Las células madre neurales (NSC) se refieren a células que pueden auto-renovarse y diferenciarse en los tres linajes neuronales. A continuación, se describe un protocolo para determinar la frecuencia NSC en una población celular dada usando neurosphere formación y diferenciación en condiciones clonales.
Las células madre neurales (NSC) tienen la capacidad de auto-renovación y generar los tres principales linajes neuronales – astrocitos, neuronas y oligodendrocitos. NSC y progenitores neurales (NPS) son comúnmente cultivadas in vitro como neuroesferas. Este protocolo describe en detalle la forma de determinar la frecuencia de NSC en una población celular dada en condiciones clonales. El protocolo comienza con la siembra de las células a una densidad que permite la generación de neuroesferas clonales. Las neuroesferas se transfieren entonces a cubreobjetos septadas y diferenciadas en condiciones clonales en medio condicionado, que maximiza el potencial de diferenciación de las neuroesferas. Por último, la frecuencia NSC se calcula sobre la base de las capacidades de formación múltiple y capacidad de neuroesferas. Utilidades de este protocolo incluyen la evaluación de los candidatos marcadores NSC, la purificación de células madre neurales, y la capacidad de distinguir células madre neurales de los PN. Este método tarda 13 días para llevar a cabo, que es mucho sHorter que los métodos actuales para enumerar frecuencia NSC.
Las células madre neurales (NSC) son células del sistema nervioso central (SNC) que puede auto-renovación y son multipotentes. NSC se especifican por primera vez durante el desarrollo embrionario del cerebro anterior y persisten en el cerebro adulto en regiones específicas, tales como la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales y el giro dentado (DG) del hipocampo. Un número de líneas NSC se están utilizando en ensayos clínicos para el tratamiento de apoplejía y otras enfermedades neurológicas como la enfermedad de Batten 1.
NSC y progenitores neurales (NPS) se propagan en la cultura como estructuras flotantes esferoide 3-dimensionales llamadas neuroesferas. El sistema de cultivo neurosphere fue desarrollado por Reynolds y Weiss en la década de 1990, cuando se encontraron que las células corticales embrionarias y adultas podrían dividir en presencia de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) 2-4. Las neuroesferas se componen de una mezcla heterogénea de cells que comprenden de subclases en diferentes etapas de desarrollo 5. Es un reto para estudiar específicamente células madre neurales a partir de datos obtenidos a partir de neuroesferas debido a la presencia de los PN. Por lo tanto, es crucial para enriquecer NSCs de neuroesferas. En la actualidad, cuatro métodos principales se han utilizado para enriquecer en células madre neurales in vitro. En primer lugar es el uso de marcadores de superficie celular. Lewis-X (LEX) y CD133 (también conocido como Prominin1) son la superficie de la célula más prominente NSC marcadores 6-9. Syndecan-1, Notch-1 y la integrina-beta1 son otras proteínas de superficie que enriquecen para NSC 10. En segundo lugar es la exclusión del colorante. Se ha demostrado que las células lado en la población, que tienen la capacidad única de bombear el fluorescente de unión a ADN de colorante Hoechst 33342, se enriquecen de NSCs 11. En tercer lugar es el uso de la selección morfológica. Se ha demostrado que las células con el aumento del tamaño celular y granularidad puerto Más NSCs que sus contrapartes 5,12,13. En cuarto lugar está la adición de NSC Dofactores rvival al medio de cultivo. Se ha demostrado que la adición de condroitina proteoglicano sulfato y apolipoproteína E aumenta la supervivencia NSC y por lo tanto aumenta la frecuencia NSC 14,15. Aunque muchos marcadores incluyendo factores de transcripción se han asociado con NSCs 16,17, ninguno de estos marcadores son capaces de enriquecer NSCs a la pureza. Debido a la falta de marcadores NSC definitivas, sigue siendo un desafío para cuantificar NSC y distinguirlos de los NP in vitro.
Los estudios iniciales utilizaron el ensayo de formación de neuroesferas (NFA) para cuantificar NSC 7,11,13. En este ensayo, las células disociadas se cultivan para formar neuroesferas y el número de neuroesferas generadas por cada 100 células cultivadas en placas se determina. Este valor se denomina como la unidad de formación de neuroesferas (NFU). La NFU es igual a la frecuencia NSC si surgen todas las neuroesferas a partir de células madre neurales. Sin embargo, se demostró que el NFU sobreestima la frecuencia NSC como neuroesferas se forman por ambas NSCs y principios de los PN 5. Por lo tanto, es inexacto para enumerar NSC exclusivamente sobre la base de la formación de neuroesferas. Podría ser posible cuantificar NSC base a su capacidad de auto-renovación, proliferan extensamente y generan neuroesferas multipotentes.
NSC, que son EGF y bFGF sensible, por lo general sobreviven durante al menos diez pasajes y por tanto, tienen amplia capacidad de auto-renovación en la cultura 4,18-20. NPs, que son EGF y bFGF sensible, así, también podría generar neuroesferas para unos pocos pasajes, pero no durante un período prolongado de tiempo. Por lo tanto, se ha aceptado ampliamente que los comités directivos nacionales de buena fe se pueden enumerar con exactitud razonable, basado en la formación de neuroesferas durante al menos diez pasajes. En la mayoría de estudios, sin embargo, la auto-renovación se mide generalmente basado en la formación de neuroesferas secundario o terciario debido al tiempo experimental largo requerido para diez pasajes. Por lo tanto, el NFA secundario puede ser utilizado para comparar ampliamente la apuesta capacidad de auto-renovaciónpoblaciones ween, pero no pueden ser utilizados para enumerar con precisión la frecuencia NSC.
NSC tienen una mayor capacidad proliferativa en comparación con los PN. Esta propiedad de la NSC fue utilizado por Louis et al. para desarrollar un ensayo para NSC enumeración – el ensayo neural de formación de colonias de células (NCFCA) 21,22. En este ensayo, las células individuales se cultivan durante 3 semanas en una matriz semisólida que contiene colágeno. Bajo estas condiciones de cultivo, se demostró que las células que forman neuroesferas mayores de 2 mm de diámetro son tripotent y pueden auto-renovarse para el largo plazo. Estas células se definen como NSCs. Por lo tanto, los NSCs se distinguen efectivamente de NPS.
NSCs tienen la capacidad de diferenciarse en astrocitos, oligodendrocitos y neuronas. Para la diferenciación de neuroesferas, factores de crecimiento se eliminan y se añade suero al medio de cultivo. Si se observan los tres linajes neuronales en un neurosphere, a continuación, la celda que inició que neurosphere iEs un NSC. Sin embargo, el ensayo de diferenciación tiene algunas limitaciones. En primer lugar, las condiciones de cultivo utilizados para la diferenciación no pueden ser óptimas para la generación de los tres linajes neuronales. De hecho, en un único proceso de diferenciación de neuroesferas, se produce la muerte celular significativa y en su mayoría se produce la generación de astrocitos (Tham M y Ahmed S, no publicado). En segundo lugar, está la cuestión de la clonalidad. Para la enumeración precisa de NSCs, la formación y diferenciación de las neuroesferas que llevarse a cabo en condiciones de clones, donde surge cada neurosphere de una sola célula. En cultivos en suspensión a granel, la agregación se produce tanto a nivel celular y neurosphere 23-25. Por lo tanto, es posible para cada neurosphere que surja a partir de múltiples células o neuroesferas, lo que complica el recuento y evaluación de multipotencia neurosphere. La evidencia reciente muestra que la agregación de las células no se produce a baja densidad de siembra de 0,5 células / l o por debajo, y cuando las placas de cultivo no se mueven durante neuformación rosphere 15. Por lo tanto el cultivo de células en dicha baja densidad aseguraría clonalidad.
En la actualidad, la NCFCA es el método más comúnmente utilizado para distinguir células madre neurales de los PN y enumerar frecuencia NSC. El NCFCA, sin embargo, requiere un tiempo relativamente largo de tres semanas. A continuación, se describe un protocolo para enumerar frecuencia NSC basado en la capacidad de las células madre neurales para formar neuroesferas multipotentes. Este protocolo tiene sólo 13 días para realizarse. El NCFCA asegura clonalidad como la matriz de colágeno impide el movimiento de las neuroesferas. Las condiciones de cultivo utilizadas en este protocolo también permite clonalidad que se mantiene a lo largo. Por ejemplo, el uso de 50 pocillos cubreobjetos con cámaras asegura que las neuroesferas se diferenciarán sin ponerse en contacto entre sí. Además, usamos medio que suministra factores neurotróficos durante la diferenciación de maximizar el potencial de diferenciación de las neuroesferas (Figura 1) condicionados.
Describimos ji la enumeración de células madre neurales en condiciones clonales. Los pasos críticos incluyen el uso de crecimiento y diferenciación medio NSC fresco, y también el uso de la solución de PLL / laminina recién preparada para recubrir los cubreobjetos con cámaras, así como las placas de cultivo. Esto asegura de crecimiento y diferenciación condiciones óptimas de las neuroesferas. El uso de anticuerpos de buena calidad para detectar eficazmente las neuronas y células gliales, así como la recogida selectiva de neuroesferas clonales que no están en contacto con otras neuroesferas, son críticos. Por otra parte, es importante asegurar las neuroesferas escogidas no se secan. Se recomienda añadir 10 l de medio de diferenciación a cada pocillo después de recoger cada 10 neuroesferas. Es importante utilizar un cubreobjetos cámaras en un plato de 10 cm por muestra para evitar la diafonía entre neuroesferas a partir de diferentes muestras. Si dos cubreobjetos (cada uno con neuroesferas a partir de diferentes muestras) se colocan en elmisma placa de 10 cm, neuroesferas de un cubreobjetos pueden liberar factores que pueden alterar la propensión de las neuroesferas en el otro cubreobjetos de diferenciarse en linajes específicos. Dos cubreobjetos en la misma placa de 10 cm también pueden dar lugar a confusión entre las muestras.
En el caso de la NFU o la frecuencia NSC es más bajo de lo esperado, aseguran que se utilizan bajo número de pasos neuroesferas. También es importante que neuroesferas sanas bajas de paso se utilizan para la generación de medio condicionado. A continuación, si las neuroesferas se cultivan en pozos con diámetro pequeño, como en el plato de 96 pocillos, entonces será difícil de maniobrar y recoger neuroesferas utilizando una micropipeta. En este caso, la transferencia de las neuroesferas a una placa de cultivo más grande, tal como un plato de 6 pocillos, antes de recoger. Algunas de las neuroesferas escogidas pueden despegará desde el portaobjetos de cámara durante el cultivo y la inmunotinción. Minimizar el movimiento de la cubreobjetos de cámara durante el cultivo, y menos lavado intensivoing durante la inmunotinción, ayudaría a evitar el desprendimiento de neuroesferas.
Los estudios iniciales NSC cuantificaron utilizando sólo la NFA 7,11,13. Sin embargo, la NFA sobrestima la frecuencia NSC ya que ambos NSC y principios de los PN generan neuroesferas 5. Louis et al. Desarrolló otro método para cuantificar NSCs conocido como el NCFCA 21,22. El NCFCA implica cultivar células individuales en una matriz a base de colágeno para asegurar la clonalidad, y se demostró que neuroesferas mayores de 2 mm de diámetro se forman por sólo NSCs. Al igual que en el NCFCA, clonalidad se garantiza a través de este protocolo. Esto se logra mediante la generación de neuroesferas en densidad clonal y la diferenciación de las neuroesferas en cubreobjetos con cámaras. El uso de cubreobjetos septadas confiere una serie de ventajas. El cubreobjetos cámaras permite que cada neurosphere muestra de diferenciar sin tener contacto físico con otras neuroesferas la muestra, lo que se garantiza la clonalidad durante la diferenciación.El cubreobjetos cámaras se puede colocar en suspensión en el medio de diferenciación para permitir que las neuroesferas muestra para ser acondicionadas de forma continua y para garantizar la máxima diferenciación. En ausencia de medio acondicionado y suero durante la diferenciación, la supervivencia de las neuroesferas disminuye y las neuroesferas sobre todo generar astrocitos (Tham M y Ahmed S, no publicados). Además, las neuroesferas immunostained se pueden almacenar convenientemente por un largo período de tiempo y los cubreobjetos con cámaras se pueden montar directamente sobre los portaobjetos de vidrio de microscopio. Además, las imágenes de las neuroesferas immunostained es fácil como uno puede localizar rápidamente el neurosphere en la pequeña recámara así, capturar una imagen, y pasar a la siguiente también.
Hemos determinado la frecuencia de NSC en E14.5 cultura neurosphere ratón utilizando tanto el protocolo descrito en este manuscrito 27 y 28 NCFCA. La frecuencia NSC en E14.5 neuroesferas de ratón determina tanto por míthods son comparables. El NCFCA enumera NSC que son multipotentes y tienen la capacidad de auto-renovación a largo plazo. Dado que la frecuencia NSC de nuestro método es comparable a la de NCFCA, no parece que la lectura de nuestro protocolo a sobreestimar la frecuencia NSC. El NCFCA requiere tres semanas para ser completado y afecta principalmente chapado celular y la reposición medio. El protocolo descrito aquí requiere 13 días para realizar e implica una serie de pasos diferente, por ejemplo, la recolección de neurosphere y inmunotinción. Este protocolo podría servir como un método alternativo para enumerar NSCs. Los investigadores pueden utilizar tanto NCFCA y este protocolo para verificar la frecuencia NSC en sus muestras.
Una limitación de este protocolo es que una serie de pasos importantes tienen todos a llevarse a cabo el día 8. La preparación del medio acondicionado, determinación de NFU de neuroesferas de la muestra, y la transferencia de neuroesferas de muestra para el cubreobjetos 50 pocillos de cámara tiene que ser realizado sobre el day 8. Uno podría tomar tiempo para completar estos pasos. Además, se requiere práctica para llevar a cabo estos pasos de una manera eficiente.
Las neuroesferas se han utilizado ampliamente para estudiar la función y el comportamiento NSC. Sin embargo, neuroesferas consisten tanto en células madre neurales y PN. Por lo tanto, es importante para enriquecer NSCs de neuroesferas para estudiar la biología NSC. Actualmente, los marcadores de superficie celular, de propiedad exclusión de colorante, así como el tamaño celular y granularidad se han utilizado para enriquecer en NSCs 6,7,9-13,29,30. Este protocolo se podría utilizar para cuantificar el enriquecimiento de células madre neurales por los posibles marcadores NSC, y para facilitar la búsqueda de un marcador NSC definitiva. Cuatro estudios recientes han utilizado este protocolo para enumerar frecuencia NSC 5,14,15,26.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a la Agencia para la Ciencia, Tecnología e Investigación (A * STAR), Singapur por financiar esta investigación.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |