Nöral kök hücreler (NSC'lerde) kendini yenilemek ve üç sinir soy içine ayırt edebilirsiniz hücrelere bakın. Burada, klonal koşullarda neurosphere oluşumu ve farklılaşmayı kullanarak belirli bir hücre popülasyonu MGK sıklığını belirlemek için bir protokol açıklar.
astrositler, nöron ve oligodendrositleri – nöral kök hücreler (NSC'lerde) kendini yenilemek ve üç büyük nöral soyları üretmek için yeteneği var. NSC'lerde ve nöral progenitörler (NPS) neurospheres in vitro genel olarak kültürlenir. Bu protokol klonal şartlar altında belirli bir hücre popülasyonunda MGK sıklığını belirlemek için nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Protokol klonal neurospheres üretilmesine olanak sağlayan bir yoğunlukta hücreler tohumlama ile başlar. Neurospheres sonra odacıklı lamelleri transfer ve neurospheres farklılaşma potansiyeli maksimize şartlandırılmış ortamda, içinde klonal şartlarda ayrılır. Son olarak, MGK frekans neurosphere oluşumu ve multipotency yeteneklerine göre hesaplanır. Bu protokolün Kamu aday MGK belirteçlerin değerlendirilmesi, NSC'lerde saflaştırılması ve NPS gelen NSCs ayırt yeteneği vardır. Bu yöntem çok s olan gerçekleştirmek için 13 gün sürerGeçerli yöntemlere göre daha Hörter MGK frekansını numaralandırmak için.
Nöral kök hücreler (NSC'lerde) kendini yenilemek ve multipotent vardır, merkezi sinir sistemi (MSS) hücrelerdir. NSC'lerde ilk embriyonik ön beyin gelişimi sırasında belirlenen ve bu tür lateral ventriküllerin subventricular bölge (SVZ) ve hipokampus dentat girus (DG) gibi belirli bölgelerde yetişkin beyinde devam etmeye devam edilir. MGK hatlarının bir dizi böyle Batten hastalığı 1 olarak inme ve diğer nörolojik hastalıkların tedavisi için klinik çalışmalarda kullanılmaktadır.
NSC'lerde ve nöral atalarıdır (NPS) Neurospheres adlandırılan 3 boyutlu sfero yapılarını yüzen olarak kültüründe yayılır. Embriyonik ve yetişkin kortikal hücre, epidermal büyüme faktörü (EGF) ve temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) 2-4 mevcudiyetinde bölmek olabilir saptandığında neurosphere kültür sistemi, 1990'ların başında Reynolds ve Weiss tarafından geliştirilmiştir. Neurospheres C heterojen bir karışımı oluşurfarklı gelişim aşamalarında 5 de alt sınıflar oluşan arşın. Özellikle nedeniyle NPS varlığı neurospheres elde edilen verileri kullanarak NSCs çalışmaya zordur. Bu nedenle, neurospheres gelen NSCs ettirecek önemlidir. Bu, dört ana yöntem, in vitro olarak NSC'lerde zenginleştirilmesi için kullanılmıştır. Ana hücre yüzeyi markerlerinin kullanımı. Lewis-X (Lex) ve (aynı zamanda Prominin1 olarak da bilinir) CD133 MGK 6-9 işaretleme kalemler en önemli hücre yüzeyi vardır. Sindekan-1, Çentik 1 ve integrin beta1 NSC'lerde 10 ettirecek diğer yüzey proteinleridir. İkincisi boya dışlama olduğunu. Fluoresan DNA bağlanma boya Hoechst 33342 üzerinden pompa için eşsiz bir yeteneği vardır yan popülasyonu, hücrelerin, NSC'lerde 11 zenginleştirilmiş olduğu gösterilmiştir. Üçüncü morfolojik seçim kullanılmasıdır. Artan hücre boyutu ve ayrıntı hücreler muadillerinden 5,12,13 daha NSCs liman olduğu gösterilmiştir. Dördüncü MGK su eklenmesidirKültür ortamına rvival faktörler. Bu Kondroitin sülfat proteoglikan eklenmesinin gösterilmiş ve apolipoprotein E NSC hayatta kalmasına katkıda bulunur ve bu yüzden MGK frekansı 14,15 artar. Transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere pek çok belirteçler NSC'lerde 16,17 ile ilişkili olsa da, bu markerlerin hiçbiri saflığına NSCs ettirecek edebiliyoruz. Kesin MGK belirteçlerin eksikliği nedeniyle, bu NSCs ölçmek ve in vitro NPS onları ayırmak için bir sorundur.
İlk çalışmalar NSCs 7,11,13 ölçmek için neurosphere formasyonu deneyi (NFA) kullanılır. Bu tahlilde, hücreler ayrışmış Neurospheres oluşturmak üzere kültürlenir ve neurospheres sayısı belirlenir kaplı her 100 hücre için oluşturulan. Bu değer Neurosphere Formasyonu Birimi (NFU) olarak adlandırılır. Tüm Neurospheres NSC'lerde kaynaklanan eğer NFU MGK frekansını eşittir. Bununla birlikte, her iki Neurospheres NS tarafından oluşturulan gibi NFU MGK frekansı tahminini fazla olduğu gösterilmiştirCs ve erken NPS 5. Böylece, sadece neurosphere oluşumuna dayanan NSCs numaralandırmak için yanlıştır. Bu onların yeteneklerine göre NSCs ölçmek mümkün olabilir, kendini yenilemek yoğun çoğalmaya ve multipotent neurospheres oluşturur.
Duyarlı EGF ve bFGF olan NSC'lerde, genellikle en az on pasajları hayatta ve böylece kültür 4,18-20 geniş kendini yenileme kapasitesini gösterir. hem duyarlı EGF ve bFGF olan NPS, aynı zamanda, uzun bir süre için bir kaç geçişleri ancak için Neurospheres oluşturabilir. Bu nedenle, yaygın iyi niyetli NSC'lerde en az on geçişleri için neurosphere oluşumuna dayanan adil bir doğrulukla numaralandırılan edilebileceği kabul edilmiştir. Çalışmaların çoğunda, ancak, kendini yenileme nedeniyle genellikle on geçişleri için gerekli olan uzun deneysel zaman ikincil veya üçüncül neurosphere oluşumu dayalı olarak ölçülür. Bu nedenle, ikincil NFA geniş kendini yenileme yeteneği bahsi karşılaştırma için kullanılabilirween popülasyonları, ama doğru MGK frekansını numaralandırmak için kullanılamaz.
NSC'lerde NP kıyasla daha büyük bir çoğalma yeteneğine sahiptir. NSC'lerde Bu özellik Louis ve arkadaşları tarafından kullanılmıştır. Nöral koloni oluşturan hücre deneyi (NCFCA) 21,22 – MGK sayımı için bir test geliştirmek için. Bu deneyde, tek hücreler kolajen ihtiva eden yarı katı matris içinde 3 hafta içinde kültürlenir. Bu kültür koşulları altında, çapı 2 mm üzerinde Neurospheres hücreler, tripotent ve uzun bir dönem için kendi kendine yenileyebilir gösterilmiştir. Bu hücreler NSC'lerde olarak tanımlanır. Bu nedenle, NSC'lerde etkin bir NPS ayırt edilir.
NSC'lerde astrositler, oligodendrositler ve nöronlar içinde farklılaşan yeteneğine sahiptir. neurospheres farklılaşması için, büyüme faktörleri kaldırılır ve serum, kültür ortamına ilave edilir. Her üç sinir soy o neurosphere başlatılan daha sonra hücre bir neurosphere gözlenen ise benBir MGK s. Ancak, farklılaşma denemesi bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, farklılaşması için kullanılan kültür koşulları üç nöral soylarının üretimi için uygun olmayabilir. Aslında, tek neurosphere farklılaşma sürecinde, çok hücre ölümü meydana gelir ve çok astrosit nesil (Tham M ve yayınlanmamış Ahmed S) meydana gelir. İkincisi, klonalitenin sorunu var. NSC'lerde, oluşumu ve neurospheres farklılaşma doğru sayım için, her neurosphere tek bir hücreden kaynaklanan klonal koşullar altında gerçekleştirilmesi gerekir. Toplu süspansiyon kültürlerinde, toplama hücresel ve neurosphere seviyelerinde 23-25 hem de oluşur. Her neurosphere neurosphere sayma ve multipotency değerlendirilmesini karmaşık hale birden fazla hücre veya neurospheres, ortaya için nedenle, mümkündür. Son kanıtlar hücrelerinin toplanması 0.5 hücre / aşağıda uL veya ve düşük kaplama yoğunluğunda meydana gelmez gösterir kültür plakaları neu sırasında taşınır zamanrosphere oluşumu 15. Böylece klonalite sağlayacak kadar düşük yoğunlukta hücrelerin kültürlenmesi.
Şu anda, NCFCA NPS gelen NSCs ayırt ve MGK frekansını numaralandırmak için en sık kullanılan yöntemdir. NCFCA Ancak üç hafta nispeten uzun bir zaman alır. Burada, multipotent Neurospheres oluşturulması için NSC'lerde yeteneklerine göre MGK frekans numaralandırmak için bir protokol açıklar. Bu protokol gerçekleştirmek için sadece 13 gün sürer. kollajen matris neurospheres hareketini önlediği NCFCA klonalite sağlamaktadır. Bu protokolde kullanılan kültür koşulları, aynı zamanda klonalite boyunca muhafaza edilmesini sağlar. Örneğin, 50-çukurlu odacıklı lamelleri kullanımı Neurospheres birbirlerine temas etmeden ayırt etmesini sağlar. Ayrıca, neurospheres (Şekil 1) farklılaşma potansiyelinin en üst düzeye çıkarmak farklılaşma sırasında nörotrofik faktörler malzemeleri orta klimalı kullanın.
Biz hee klonal koşullarda NSC'lerde numaralandırma açıklar. Kritik adımlar, taze MGK büyüme ve farklılaşma ortam maddesinin kullanımını ve ayrıca kaplamak için taze hazırlanmış PLL / laminin çözeltisinin kullanımı odacıklı lamelleri, hem de kültür kaplarına içerir. Bu neurospheres optimal büyüme ve farklılaşma koşulları sağlar. kaliteli antikorların kullanımı etkili nöronlar ve glia, hem de diğer neurospheres ile temas halinde olmayan klonal neurospheres seçici toplama tespit etmek için, önemlidir. Ayrıca, o kadar kuru değil aldı neurospheres sağlamak için önemlidir. Her 10 neurospheres çekme sonra her oyuğa farklılaşma orta 10 uL eklemek için tavsiye edilir. Farklı örneklerden neurospheres arasında çapraz karışmayı önlemek için, numune başına bir adet 10 cm'lik bir tabakta bir odacıklı lamel kullanılması önemlidir. İki lamelleri (farklı numune, her ihtiva Neurospheres) yerleştirilir iseAynı 10 cm çanak, bir lamel Neurospheres belirli soy içine ayırt etmek için diğer lamel içinde neurospheres eğilimi değiştiren faktörleri serbest olabilir. Aynı 10 cm'lik bir tabakta iki lamelleri da örnekler arasında karıştırmak neden olabilir.
NFU veya MGK frekans beklenenden daha düşük olması durumunda, düşük geçit sayısı Neurospheres kullanıldığından emin olun. Sağlıklı düşük geçiş Neurospheres koşullandırılmış ortam üretilmesi için kullanılması da önemlidir. Neurospheres örneğin 96 gözlü tabak içinde küçük çaplı olan kuyularda kültürlenir Ardından, o zaman manevra ve bir mikropipet kullanılarak Neurospheres almak zor olacaktır. Bu durumda, önceki çekme için, bir 6-yuvalı tabak olarak, daha büyük bir kültürü çanak Neurospheres aktarın. aldı neurospheres Bazı kültür ve immün sırasında odacıklı lamel kapalı kaldırabilir. kültür sırasında odacıklı lamel hareketini ve daha az yoğun yıkama en aza indirmek,immün sırasında ing, neurospheres ayrılmasını önlemek için yardımcı olacaktır.
İlk çalışmalar sadece NFA 7,11,13 kullanarak NSCs sayısal. NSC'lerde ve erken NPS hem neurospheres 5 oluşturmak Ancak, NFA MGK frekansını overestimates. Louis et al. NCFCA 21,22 şekilde bilinmektedir NSCs ölçmek için bir yöntem geliştirdi. NCFCA klonalite sağlamak için kollajen bazlı bir matris içinde tek hücre kültür edilmesini içerir, ve çapı 2 mm üzerinde Neurospheres yalnızca NSC'lerde oluşturduğu gösterilmiştir. NCFCA benzer şekilde, klonalite bu protokol boyunca sağlanır. Bu klonal yoğunlukta Neurospheres oluşturma ve odacıklı lamelleri olarak Neurospheres farklılaştırarak elde edilir. odacıklı lamelleri kullanılması bir çok avantaj bahşeder. odacıklı lamel her bir örnek neurosphere böylece diğer örnek neurospheres ile fiziksel temas olan farklılaşma sırasında klonalite sağlanmadan ayırt etmek için izin verir.odacıklı lamel Örnek Neurospheres sürekli konması ve en farklılaşmasını sağlamak için izin vermek için farklılaşma ortamına süspansiyon yerleştirilebilir. farklılaşması sırasında koşullandırılmış ortam ve serum yokluğunda, neurospheres sağkalım düşürür ve Neurospheres çok astrositler (Tham M Ahmed S, yayınlanmamış) oluşturur. Buna ek olarak, immüno neurospheres uygun zaman uzun süre saklanabilir ve odacıklı lamelleri mikroskop cam slaytlar doğrudan monte edilebilir. bir hızla, iyi odacıklı küçük de neurosphere bulmak bir görüntü yakalamak ve bir sonraki kuyuya taşıyabilirsiniz Buna ek olarak, immüno neurospheres görüntüleme kolay yapılır.
Biz bu yazıda 27 ve NCFCA 28 anlatılan protokol ikisini de kullanarak E14.5 fare neurosphere kültüründe MGK frekansı belirledik. ikisi de benim tarafından belirlenen E14.5 fare neurospheres NSC frekansthods karşılaştırılabilir. NCFCA multipotent ve uzun vadeli kendini yenileme kapasitesine sahip NSCs sıralar. Bizim yönteminden MGK frekans NCFCA gelen karşılaştırılabilir olduğundan, bizim protokolden okuma MGK frekansını abartma görünmüyor. NCFCA tamamlanmak üzere üç hafta gerektirir ve özellikle hücre kaplama ve orta ikmal içerir. Burada açıklanan protokol gerçekleştirmek için 13 gün gerektirir ve farklı adımların serisi, örneğin, neurosphere toplama ve immün içerir. Bu protokol NSCs numaralandırmak için alternatif bir yöntem olarak hizmet verebilir. Araştırmacılar kendi örneklerinde MGK frekansını doğrulamak için NCFCA ve bu protokolü hem de kullanabilirsiniz.
Bu protokolün bir sınırlama önemli adımlar bir dizi olması tüm gün 8. 50-de odacıklı lamel klimalı ortamın hazırlanması, örnek neurospheres NFU belirlenmesi ve örnek neurospheres transferi üzerinde yapılacak olması dekar üzerinde yapılany 8. Tek bu adımları tamamlamak için zaman alabilir. Buna ek olarak, verimli bir şekilde bu adımları gerçekleştirmek için pratik gerektirir.
Neurospheres yaygın MGK fonksiyonu ve davranışlarını incelemek için kullanılır olmuştur. Ancak, Neurospheres NSC'lerde ve NP hem oluşmaktadır. Bu nedenle, MGK biyoloji çalışma neurospheres arasında NSCs ettirecek önemlidir. Şu anda, hücre yüzeyi markerleri, boya çıkarma özelliği ve hücre boyutu ve ayrıntı NSC'lerde 6,7,9-13,29,30 zenginleştirilmesi için kullanılmıştır. Bu protokol potansiyel MGK belirteçleri ile NSC'lerde zenginleştirme ölçmek için ve kesin MGK işaretleyici aramayı kolaylaştırmak için kullanılabilir. Dört yeni çalışmalar MGK frekansını 5,14,15,26 numaralandırmak için bu protokolü kullanılır.
The authors have nothing to disclose.
Biz bu araştırmayı finanse etmek için Bilim, Teknoloji ve Araştırma (A * STAR), Singapur Ajansı teşekkür ederiz.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |