الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) تشير إلى الخلايا التي يمكن تجديد الذات والتمايز إلى الأنساب العصبية ثلاثة. هنا، نحن تصف بروتوكول لتحديد تردد مجلس الأمن القومي في عدد السكان خلية معينة باستخدام neurosphere تشكيل والتمايز في ظل ظروف نسيلي.
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) لديها القدرة على تجديد الذات وتوليد الأنساب الرئيسية الثلاثة العصبية – النجمية، الخلايا العصبية و oligodendrocytes. NSCs والأسلاف العصبية (NPS) ومثقف عادة في المختبر كما neurospheres. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية تحديد تردد مجلس الأمن القومي في عدد السكان خلية معينة في ظل ظروف نسيلي. يبدأ البروتوكول مع البذر من الخلايا في مناطق ذات كثافة التي تسمح لتوليد neurospheres نسيلي. ثم يتم نقل neurospheres إلى coverslips تشامبيريد ومتباينة في ظل ظروف نسيلي في وسط مشروط، الأمر الذي سيزيد من إمكانية التفريق بين neurospheres. وأخيرا، يتم حساب تردد مجلس الأمن القومي على أساس تشكيل وmultipotency قدرات neurosphere. وتشمل المرافق من هذا البروتوكول تقييم المرشح علامات مجلس الأمن القومي، وتنقية من NSCs، والقدرة على التمييز NSCs من مصادر القدرة النووية. هذه الطريقة تأخذ 13 يوما لإجراء، وهو الكثير الصورةhorter من الأساليب الحالية لتعداد تردد مجلس الأمن القومي.
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) هي خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS) التي يمكن تجديد الذات وهي متعدد القدرات. يتم تحديد NSCs لأول مرة خلال تطوير الدماغ الأمامي الجنينية وما زالت موجودة في الدماغ الكبار في مناطق معينة مثل منطقة subventricular (SVZ) من البطينات الجانبية والتلفيف المسنن (DG) من الحصين. يتم استخدام عدد من خطوط مجلس الأمن القومي في التجارب السريرية لعلاج السكتة الدماغية وغيرها من الأمراض العصبية مثل مرض باتن 1.
يتم نشر NSCs والأسلاف العصبية (NPS) في الثقافة عائمة الهياكل كروي 3-الأبعاد تسمى neurospheres. وقد تم تطوير هذا النظام الثقافة neurosphere بواسطة رينولدز وفايس في 1990s في وقت مبكر، عندما وجدوا أن الخلايا القشرية الجنينية والبالغين يمكن أن يقسم في وجود عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) 2-4. تتكون Neurospheres من خليط غير متجانس من جملتعلمي اللغة اإلنكليزية تتألف من الفئات الفرعية في مراحل نمو مختلفة 5. أنه يمثل تحديا لدراسة تحديدا NSCs باستخدام البيانات التي تم الحصول عليها من neurospheres بسبب وجود تلك المصادر. وبالتالي، فإنه من الأهمية بمكان لإثراء NSCs من neurospheres. في الوقت الحاضر، وقد استخدمت أربعة طرق رئيسية لإثراء لNSCs في المختبر. الأول هو استخدام علامات سطح الخلية. لويس-X (ليكس) وCD133 (المعروف أيضا باسم Prominin1) هي سطح الخلية أبرز NSC علامات 6-9. Syndecan-1، الشق-1 وإنتغرين-beta1 هي بروتينات السطحية الأخرى التي تثري لNSCs 10. والثاني هو استبعاد الصبغة. ولقد ثبت أن الخلايا جنبا إلى السكان، والتي لديها قدرة فريدة على لضخ الفلورسنت الحمض النووي ملزم صبغ هويشت 33342، وإثراء لNSCs 11. الثالث هو استخدام مجموعة المورفولوجية. وقد ثبت أن الخلايا مع زيادة حجم الخلية وتحبب تؤوي أكثر NSCs من نظرائهم 5،12،13. الرابع هو إضافة NSC سوالعوامل rvival إلى مستنبت. ولقد ثبت أن إضافة الكوندرويتن بروتيوغليكان كبريتات وئي E يعزز مجلس الأمن القومي البقاء على قيد الحياة، وبالتالي يزيد من مجلس الأمن القومي تردد 14،15. على الرغم من أن العديد من علامات بما في ذلك عوامل النسخ ارتبطت NSCs 16،17، فإن أيا من هذه العلامات هي قادرة على إثراء NSCs إلى النقاء. نظرا لعدم وجود علامات NSC نهائية، فإنه لا يزال يشكل تحديا لتحديد NSCs وتمييزها عن مصادر القدرة النووية في المختبر.
استخدمت الدراسات الأولية وفحص تشكيل neurosphere (النيجيري) لتحديد NSCs 7،11،13. في هذا الاختبار، وخلايا نأت يتم تربيتها لتشكيل neurospheres وإنشاء عدد من neurospheres لكل 100 خلية يتم تحديد مطلي. ويطلق على هذه القيمة على أنها وحدة تشكيل Neurosphere (NFU). وNFU يساوي تردد مجلس الأمن القومي إذا تنشأ عن neurospheres من NSCs. ومع ذلك، فقد تبين أن NFU يغالي تردد مجلس الأمن القومي كما تتشكل neurospheres من قبل كل من NSخدمات العملاء وأوائل مصادر القدرة النووية 5. وهكذا، كانت غير دقيقة لتعداد NSCs تستند فقط على تشكيل neurosphere. يمكن أن يكون من الممكن تحديد NSCs على أساس قدرتها على تجديد الذات، تنتشر على نطاق واسع وتوليد neurospheres متعددة القدرات.
NSCs، والتي هي EGF وbFGF الاستجابة، عادة البقاء على قيد الحياة لا يقل عن عشرة مقاطع وبالتالي عرض قدرة التجديد الذاتي واسعة في ثقافة 4،18-20. يمكن أن مصادر القدرة النووية، والتي هي EGF وbFGF تستجيب كذلك، أيضا توليد neurospheres لبضع فقرات ولكن ليس لفترة طويلة من الزمن. ومن هنا، قد قبلت على نطاق واسع أن NSCs حسن النية يمكن تعداد مع دقة عادلة على أساس تشكيل neurosphere للا يقل عن عشرة الممرات. في معظم الدراسات، ومع ذلك، يتم قياس التجديد الذاتي عادة على أساس تشكيل neurosphere الثانوي أو الجامعي بسبب الوقت الطويل التجريبية المطلوبة لمدة عشر فقرات. وبالتالي، فإن الاتحاد النيجيري الثانوي يمكن استخدامها للمقارنة على نطاق واسع في التجديد الذاتي القدرة الرهانسكان وين، ولكن لا يمكن استخدامها لتعداد بدقة تردد مجلس الأمن القومي.
NSCs ديهم قدرة التكاثري أكبر بالمقارنة مع مصادر القدرة النووية. تم استخدام هذه الخاصية من NSCs من قبل لويس وآخرون. لتطوير فحص لمجلس الأمن القومي التعداد – في تشكيل مستعمرة العصبية خلية فحص (NCFCA) 21،22. في هذا الاختبار، خلايا مفردة يتم تربيتها لمدة 3 أسابيع في مصفوفة نصف صلبة تحتوي على الكولاجين. في ظل هذه الظروف والثقافة، وتبين أن الخلايا التي تشكل neurospheres فوق 2 مم في القطر هي tripotent ويمكن تجديد الذات على المدى الطويل. وتعرف هذه الخلايا كما NSCs. لذلك، وتتميز NSCs بشكل فعال من مصادر القدرة النووية.
NSCs لديها القدرة على التمايز إلى الخلايا النجمية، قليلة التغصن والخلايا العصبية. لتمايز neurospheres، تتم إزالة عوامل النمو ويضاف المصل إلى مستنبت. إذا لوحظ كل الأنساب العصبية ثلاثة في neurosphere، ثم الخلية التي بدأ أن neurosphere طليالي لمجلس الأمن القومي. ومع ذلك، فإن فحص التمايز لديه بعض القيود. أولا، الظروف الثقافة تستخدم لتمييز قد لا تكون الأمثل لجيل من كل الأنساب العصبية ثلاثة. في الواقع، في عملية التمايز neurosphere واحدة، ويحدث موت الخلايا كبيرا ومعظمها يحدث جيل نجمية (ثام M وأحمد S، غير منشورة). ثانيا، هناك مسألة قابلية التنسيل. لتعداد دقيق للNSCs، وتشكيل وتمايز neurospheres يجب أن تجرى في ظروف نسيلي، حيث ينشأ كل neurosphere من خلية واحدة. في الثقافات تعليق بكميات كبيرة، ويحدث التجميع في كل الخلوية وneurosphere مستويات 23-25. وبالتالي، فمن الممكن لكل neurosphere إلى تنشأ من الخلايا أو neurospheres متعددة، مما يعقد العد neurosphere وتقييم multipotency. تشير الأدلة الحديثة إلى أن تجميع الخلايا لا تحدث في انخفاض كثافة الطلاء من 0.5 خلية / ميكرولتر أو أقل، وعندما لوحات ثقافة لا يتم نقل أثناء الامتحانات الوطنيةتشكيل rosphere 15. وهكذا زراعة الخلايا في مثل هذه الكثافة المنخفضة من شأنها ضمان قابلية التنسيل.
وفي الوقت الراهن، NCFCA هي الأكثر شيوعا طريقة للتمييز NSCs من مصادر القدرة النووية وتعداد تردد مجلس الأمن القومي. وNCFCA، ومع ذلك، يتطلب وقتا طويلا نسبيا من ثلاثة أسابيع. هنا، نحن تصف بروتوكول تعداد تردد مجلس الأمن القومي على أساس قدرة NSCs لتشكيل neurospheres متعددة القدرات. هذا البروتوكول يأخذ 13 يوما فقط لأداء. وNCFCA يضمن قابلية التنسيل مثل المصفوفة الكولاجين يمنع حركة neurospheres. شروط الثقافة المستخدمة في هذا البروتوكول يسمح أيضا قابلية التنسيل إلى الإبقاء طوال الوقت. على سبيل المثال، استخدام 50-جيدا coverslips غرف يضمن أن neurospheres سوف تفرق دون الاتصال بعضها البعض. وعلاوة على ذلك، ونحن نستخدم المتوسطة التي تزود عوامل عصبية خلال تمايز لتعظيم إمكانيات التفريق بين neurospheres (الشكل 1) مكيفة.
وصفنا ها تعداد NSCs في ظل ظروف نسيلي. وتشمل الخطوات الحاسمة استخدام مجلس الأمن القومي النمو والتمايز متوسطة جديدة، وأيضا استخدام الطازجة حل PLL / Laminin إلى معطف لل coverslips غرف، فضلا عن أطباق الثقافة. وهذا يضمن ظروف النمو والتمايز المثلى من neurospheres. استخدام أجسام مضادة نوعية جيدة للكشف عن فعالية الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، وكذلك قطف الانتقائي للneurospheres نسيلي التي ليست على اتصال مع neurospheres الأخرى، أمرا حاسما. وعلاوة على ذلك، فمن المهم لضمان neurospheres اختار لا تجف. فمن المستحسن أن إضافة 10 ميكرولتر من متوسطة التمايز إلى كل بئر بعد اختيار كل 10 neurospheres. ومن المهم لاستخدام واحد ساترة في غرف واحدة طبق 10 سم في عينة لتجنب الحديث المتبادل بين neurospheres من عينات مختلفة. إذا وضعت اثنين من coverslips (التي تحتوي على كل neurospheres من عينات مختلفة) فينفس صحن 10 سم، neurospheres من ساترة واحد قد تفرج العوامل التي قد تغير ميل neurospheres في ساترة أخرى على التمايز إلى الأنساب محددة. اثنين coverslips في نفس الطبق 10 سم قد يؤدي أيضا إلى خلط بين العينات.
في حال NFU أو تردد مجلس الأمن القومي أقل مما كان متوقعا، وضمان أن يتم استخدام عدد قليل مرور neurospheres. ومن المهم أيضا أن يتم استخدام صحي neurospheres مرور المنخفض لتوليد المتوسطة مشروط. بعد ذلك، إذا كان neurospheres ومثقف في الآبار مع القطر الصغير، كما هو الحال في صحن 96-جيدا، وبعد ذلك سوف يكون من الصعب على المناورة واختيار neurospheres باستخدام micropipette. في هذه الحالة، ونقل neurospheres إلى صحن ثقافة أكبر، مثل طبق 6 جيدا قبل اختيار. بعض neurospheres التقطت قد رفع الخروج من ساترة تشامبيريد خلال الثقافة والمناعية. التقليل من حركة ساترة تشامبيريد خلال الثقافة، وأقل غسل مكثفجي خلال المناعية، من شأنه أن يساعد على تجنب مفرزة من neurospheres.
الدراسات الأولية كميا NSCs فقط باستخدام النيجيري 7،11،13. ومع ذلك، فإن الاتحاد النيجيري يغالي تردد مجلس الأمن القومي على حد سواء NSCs ومصادر القدرة النووية في وقت مبكر توليد neurospheres 5. لويس وآخرون. وضعت طريقة أخرى لقياس NSCs المعروفة باسم NCFCA 21،22. وNCFCA ينطوي على زراعة الخلايا وحيدة في مصفوفة على الكولاجين لضمان قابلية التنسيل، وتبين أن تتشكل neurospheres فوق 2 مم في القطر من NSCs فقط. على غرار NCFCA، ويضمن قابلية التنسيل طوال هذا البروتوكول. ويتحقق ذلك عن طريق توليد neurospheres في كثافة نسيلي والتمييز بين neurospheres في coverslips غرف. استخدام coverslips تشامبيريد يمنح عددا من المزايا. ساترة غرف تتيح لكل عينة neurosphere التفريق دون اتصال جسدي مع neurospheres عينة أخرى، وبالتالي ضمان قابلية التنسيل خلال التمايز.ساترة غرف يمكن وضعها مع وقف التنفيذ على المدى المتوسط التفريق للسماح للneurospheres العينة إلى أن يكون مشروطا باستمرار وضمان أقصى قدر من التمايز. في غياب المتوسطة مكيفة ومصل خلال التمايز، والبقاء للneurospheres النقصان وneurospheres توليد معظمها الخلايا النجمية (ثام M وأحمد S، غير منشورة). بالإضافة إلى ذلك، neurospheres immunostained يمكن تخزين مريح لفترة طويلة من الزمن ولل coverslips غرف يمكن تركيبه مباشرة على شرائح المجهر الزجاجية. بالإضافة إلى ذلك، يتم إجراء التصوير من neurospheres immunostained سهلا كما يمكن للمرء أن تحديد موقع بسرعة neurosphere في الصغيرة غرف جيدا، والتقاط الصور، والانتقال إلى البئر المقبل.
لقد قرر تردد مجلس الأمن القومي في E14.5 ثقافة الماوس neurosphere باستخدام كل من بروتوكول وصفها في هذه المخطوطة 27 و 28 NCFCA. تردد مجلس الأمن القومي في neurospheres الماوس E14.5 يحدده كل من ليthods قابلة للمقارنة. وNCFCA يعدد NSCs التي متعدد القدرات ويكون على المدى الطويل قدرة التجديد الذاتي. منذ تردد مجلس الأمن القومي من أسلوبنا هو مشابه لذلك من NCFCA، لا يبدو أن قراءات من بروتوكول لدينا أن نبالغ في تقدير تردد مجلس الأمن القومي. وNCFCA يتطلب ثلاثة أسابيع ليستكمل وينطوي أساسا طلاء الخلايا وتجديد المتوسط. بروتوكول الموصوفة هنا يتطلب 13 يوما لأداء وينطوي على سلسلة مختلفة من الخطوات، على سبيل المثال، قطف neurosphere والمناعية. هذا البروتوكول يمكن أن تكون بمثابة وسيلة بديلة لتعداد NSCs. يمكن للباحثين استخدام كل NCFCA وهذا البروتوكول للتحقق من تردد مجلس الأمن القومي في تلك العينات.
واحد الحد من هذا البروتوكول هو أن سلسلة من الخطوات المهمة يجب أن تكون جميع يؤديها في يوم 8. إعداد المتوسطة مكيفة، وتحديد NFU من neurospheres عينة، ونقل neurospheres العينة إلى ساترة 50-جيدا تشامبيريد يجب أن تكون تجرى على داص 8. واحد قد يستغرق وقتا طويلا لإتمام هذه الخطوات. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتطلب ممارسة لتنفيذ هذه الخطوات بطريقة فعالة.
وقد استخدمت على نطاق واسع Neurospheres لدراسة وظيفة مجلس الأمن القومي والسلوك. ومع ذلك، تتكون neurospheres من كل من NSCs ومصادر القدرة النووية. وبالتالي، فمن المهم لإثراء NSCs من neurospheres لدراسة علم الأحياء مجلس الأمن القومي. حاليا، وقد استخدمت علامات سطح الخلية، صبغة الملكية الإقصاء وكذلك حجم الخلية وتحبب إلى إثراء لNSCs 6،7،9-13،29،30. هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم لتحديد إثراء NSCs من علامات مجلس الأمن القومي المحتملة، وتسهيل عملية البحث عن علامة NSC نهائية. وقد استخدمت أربع دراسات حديثة هذا البروتوكول لتعداد NSC تردد 5،14،15،26.
The authors have nothing to disclose.
نشكر الوكالة للعلوم والتكنولوجيا والبحوث (A * ستار) وسنغافورة لتمويل هذا البحث.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |