Neural stamceller (NSC) refererer til celler som kan fornye seg selv og skille ut de tre nevrale linjene. Her beskriver vi en protokoll for å bestemme NSC frekvens i en gitt cellepopulasjon ved bruk av neurosfære dannelse og differensiering i henhold klonale betingelser.
Neural stamceller (NSC) har evnen til å fornye seg selv og generere de tre store nevrale linjene – astrocytter, nevroner og oligodendrocytter. NSCs og nevrale stamceller (NPS) er vanligvis dyrket in vitro som neurosfærer. Denne protokollen beskriver i detalj hvordan man skal bestemme NSC frekvens i en gitt cellepopulasjon i henhold klonale betingelser. Protokollen begynner med såing av cellene ved en tetthet som gjør det mulig for generering av klonale neurosfærer. Neurosfærene blir deretter overført til kamret Dekkglass og differensiert i henhold klonale forhold i kondisjonert medium, noe som maksimerer differensiering potensialet i neurosfærer. Til slutt blir den NSC frekvensen beregnet på grunnlag av neurosfære formasjons og multipotency evner. Verktøy av denne protokollen omfatter evaluering av kandidat NSC markører, rensing av NSC, og evnen til å skille NSCs fra NPs. Denne metoden tar 13 dager å utføre, noe som er mye shorter enn dagens metoder for å nummerere NSC frekvens.
Neurale stamceller (NSC) er cellene i sentralnervesystemet (CNS) som kan fornye seg selv og er multipotent. NSCs først spesifisert under utviklingen av den embryonale brain og fortsette å vedvare i den voksne hjernen på bestemte områder som subventricular sone (SVZ) av laterale ventriklene og dentate gyrus (DG) av hippocampus. Et antall NSC linjer blir brukt i kliniske forsøk for behandling av slag og andre nevrologiske sykdommer så som Batten sykdom 1.
NSCs og nevrale stamceller (NPS) er dyrket i kultur som flytende tre-dimensjonale sfæroide strukturer som kalles neurosfærer. Neurosfærene kultur systemet ble utviklet av Reynolds og Weiss i begynnelsen av 1990, da de fant ut at embryonale og voksne kortikale celler kan dele i nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF) og grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF) 2-4. Neurosfærer består av en heterogen blanding av calen bestående av underklasser på ulike utviklingsstadier 5. Det er utfordrende å spesifikt studere NSCs ved bruk av data oppnådd fra neurosfærene på grunn av tilstedeværelsen av NPS. Derfor er det avgjørende å berike NSCs fra neurosfærer. I dag har fire hovedmetoder vært brukt for å anrike for NSCs in vitro. Det første er anvendelsen av celleoverflatemarkører. Lewis-X (LEX) og CD133 (også kjent som Prominin1) er den mest fremtredende celleoverflaten NSC markører 6-9. Syndecan-en, Notch-en og Inte-beta1 er andre overflateproteiner som beriker for NSCs 10. Andre er utelukkelse fargestoff. Det har vist seg at side-populasjonsceller, som har den unike evne til å pumpe ut den fluorescerende DNA-bindende fargestoff Hoechst 33342, er anriket for NSCs 11. For det tredje er bruken av morfologiske valg. Det har blitt vist at celler med økt cellestørrelse og detalj havnen flere NSCs enn sine kolleger 5,12,13. Fjerde er tillegg av NSC survival faktorer til kulturen medium. Det har vist seg at tilsetning av Kondroitinsulfat proteoglykan og Apolipoprotein E forbedrer NSC overlevelse og dermed øker NSC frekvens 14,15. Selv om mange markører inkludert transkripsjonsfaktorer er blitt assosiert med NSCs 16,17, ingen av disse markørene er i stand til å berike NSCs til renhet. På grunn av mangel på definitive NSC markører, er det fortsatt en utfordring å kvantifisere NSCs og skille dem fra NPs in vitro.
Innledende studier brukes neurosfærene dannelsen analysen (NFA) for å kvantifisere NSCs 7,11,13. I denne analysen dissosierte cellene blir dyrket for å danne neurosfærer og antall neurosfærer generert for hver 100 celler belagt blir bestemt. Denne verdien er betegnet som neurosfærene Formation Unit (NFU). NFU lik NSC frekvens hvis alle Neurosfærene oppstå fra NSC. Imidlertid ble det vist at NFU overvurderer NSC frekvens som neurosfærer er utformet ved begge NSCs og tidlig NPs 5. Således er det unøyaktig å nummerere NSCs utelukkende basert på neurosfære formasjonen. Det kan være mulig å kvantifisere NSCs basert på deres evne til å fornye seg selv, sprer mye og generere multipotente neurosfærer.
NSC, som er EGF og bFGF responsive, vanligvis overleve i minst ti passasjer og dermed vise omfattende selvfornyelse kapasitet i kultur 4,18-20. NPs, som er EGF og bFGF responsive også, kan også generere Neurosfærene for et par passasjer, men ikke for en lengre periode. Derfor har det blitt allment akseptert at bona fide NSC kan være nummerert med rettferdig nøyaktighet basert på neurosfære dannelse i minst ti passasjer. I de fleste studier har imidlertid selvfornyelse måles vanligvis basert på sekundære eller tertiære neurosfære dannelse på grunn av den lange eksperimentelle tiden som kreves for ti passeringer. Derfor kan den sekundære NFA anvendes for å sammenligne bredt den selvfornyelse evne betlom bestander, men kan ikke brukes til nøyaktig nummerere NSC frekvens.
NSCs har en større proliferativ evne sammenlignet med NPS. Denne egenskapen av NSC ble brukt av Louis et al. for å utvikle en analyse for NSC oppregning – det neurale kolonidannende celleanalyse (NCFCA) 21,22. I denne analysen enkeltceller er dyrket i 3 uker i en kollagen-holdig halvfast matriks. Under disse dyrkningsbetingelser, ble det vist at celler som danner neurosfærer over 2 mm i diameter er tripotent og kan fornye seg selv på lang sikt. Disse cellene er definert som NSC. Derfor er NSCs effektivt skilles fra NPs.
NSCs har evnen til å differensiere til oligodendrocytter, astrocytter og neuroner. For differensiering av neurosfærer, blir vekstfaktorer fjernet og serum tilsettes til kulturmediet. Dersom alle tre neural linjene er observert i en neurosfære, da cellen som initierte den neurosfære jeger en NSC. Imidlertid har den differensiering-analysen noen begrensninger. For det første kan dyrkningsforholdene som benyttes for differensiering ikke være optimalt for generering av alle tre neural linjene. Faktisk, i en enkelt neurosfære differensieringsprosess, oppstår det betydelig celledød og for det meste astrocytt generasjon inntreffer (Tham M og Ahmed S, upublisert). For det andre er spørsmålet om klonalitet. For nøyaktig bestemmelse av NSCs, dannelse og differensiering av neurosfærer må utføres under klonale forhold, hvor hver enkelt neurosfære oppstår fra en enkelt celle. I bulk suspensjonskulturer oppstår aggregering på både mobil og neurosfære nivåene 23-25. Derfor er det mulig for hver enkelt neurosfære å skrive seg fra flere celler eller neurosfærer, som kompliserer neurosfære telling og evaluering av multipotency. Nyere bevis viser at aggregering av celler skjer ikke ved lave plette tetthet på 0,5 celler / mL eller mindre, og når kulturplater ikke blir beveget i løpet av neurosphere formasjon 15. Dermed dyrkning celler i så lav tetthet ville sikre klonalitet.
Foreløpig er NCFCA den mest brukte metoden for å skille NSCs fra NPs og nummerere NSC frekvens. Den NCFCA krever imidlertid en forholdsvis lang tid på tre uker. Her beskriver vi en protokoll for å nummerere NSC frekvens basert på evnen av NSCs til å danne multipotente neurosfærer. Denne protokollen tar bare 13 dager å utføre. Den NCFCA sikrer klonalitet som kollagenmatriksen hindrer bevegelse av neurosfærer. Dyrkningsbetingelsene anvendt i denne protokollen tillater også klonalitet skal opprettholdes i hele. For eksempel, ved bruk av 50-brønners kamret dekk sikrer at neurosfærene vil skille uten å kontakte hverandre. Videre bruker vi kondisjonert medium som leverer neurotrofiske faktorer i løpet av differensiering for å maksimere differensiering potensialet i de neurosfærer (figur 1).
Vi beskriver hee opptellingen av NSCs henhold klonale forhold. Kritiske trinn omfatter bruk av frisk NSC vekst og differensiering medium, og også anvendelse av nyfremstilt PLL / Laminin løsning for å belegge dekkglass kamret, samt kulturskåler. Dette sikrer optimal vekst og differensieringsbetingelser neurosfærene. Bruken av god kvalitet antistoffer for effektivt å detektere neuroner og glia, så vel som den selektive plukking av klonale neurosfærer som ikke er i kontakt med andre neurosfærer, er kritiske. Videre er det viktig å sikre at de plukkede neurosfærene ikke tørker opp. Det anbefales å legge til 10 ul av differensieringsmedium til hver brønn etter plukking hver 10 neurosfærer. Det er viktig å bruke en kamret dekk i en 10 cm tallerken per prøve å unngå krysstale mellom Neurosfærene fra ulike prøver. Hvis to Dekkglass (hver inneholdende neurosfærer fra forskjellige prøver) er plassert isamme 10 cm tallerken, kanskje neurosfærer fra en dekk slipper faktorer som kan endre tilbøyelighet neurosfærer i den andre dekkglass for å skille ut spesifikke linjene. To Dekk i det samme 10 cm plate, kan også resultere i blanding mellom prøvene.
I tilfelle NFU eller NSC frekvensen er lavere enn forventet, at lav passasje antall neurosfærer brukes. Det er også viktig at friske lave passerings neurosfærer blir brukt for å generere kondisjonert medium. Deretter hvis neurosfærene blir dyrket i brønner med liten diameter, så som i 96-brønners skål, så vil det være vanskelig å manøvrere og plukke neurosfærer ved hjelp av en mikropipette. I dette tilfelle overfører neurosfærene til et større kulturskål, slik som en 6-brønners skål, før plukking. Noen av de plukket neurosfærer kan løfte av fra Chambered dekkglass under kultur og farging. Minimalisering av bevegelsen av kammer, dekkglass under kultur, og mindre intensiv vasking under farging, vil bidra til å unngå avløsning av neurosfærer.
Innledende studier kvantifisert NSCs med bare NFA 7,11,13. Men overvurderer NFA NSC frekvens som både NSCs og tidlig NPs generere neurosfærer 5. Louis et al., Utviklet en annen metode for å kvantifisere NSCs kjent som NCFCA 21,22. Den NCFCA involverer dyrkning av enkeltceller i et kollagenbasert matrise for å sikre klonalitet, og det ble vist at neurosfærer over 2 mm i diameter blir dannet av bare NSC. Ligner på NCFCA er klonalitet sikres gjennom denne protokollen. Dette oppnås ved å generere neurosfærer ved klonal tetthet og differensierende neurosfærene i kamret dekkglass. Bruken av kamret Dekk confers en rekke fordeler. Den kamret dekk gjør hver prøve neurosfære å skille uten å ha fysisk kontakt med andre prøve neurosfærer, og dermed sikre klonalitet under differensiering.Den kamret dekkglass kan plasseres opphengt på differensieringen medium for å tillate prøven neurosfærene å være kontinuerlig kondisjonering og for å sikre maksimal differensiering. I fravær av kondisjonert medium og serum i løpet av differensiering, overlevelse av neurosfærene avtar og neurosfærene for det meste generere astrocytter (Tham M og Ahmed S, upublisert). I tillegg kan De immun neurosfærene hensiktsmessig lagres over lengre tid, og kamret Dekkglass kan monteres direkte på mikroskopobjektglass. I tillegg er avbildning av De immun neurosfærer gjort enkelt som man raskt kan finne neurosfærer i den lille kammer godt, ta et bilde, og gå videre til neste brønn.
Vi har bestemt NSC frekvensen i E14.5 mus neurosfære kultur med både protokoll beskrevet i dette manuskriptet 27 og NCFCA 28. NSC frekvens i E14.5 mus Neurosfærene bestemmes av både megthods er sammenlignbare. Den NCFCA nummerer NSCs som er multipotent og har langsiktig selvfornyelse kapasitet. Siden NSC frekvens fra vår fremgangsmåte er sammenlignbar med den fra NCFCA, gjør avlesning fra vår protokollen ikke ut til å overvurdere NSC frekvens. Den NCFCA krever tre uker å bli fullført, og innebærer i hovedsak celle plating og mellomfylling. Protokollen er beskrevet her krever 13 dager å utføre, og innebærer en annen rekke tiltak, for eksempel, neurosfære plukking og farging. Denne protokollen kan tjene som en alternativ metode for å nummerere NSCs. Forskere kan bruke både NCFCA og denne protokollen for å bekrefte NSC frekvens i sine prøver.
En begrensning av denne protokollen er at en rekke viktige tiltak må alle utført på dag 8. utarbeidelse av kondisjonert medium, fastsettelse av NFU av utvalgs neurosfærer, og overføring av utvalgs neurosfærer til 50-brønn kammer, dekkglass må være utført på day 8. Man kan ta tid å fullføre disse trinnene. I tillegg krever det praksis å utføre fremgangsmåten på en effektiv måte.
Neurosfærer har blitt mye brukt til å studere NSC funksjon og adferd. Men neurosfærer bestå av både NSCs og NPs. Derfor er det viktig å anrike NSCs fra neurosfærene å studere NSC biologi. Foreløpig har celleoverflatemarkører, fargestoff utelukkelse eiendom samt cellestørrelse og detaljnivå blitt brukt til å berike for NSCs 6,7,9-13,29,30. Denne protokollen kan brukes til å kvantifisere anriking av NSCs av potensielle NSC markører, og for å lette søket etter en definitiv NSC markør. Fire nyere studier har brukt denne protokollen til å nummerere NSC frekvens 5,14,15,26.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Direktoratet for Science, Technology and Research (A * STAR), Singapore for å finansiere denne forskningen.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |