Neurale Stammzellen (NSCs) beziehen sich auf Zellen, die selbst zu erneuern und differenzieren sich in die drei neuronale Abstammungslinien. Hier beschreiben wir ein Protokoll NSC Frequenz in einer gegebenen Zellpopulation zu bestimmen, Neurosphärenbildung und Differenzierung unter klonalen Bedingungen.
Neurale Stammzellen (NSC) die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die drei Haupt neuralen Abstammungslinien erzeugen – Astrozyten, Neuronen und Oligodendrozyten. NSCs und neuronale Vorläuferzellen (NPs) sind in der Regel in vitro kultiviert als Neurosphären. Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie die NSC Frequenz in einer gegebenen Zellpopulation unter klonalen Bedingungen zu bestimmen. Das Protokoll beginnt mit dem Aussäen der Zellen in einer Dichte, die zur Erzeugung von klonalen Neurosphären ermöglicht. Die Neurosphären werden dann auf chambered Deckgläser übertragen und unter klonalen Bedingungen in konditionierten Medium differenziert, die das Differenzierungspotenzial der Neurosphären maximiert. Schließlich wird der NSC Frequenz berechnet basierend auf Neurosphärenbildung und Multipotenz Fähigkeiten. Dienstprogramme dieses Protokolls umfassen die Bewertung von Kandidatenmarkern NSC, Reinigung von NSC, und die Fähigkeit, NSC von NPs zu unterscheiden. Dieses Verfahren dauert 13 Tage, um auszuführen, was viel sHorter als die derzeitigen Methoden NSC Frequenz aufzuzählen.
Neurale Stammzellen (NSC) sind Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS), die selbst erneuern können und multipotent. NSC werden zunächst während der Entwicklung der embryonalen Vorderhirns spezifiziert und weiterhin im erwachsenen Gehirn an bestimmten Regionen wie die Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel und Gyrus dentatus (DG) des Hippocampus zu persistieren. Eine Reihe von NSC Linien werden in klinischen Studien zur Behandlung von Schlaganfall und anderen neurologischen Erkrankungen wie Batten-Krankheit 1 verwendet.
NSCs und neuronale Vorläuferzellen (NPs) in Kultur als Floating-3-dimensionalen Sphäroid Strukturen genannt Neurosphären propagiert. Die Neurosphären Kultursystem wurde von Reynolds und Weiss in den frühen 1990er Jahren entwickelt, wenn sie festgestellt , dass embryonalen und adulten Rindenzellen in Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und basischem Fibroblasten – Wachstumsfaktor (bFGF) 2-4 dividieren kann. Neurosphären bestehen aus einer heterogenen Mischung aus cells bestehend aus Unterklassen in verschiedenen Entwicklungsstadien 5. Es ist eine Herausforderung, speziell NSCs zu studieren unter Verwendung von Neurosphären erhaltenen Daten aufgrund der Anwesenheit von Nanopartikeln. Daher ist es von entscheidender Bedeutung NSCs von Neurosphären zu bereichern. Derzeit sind vier Hauptmethoden verwendet worden für NSCs in vitro zu bereichern. Erstens ist die Verwendung von Zelloberflächenmarkern. Lewis-X (lex) und CD133 (auch als Prominin1 bekannt) sind die prominentesten Zelloberfläche NSC 6-9 Marker. Syndecan-1, Notch-1 und Integrin-Beta1 sind andere Oberflächenproteine , die für die NSCs 10 bereichern. Zweitens ist der Farbstoff Ausgrenzung. Es hat sich gezeigt , daß die Seitenpopulation Zellen, die die einzigartige Fähigkeit , die fluoreszierende DNA-bindende Farbstoff Hoechst 33342, abzupumpen haben für NSC 11 angereichert. Drittens ist die Verwendung von morphologischen Selektion. Es wurde gezeigt , dass Zellen mit einem erhöhten Zellgröße und Granularität mehr NSC beherbergen als ihre Pendants 5,12,13. Viertens ist die Zugabe von NSC survival Faktoren zu dem Kulturmedium. Es wurde gefunden , dass Zugabe von Chondroitinsulfat – Proteoglykan gezeigt und Apolipoprotein E verbessert NSC Überleben und erhöht somit NSC Frequenz 14,15. Obwohl viele Markierungen einschließlich Transkriptionsfaktoren mit NSC 16,17 keiner dieser Marker sind in der Lage zu bereichern NSC Reinheit verbunden. Aufgrund der fehlenden endgültigen NSC Marker, bleibt es eine Herausforderung , NSCs zu quantifizieren und sie von NPs in vitro zu unterscheiden.
Erste Untersuchungen verwendet , um die Neurosphärenbildungstest (NFA) NSCs 7,11,13 zu quantifizieren. In diesem Test werden dissoziierten Zellen kultiviert Neurosphären und die Anzahl der Neurosphären pro 100 Zellen erzeugt zu bilden bestimmt plattiert ist. Dieser Wert wird als der Neurosphäre Formation Unit (NFU) bezeichnet. Der NFU gleich der NSC Frequenz, wenn alle Neurosphären von NSCs entstehen. Es wurde jedoch gezeigt, dass der NFU die NSC Frequenz überschätzt als Neurosphären von beiden NS gebildet werdenCs und frühen NPs 5. Somit ist es ungenau NSCs aufzuzählen ausschließlich basierend auf Neurosphere Bildung. Es könnte möglich sein, NSC auf auf der Basis ihrer Fähigkeit zur Quantifizierung selbst zu erneuern, proliferieren und umfassend multiNeuroSphären zu erzeugen.
NSCs, die EGF und bFGF ansprechbar sind in der Regel für mindestens zehn Passagen überleben und somit umfangreiche Selbsterneuerungsfähigkeit in Kultur 4,18-20 anzuzeigen. NPs, die auch EGF und bFGF ansprechen, könnten auch Neurosphären für einige Stellen erzeugen, aber nicht für einen längeren Zeitraum. Daher wurde es allgemein anerkannt , dass bona fide NSCs kann mit ziemlicher Genauigkeit basierend auf Neurosphere Bildung für mindestens zehn Passagen aufgezählt werden. In den meisten Studien wird jedoch die Selbsterneuerung in der Regel basierend auf gemessenen sekundären oder tertiären Neurosphärenbildung aufgrund der langen Versuchsdauer von zehn Passagen erforderlich. Daher kann die Sekundär NFA verwendet werden, um weitgehend die Selbsterneuerungsfähigkeit bet vergleichenween Populationen, aber nicht genau Frequenz NSC aufzuzählen verwendet werden.
NSCs haben eine größere proliferative Fähigkeit im Vergleich zu NPs. Diese Eigenschaft von NSCs wurde von Louis et al. die neurale koloniebildenden Zellassay (NCFCA) 21,22 – einen Test zur NSC – Enumeration zu entwickeln. In diesem Test werden für 3 Wochen kultiviert einzelne Zellen in einer Kollagen enthaltenden halbfesten Matrix. Unter diesen Kulturbedingungen wurde gezeigt, dass Zellen, die Neurosphären über 2 mm im Durchmesser sind tripotent und kann selbst zu erneuern für langfristig bilden. Diese Zellen sind als NSC definiert. Daher werden die NSC effektiv von NPs aus.
NSCs haben die Fähigkeit, in Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen zu differenzieren. Zur Differenzierung von Neurospheres sind, Wachstumsfaktoren entnommen und Serum wird zu dem Kulturmedium zugegeben. Wenn alle drei neuronalen Abstammungslinien werden in einer Neurosphären beobachtet, dann ist die Zelle, die diese Neurosphäre eingeleitet is ein NSC. Jedoch hat der Differenzierungsassay einige Einschränkungen. Zunächst werden die Kulturbedingungen für die Differenzierung verwendet werden, können nicht optimal für die Erzeugung aller drei neuronale Abstammungslinien. In der Tat kommt es in einem einzigen Neurosphere Differenzierungsprozess, signifikante Zelltod und meist Astrozyten Generation auftritt (Tham M und Ahmed S, nicht veröffentlicht). Zweitens gibt es die Frage der Klonalität. Für eine genaue Zählung von NSC, die Bildung und Differenzierung von Neurospheres haben unter klonalen Bedingungen durchgeführt werden, wobei jeder Neurosphäre aus einer einzigen Zelle entsteht. In der Masse Suspensionskulturen erfolgt die Aggregation an beiden zellulären und Neurosphere Ebenen 23-25. Daher ist es möglich, dass jeder Neurosphäre aus mehreren Zellen oder Neurosphären entstehen zu, die Neurosphären Zählen und Auswertung von Multipotenz erschwert. Neuere Erkenntnisse zeigen, dass die Aggregation von Zellen tritt nicht bei niedrigen Plattierungsdichte von 0,5 Zellen / & mgr; l oder weniger beträgt, und wenn Kulturplatten werden bei neu bewegtrosphere Bildung 15. So Kultivierung von Zellen bei so niedrigen Dichte Klonalität würde sicherstellen.
Derzeit ist die NCFCA die am häufigsten verwendete Methode zur Unterscheidung von NSC NPs und NSC Frequenz aufzuzählen. Die NCFCA erfordert jedoch eine relativ lange Zeit von drei Wochen. Hier beschreiben wir ein Protokoll NSC Frequenz aufzuzählen basiert auf der Fähigkeit von NSC multiNeuroSphären zu bilden. Dieses Protokoll dauert nur 13 Tage durchzuführen. Die NCFCA sorgt für Klonalität als die Kollagenmatrix Bewegung der Neurosphären verhindert. Die Kulturbedingungen in diesem Protokoll verwendet ermöglicht auch Klonalität gesamten beibehalten werden. Zum Beispiel stellt die Verwendung von 50-Well-Kammerdeckgläser, dass die Neurosphären ohne einander zu berühren unterscheiden wird. Darüber hinaus verwenden wir konditioniertem Medium , die neurotrophen Faktoren während der Differenzierung liefert das Differenzierungspotential der Neurosphären (Abbildung 1) zu maximieren.
Wir beschreiben hee die Aufzählung von NSCs unter klonalen Bedingungen. Kritische Schritte umfassen die Verwendung von frischen NSC Wachstums- und Differenzierungsmedium und auch die Verwendung von frisch hergestelltem PLL / Laminin-Lösung zur Beschichtung der gekammert Deckgläser sowie die Kulturschalen. Dies sorgt für eine optimale Wachstum und die Differenzierung Bedingungen der Neurosphären. Die Verwendung von guter Qualität Antikörper effektiv die Neuronen und Glia erkennen, sowie die selektive Kommissionieren von klonalen Neurosphären, die nicht in Kontakt mit anderen Neurosphären sind, sind kritisch. Darüber hinaus ist es wichtig, die gepflückt Neurosphären, um sicherzustellen, nicht austrocknen. Es wird empfohlen, nach der Ernte alle 10 Neurosphären in jede Vertiefung 10 & mgr; l Differenzierungsmedium hinzuzufügen. Es ist wichtig, pro Probe ein chambered Deckglas in einem 10-cm-Schale zu verwenden, Übersprechen zwischen Neurosphären aus verschiedenen Proben zu vermeiden. Wenn zwei Deckgläser (mit jeweils Neurosphären aus unterschiedlichen Proben) sind in der platziertgleichen 10 cm Schüssel, Neurosphären aus einem Deckglas könnte Release Faktoren, die die Neigung der Neurosphären in der anderen Deck in bestimmte Abstammungslinien zu unterscheiden verändern können. Zwei Deckgläser in der gleichen 10-cm-Schale kann auch zwischen den Proben in Verwechslung führen.
Im Fall erwartet die NFU oder die NSC Frequenz niedriger als sicher, dass niedrige Passage-Nummer Neurosphären verwendet werden. Es ist auch wichtig, dass gesunde niedrige Durchgang Neurosphären zur Erzeugung konditioniertem Medium verwendet werden. Als nächstes, wenn die Neurosphären in Brunnen mit kleinem Durchmesser kultiviert werden, wie zum Beispiel in 96-Well-Platte, dann wird es schwierig sein, Neurosphären mit einer Mikropipette zu manövrieren und pflücken. In diesem Fall übertragen die Neurosphären zu einem größeren Kulturschale, wie eine 6-Well-Platte vor der Kommissionierung. Einige der aufgenommenen Neurosphären können aus der Kammerdeckglas während der Kultur und Immunfärbung abheben. Die Minimierung der Bewegung des Kammerdeckglas während der Kultur und weniger intensive Waschwährend Immunfärbung ing, würde dazu beitragen, Ablösung von Neurosphären zu vermeiden.
Erste Studien NSCs nur die NFA 7,11,13 mit quantifiziert. Allerdings überschätzt die NFA die NSC Frequenz als beide NSCs und frühen NPs Neurosphären 5 erzeugen. Louis et al. Eine andere Methode entwickelt NSCs zu quantifizieren als NCFCA 21,22 bekannt. Die NCFCA beinhaltet das Züchten einzelne Zellen in einer Kollagen-basierten Matrix Klonalität zu gewährleisten, und es war, dass nur durch NSCs gebildet Neurosphären oberhalb von 2 mm Durchmesser gezeigt. Ähnlich wie bei der NCFCA, Klonalität wird in diesem Protokoll gewährleistet. Dies wird erreicht durch Neurosphären bei klonaler Dichte und Differenzieren der Neurosphären in gekammert Deck erzeugen. Die Verwendung von gekammerten Deck verleiht eine Anzahl von Vorteilen. Das Kammerdeckglas erlaubt jede Probe Neurosphere ohne physischen Kontakt mit anderen Probe Neurosphären zu unterscheiden, wodurch Klonalität während der Differenzierung zu gewährleisten.Das Kammerdeckglas kann auf dem Differenzierungsmedium suspendiert platziert sein, die Probe Neurosphären zu erlauben, kontinuierlich und maximale Differenzierung zu konditionierenden sicherzustellen. In Abwesenheit von konditioniertem Medium und Serum während der Differenzierung, Überleben der Neurosphären abnimmt und die Neurosphären meist Astrozyten (Tham M und Ahmed S, nicht veröffentlicht) erzeugen. Darüber hinaus können die immunogefärbten Neurosphären bequem für längere Zeit und die gekammert Deck gespeichert werden können, direkt auf den Mikroskop-Objektträger aus Glas angebracht werden. Zusätzlich Abbildung der immunogefärbten Neurosphären leicht gemacht, wie man schnell die Neurosphären in dem kleinen gut chambered finden können, ein Bild aufzunehmen, und zum nächsten gut zu bewegen.
Wir haben die NSC Frequenz in E14.5 Maus Neurosphere Kultur bestimmt sowohl das Protokoll in diesem Manuskript beschrieben unter Verwendung von 27 und 28 NCFCA. Die Frequenz NSC in E14.5 Maus sowohl von mir bestimmt Neurosphärenthoden sind vergleichbar. Die NCFCA aufzählt NSCs, die multi- und haben langfristige Selbsterneuerungsfähigkeit. Da die NSC Frequenz von unserem Verfahren, wie das von NCFCA vergleichbar ist, scheint das Auslesen von unserem Protokoll nicht die NSC Frequenz zu überschätzen. Die NCFCA erfordert drei Wochen abgeschlossen sein und in erster Linie beinhaltet Zelle Plattierung und mittlere Nachschub. Das hier beschriebene Protokoll erfordert 13 Tage durchzuführen und beinhaltet eine andere Reihe von Schritten, zum Beispiel Neurosphere Kommissionierung und Immunfärbung. Dieses Protokoll kann als alternative Methode dienen NSCs aufzuzählen. Die Forscher können sowohl NCFCA und dieses Protokoll verwenden NSC Frequenz in ihren Proben zu überprüfen.
Eine Einschränkung dieses Protokolls ist es, dass eine Reihe von wichtigen Schritte sind alle am Tag 8. Die Herstellung des konditionierten Mediums, Bestimmung der NFU Probenneurosphären durchgeführt werden, und die Übertragung von Probe Neurosphären bis zum 50-Well-Kammerdeckglas sein müssen auf da durchgeführty 8. Man könnte einige Zeit dauern, um diese Schritte auszuführen. Darüber hinaus erfordert es Praxis, diese Schritte in einer effizienten Weise durchzuführen.
Neurosphären wurden zu untersuchen NSC Funktion und Verhalten weit verbreitet. Allerdings bestehen Neurosphären sowohl von NSCs und NPS. Daher ist es wichtig, NSCs von Neurosphären zu bereichern NSC Biologie zu studieren. Derzeit Zelloberflächenmarker, Farbstoffausschluss Eigentum sowie Zellgröße und Granularität verwendet wurden für NSCs 6,7,9-13,29,30 zu bereichern. Dieses Protokoll könnte verwendet werden, um die Anreicherung von NSCs durch potentielle NSC Marker zu quantifizieren und die Suche nach einem endgültigen NSC Marker zu erleichtern. Vier neue Studien haben dieses Protokoll verwendet NSC Frequenz 5,14,15,26 aufzuzählen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung (A * STAR), Singapur, diese Forschung für die Finanzierung.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |