurich), Prof. Bradley Nelson (ETH Zurich), Dr. Bruno Michel and Dr. Walter Riess are acknowledged for their continuous support.
Materials | |||
Microfluidic Probe (MFP) | NA | NA | Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research – Zürich |
Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers | ThermoFisher scientific, USA | 154461 | 2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm^2 and capable of holding upto 3 ml of media volume |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals and cell lines used | |||
Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B | SigmaAldrich chemicals, USA | S5881, 252859, E9884, R6626 | Chemicals used for processing and shielding liquids |
Proteinase K | Qiagen, Germany | 19131 | protease to digest denatuired proteins |
Deconex 16 Plus | Bohrer Chemie, Switzerland | NA | Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning. |
DNA away | ThermoFisher scientific, USA | 7010 | Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases. |
DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement | ThermoFisher scientific, USA | 10566-016 | Culturing medium for epithelial cells. |
CellTracker Green CMFDA dye | ThermoFisher scientific, USA | C7025 | Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours. |
CellTracker Orange CMRA dye | ThermoFisher scientific, USA | C34551 | |
β-actin genomic primers for qPCR | Integrated DNA technologies, USA | NA | Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR. |
MCF7 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-22 | Cell lines used to produce co-cultures. |
MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-26 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment and fluidic connections | |||
Motorized high precision stages | Custom machined components. Linear axis motors from LANG GmBH, Germany | Customized linear axis stages from LT series | 3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port. |
Syringes | Hamilton, Switzerland | 1700 TLLX series | Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range. |
Nemesys low pressure syringe pumps | cetoni GmbH, Germany | NA | Component of pumping station. |
Circular M1-connector | Dolomite microfluidics, United Kingdom | 3000051 | Interface between vias in MFP head and tubing |
Tilt/rotation stage Goniometer | OptoSigma, USA | KKD-25C | Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex |
DS Fi2 HD color camera (CCD) | Nikon, Switzerland | NA | Controlled using DS-U3 controller unit |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Win – Commander | LANG GmBH, Germany | NA | Stage control software. |
Qmix Elements | cetoni GmbH, Germany | NA | Pump control software. |
NIS Elements | Nikon, Switzerland | NA | Basic research module for image acquisition and analysis. |