Neurale stamcellen (NSC) verwijzen naar cellen die kunnen zichzelf vernieuwen en differentiëren in de drie neurale geslachten. We beschrijven hier een protocol NSC frequentie te bepalen in een bepaalde celpopulatie via neurosfeer vorming en differentiatie onder klonale omstandigheden.
Neurale stamcellen (NSC) hebben de mogelijkheid om zichzelf te vernieuwen en het genereren van de drie grote neurale lineages – astrocyten, neuronen en oligodendrocyten. NSCs en neurale voorlopercellen (NP) zijn vaak gekweekt in vitro als neurospheres. Dit protocol beschrijft in detail hoe de NSC frequentie in een bepaalde cel populatie onder klonale voorwaarden vast te stellen. Het protocol begint met het zaaien van de cellen bij een dichtheid die het mogelijk maakt voor de productie van klonale neurosferen. De neurosferen worden vervolgens overgebracht naar chambered dekglaasjes en gedifferentieerde onder klonale omstandigheden in geconditioneerd medium dat de differentiatie potentieel van de neurosferen maximaliseert. Tenslotte wordt de NSC frequentie berekend op basis van neurosfeer vorming en multipotent mogelijkheden. Nut van deze protocollen zijn evaluatie van kandidaat NSC markers zuivering van NSCs, en het vermogen om NSCs onderscheiden van NP. Deze methode duurt 13 dagen om te presteren, dat is veel sHorter dan de huidige methoden om NSC frequentie te sommen.
Neurale stamcellen (NSC's) zijn cellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) die hernieuwen en zijn multipotente. NSC eerst gespecificeerd tijdens de ontwikkeling van de embryonale voorhersenen en blijven bestaan in de volwassen hersenen op specifieke gebieden zoals subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikels en de dentate gyrus (DG) van de hippocampus. Een aantal NSC lijnen worden gebruikt in klinische studies voor de behandeling van beroerte en andere neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Batten 1.
NSCs en neurale voorlopercellen (NP) worden gekweekt in cultuur als drijvende 3-dimensionale structuren sferoïde genoemd neurospheres. Het neurosfeercultuur systeem is ontwikkeld door Reynolds en Weiss in de vroege jaren 1990, toen ze dat embryonale en volwassen corticale cellen in de aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en basische fibroblast groeifactor (bFGF) 2-4 kan verdelen. Neurosferen bestaan uit een heterogeen mengsel van cells bestaande uit subklassen in verschillende ontwikkelingsstadia 5. Het een uitdaging om specifiek bestuderen NSCs gebruikt gegevens uit neurospheres door de aanwezigheid van NP. Daarom is het van cruciaal belang om NSCs verrijken van neurospheres. Momenteel zijn vier belangrijkste methoden gebruikt om te verrijken voor NSCs in vitro. Eerst is het gebruik van celoppervlak markers. Lewis-X (LEX) en CD133 (ook bekend als Prominin1) zijn de voornaamste celoppervlak markers NSC 6-9. Syndecan-1, Notch-1 en integrine-beta1 andere oppervlakte-eiwitten die verrijken NSCs 10. Ten tweede is de kleurstof uitsluiting. Aangetoond is dat de zij-populatie cellen, die het unieke vermogen te pompen uit de fluorescerende DNA-bindende kleurstof Hoechst 33342 hebben, worden verrijkt NSC 11. Ten derde is het gebruik van morfologische selectie. Er is aangetoond dat cellen met toegenomen grootte en granulariteit cel haven NSC meer dan hun tegenhangers 5,12,13. Ten vierde is de toevoeging van NSC survival factoren aan het kweekmedium. Het is aangetoond dat toevoeging van chondroïtinesulfaat proteoglycanen en apolipoproteïne E verbetert NSC overleving vergroot dan ook NSC frequentie 14,15. Hoewel veel markers waaronder transcriptiefactoren zijn geassocieerd met NSC 16,17, geen van deze markers kunnen NSC verrijken zuiverheid. Vanwege het ontbreken van definitieve NSC markers, blijft het een uitdaging om NSCs kwantificeren en ze onderscheiden van NP in vitro.
Initial studies gebruikten de neurosphere formatie assay (NFA) te kwantificeren NSCs 7,11,13. In deze assay, gedissocieerde cellen worden gekweekt om neurosferen vormen en het aantal neurosferen gegenereerd voor elke 100 cellen uitgeplaat bepaald. Deze waarde wordt genoemd als de Neurosfeer Formation Unit (NFU). De NFU is gelijk aan de NSC frequentie als alle neurospheres voortvloeien uit NSC. Er werd aangetoond dat de NFU overschat de NSC frequentie als neurosferen worden gevormd door zowel NSCs en vroege NP 5. Derhalve is het onjuist te noemen NSC uitsluitend gebaseerd op neurosphere formatie. Het zou mogelijk te kwantificeren NSCs op basis van hun vermogen om zichzelf te vernieuwen, verspreiden op grote schaal en het genereren van multipotente neurospheres.
NSC, dat EGF en bFGF responsief zijn, meestal overleven gedurende ten minste tien passages en dus uitgebreide zelfvernieuwingscapaciteit in cultuur 4,18-20 weer te geven. NPs, welke EGF en bFGF responsief zijn en kan ook neurosferen enkele passages maar niet voor langere tijd realiseren. Derhalve is het algemeen aanvaard dat bonafide NSCs kunnen worden geteld met eerlijke nauwkeurigheid gebaseerd op neurosphere vorming gedurende ten minste tien passages. In de meeste studies echter zelfvernieuwing wordt gewoonlijk gemeten op basis van secundaire of tertiaire vorming neurosfeer vanwege de lange tijd die nodig experimentele tien passages. Derhalve kan de secundaire NFA worden gebruikt om breed vergelijken zelfvernieuwing capaciteit between populaties, maar kan niet worden gebruikt om nauwkeurig te sommen NSC frequentie.
NSC's hebben een grotere proliferatieve vermogen vergeleken NP. Deze eigenschap van NSC werd gebruikt door Louis et al. de neurale kolonievormende cel assay (NCFCA) 21,22 – met een test voor NSC opsomming te ontwikkelen. In deze assay, enkele cellen worden gedurende 3 weken in een collageenbevattende halfvaste matrix. Onder deze kweekomstandigheden werd aangetoond dat cellen die neurosferen boven 2 mm diameter kunnen vormen tripotent en kunnen hernieuwen voor lange termijn. Deze cellen worden gedefinieerd als NSC. Daarom worden de NSCs daadwerkelijk onderscheiden NP.
NSC's hebben de mogelijkheid om te differentiëren tot astrocyten, oligodendrocyten en neuronen. Voor differentiatie van neurosferen worden groeifactoren verwijderd en serum toegevoegd aan het kweekmedium. Als alle drie neurale geslachten waargenomen in een neurosfeer, dan is de cel die dat neurosfeer geïnitieerd is een NSC. De differentiatie test een aantal beperkingen. Ten eerste kunnen de kweekomstandigheden voor differentiatie niet optimaal voor het genereren van drie neurale geslachten zijn. In feite, in een enkele neurosfeer differentiatieproces significante celdood optreedt en meestal astrocyt wordt gegenereerd (Tham M en S Ahmed, ongepubliceerd). Ten tweede is er de kwestie clonaliteit. Voor nauwkeurige telling van NSCs vorming en differentiatie van neurosferen moet uitgevoerd onder klonale omstandigheden, waarbij elke neurosfeer ontstaat uit een enkele cel. In bulk suspensiekweken, aggregatie vindt plaats op zowel cellulaire en neurosphere niveaus 23-25. Daarom is het mogelijk voor elke neurosphere ontstaan uit meerdere cellen of neurosferen, die neurosfeer tellen en evaluatie van multipotent bemoeilijkt. Uit recente gegevens blijkt dat de samenvoeging van de cellen treedt niet op bij lage plating dichtheid van 0,5 cellen / ul of minder, en wanneer de cultuur platen niet tijdens neu worden verplaatstrosphere formatie 15. Zo kweken van cellen bij zulke lage dichtheid zou zorgen clonaliteit.
Momenteel is de NCFCA is de meest gebruikte methode om NSCs onderscheiden van NP en sommen NSC frequentie. De NCFCA vereist echter een relatief lange tijd van drie weken. We beschrijven hier een protocol NSC frequentie opsommen gebaseerd op het vermogen van NSC multipotente neurosferen vormen. Dit protocol duurt slechts 13 dagen uit te voeren. De NCFCA zorgt clonaliteit de collageenmatrix beweging van de neurosferen voorkomt. De kweekomstandigheden die in dit protocol kunnen ook clonaliteit gehele te handhaven. Bijvoorbeeld, het gebruik van 50-well chambered dekglaasjes zodat de neurosferen zal differentiëren zonder contact met elkaar. Verder gebruiken we geconditioneerd medium dat neurotrofe factoren levert bij differentiatie de differentiatie potentieel van de neurosferen (figuur 1) te maximaliseren.
We beschrijven hee de opsomming van NSCs onder klonale omstandigheden. Kritische stappen omvatten het gebruik van verse NSC groei en differentiatie medium, en ook het gebruik van vers bereide PLL / laminine oplossing het bekleden van de chambered dekglaasjes, evenals de kweekschalen. Dit zorgt voor optimale groei en differentiatie van neurosferen omstandigheden. Het gebruik van goede kwaliteit antilichamen tegen de neuronen en glia, evenals de selectieve plukken van klonale neurosferen die niet in contact met andere neurosferen effectief detecteren kritisch. Bovendien is het belangrijk te zorgen voor de geplukte neurosferen niet opdrogen. Aanbevolen wordt 10 ul van differentiatiemedium toevoegen aan elk putje na ophalen elke 10 neurosferen. Het is belangrijk om een chambered dekglaasje gebruiken op een 10 cm schaal per monster overspraak tussen neurosferen uit verschillende monsters te vermijden. Als twee dekglaasjes (elk neurosferen uit verschillende monsters) worden in deDezelfde 10 cm schaal, neurosferen uit een dekglaasje zou loslaten factoren die de neiging van neurosferen kunnen veranderen in de andere dekglaasje te differentiëren tot specifieke lijnen. Twee dekglaasjes in dezelfde 10 cm schaal kan ook leiden tot verwarring tussen de monsters.
In het geval dat de NFU en de NSC frequentie is lager dan verwacht, ervoor te zorgen dat de lage passage aantal neurospheres worden gebruikt. Het is ook belangrijk dat gezonde lage passage neurosferen worden gebruikt voor het genereren geconditioneerd medium. Vervolgens, als de neurosferen worden gekweekt in putjes met kleine diameter, zoals in 96-putjes, dan zal het moeilijk te manoeuvreren en kies neurosferen met behulp van een micropipet. In dit geval brengt de neurosferen met een grotere kweekschaal, zoals een 6-putjes voorafgaand aan het plukken. Sommige van de geplukte neurosferen kunnen tillen van de chambered dekglaasje tijdens de cultuur en immunokleuring. Het minimaliseren van de beweging van de chambered dekglaasje tijdens de cultuur en minder intensieve washing tijdens immunokleuring, zou helpen om detachement van neurosferen te voorkomen.
Initial studies gekwantificeerd NSC met alleen de NFA 7,11,13. Echter, de NFA overschat de NSC frequentie als zowel NSCs en vroege NP genereren neurospheres 5. Louis et al. Ontwikkelden een andere methode NSC zogenaamde NCFCA 21,22 kwantificeren. De NCFCA behelst kweken enkele cellen in een collageen gebaseerde matrix klonaliteit waarborgen, en er werd aangetoond dat neurosferen boven 2 mm diameter worden gevormd door enkel NSC. Net als bij de NCFCA wordt clonaliteit verzekerd in dit protocol. Dit wordt bereikt door het genereren van neurosferen bij klonale dichtheid en differentiatie van neurosferen in chambered dekglaasjes. Het gebruik van chambered dekglaasjes geeft een aantal voordelen. De chambered dekglaasje kan elk monster neurosphere om onderscheid te maken, zonder fysiek contact met andere monster neurospheres, waardoor wordt gewaarborgd klonaliteit tijdens differentiatie.De chambered dekglaasje geplaatst kan worden opgehangen aan de differentiatie medium om het monster neurospheres continu te voorzien en om een maximale differentiatie te garanderen. In afwezigheid van geconditioneerd medium en serum tijdens differentiatie, overleving van de neurosferen afneemt en de neurosferen meestal genereren astrocyten (Tham M en S Ahmed, ongepubliceerd). Bovendien kan de immunogekleurde neurosferen geschikt worden opgeslagen gedurende langere tijd en de chambered dekglaasjes kan direct op de microscoop glasplaatjes gemonteerd. Daarnaast is beeldvorming van de immuun-neurosferen gemakkelijk gemaakt als men snel de neurosphere in de kleine goed chambered kunt vinden, afzonderlijke beelden, en ga naar de volgende ook.
We hebben de NSC frequentie in E14.5 muis neurosphere cultuur met behulp van zowel de in dit handschrift 27 en NCFCA 28 beschreven protocol vastgesteld. De NSC frequentie in E14.5 muis neurosferen bepaald door zowel mede werkwijze wordt vergelijkbaar. De NCFCA somt NSC dat multipotente zijn en op lange termijn zelfvernieuwingscapaciteit. Aangezien de NSC frequentie Aanbevolen methode is vergelijkbaar met die van NCFCA gaat de uitlezing van ons protocol lijkt erop dat de NSC frequentie overschatten. De NCFCA vereist drie weken worden afgerond en gaat het vooral om de cel plating en middelgrote aanvulling. De hier beschreven protocol vereist 13 dagen uit te voeren en het gaat om een andere reeks stappen, bijvoorbeeld neurosphere plukken en immunokleuring. Dit protocol zou kunnen dienen als alternatief voor NSC sommen. Onderzoekers kunnen zowel NCFCA en dit protocol te gebruiken om NSC frequentie controleren in hun monsters.
Een beperking van dit protocol is dat een aantal belangrijke stappen staan te worden uitgevoerd op dag 8. De bereiding van het geconditioneerde medium, bepaling van NFU monster neurosferen en overdracht van monster neurosferen de 50-well chambered dekglaasje moeten uitgevoerd op day 8. Men zou de tijd nemen om deze stappen uit te voeren. Bovendien vereist oefening om deze stappen uit te voeren op een efficiënte wijze.
Neurosferen zijn op grote schaal gebruikt om NSC en gedrag te bestuderen. Echter, neurospheres bestaan uit zowel NSCs en NP's. Daarom is het belangrijk om NSCs verrijken van neurospheres NSC studie biologie. Op dit moment hebben celoppervlak markers, kleurstof uitsluiting goederen, alsmede celgrootte en granulariteit gebruikt om te verrijken voor NSC 6,7,9-13,29,30. Dit protocol kan worden gebruikt om de verrijking van NSC kwantificeren NSC potentiële markers, en het zoeken naar een definitieve NSC marker vergemakkelijken. Vier recente studies hebben dit protocol gebruikt om NSC frequentie 5,14,15,26 sommen.
The authors have nothing to disclose.
We danken het Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek (A * STAR), Singapore voor de financiering van dit onderzoek.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |