Le cellule staminali neurali (NSC) si riferiscono alle cellule che possono auto-rinnovarsi e di differenziarsi in tre linee neurali. Qui, descriviamo un protocollo per determinare la frequenza NSC in una data popolazione di cellule utilizzando neurosfere formazione e la differenziazione in condizioni clonali.
Le cellule staminali neurali (NSC) hanno la capacità di auto-rinnovarsi e di generare i tre principali linee neurali – astrociti, oligodendrociti e neuroni. NSC e progenitori neurali (NP) sono comunemente coltivate in vitro come neurosfere. Questo protocollo descrive in dettaglio come determinare la frequenza NSC in una data popolazione di cellule in condizioni clonali. Il protocollo inizia con la semina delle cellule ad una densità che consente la generazione di neurosfere clonali. Le neurosfere sono poi trasferiti a lamelle a camera e differenziati in condizioni clonali in mezzo condizionato, che massimizza il potenziale di differenziazione delle neurosfere. Infine, la frequenza NSC viene calcolata sulla base di capacità di formazione e di multipotenza neurosfere. Utilità di questo protocollo includono la valutazione dei candidati marcatori NSC, purificazione del NSC, e la capacità di distinguere NSC da NP. Questo metodo richiede 13 giorni per eseguire, che è molto sHorter rispetto ai metodi attuali per enumerare frequenza NSC.
Le cellule staminali neurali (NSC) sono cellule del sistema nervoso centrale (SNC) che possono auto-rinnovare e sono multipotenti. NSC sono prima specificati durante lo sviluppo del prosencefalo embrionale e continuano a persistere nel cervello adulto in regioni specifiche, come la zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali e il giro dentato (DG) dell'ippocampo. Un certo numero di linee di NSC vengono utilizzati negli studi clinici per il trattamento di ictus e altre malattie neurologiche come il morbo di Batten 1.
NSC e progenitori neurali (NP) sono propagate nella cultura come strutture galleggianti sferoidali 3-dimensionale chiamati neurosfere. Il sistema di coltura neurosfere è stato sviluppato da Reynolds e Weiss nei primi anni 1990, quando hanno scoperto che le cellule corticali embrionali e adulte potrebbero suddividere in presenza del fattore di crescita epidermico (EGF) e di base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) 2-4. Neurosfere costituiti da una miscela eterogenea di cells composto di sottoclassi in diversi stadi di sviluppo 5. E 'difficile da studiare specificatamente NSC utilizzando i dati ottenuti da neurosfere a causa della presenza di NP. Quindi, è fondamentale per arricchire NSC da neurosfere. Attualmente, quattro principali metodi sono stati utilizzati per arricchire per NSC in vitro. Il primo è l'uso di marcatori di superficie cellulare. Lewis-X (LEX) e CD133 (noto anche come Prominin1) sono la superficie cellulare più prominente NSC marcatori 6-9. Syndecan-1, Notch-1 e integrina-beta1 sono altre proteine di superficie che arricchiscono per NSC 10. Secondo la esclusione del colorante. E 'stato dimostrato che le cellule laterale di popolazione, che hanno la capacità unica di pompare fuori l'fluorescente DNA-binding colorante Hoechst 33342, sono arricchiti per NSC 11. Terzo è l'uso di selezione morfologica. È stato dimostrato che le cellule con aumento delle dimensioni delle cellule e granularità porto più NSC delle loro controparti 5,12,13. Quarto è l'aggiunta di NSC sufattori rvival al mezzo di coltura. E 'stato dimostrato che l'aggiunta di condroitina solfato proteoglicani e apolipoproteina E migliora NSC sopravvivenza e quindi aumenta la frequenza NSC 14,15. Anche se molti indicatori tra cui fattori di trascrizione sono stati associati con NSC 16,17, nessuno di questi marcatori sono in grado di arricchire NSC alla purezza. A causa della mancanza di marcatori definitivi NSC, rimane una sfida per quantificare NSC e di distinguerli da NP in vitro.
Gli studi iniziali hanno utilizzato il test di formazione neurosfere (NFA) per quantificare NSC 7,11,13. In questo saggio, cellule dissociate sono coltivate per formare neurosfere e il numero di neurosfere generati per ogni 100 cellule piastrate è determinata. Questo valore viene definito come l'Unità di Formazione neurosfere (NFU). La NFU è uguale alla frequenza di NSC se tutte le neurosfere nascono dalla NSC. Tuttavia, è stato dimostrato che la NFU sovrastima la frequenza NSC come neurosfere sono formati da entrambi NSCs e l'inizio NP 5. Così, si è imprecisa enumerare NSC esclusivamente sulla base di formazione neurosfere. Potrebbe essere possibile quantificare NSC in base alla loro capacità di auto-rinnovarsi, proliferano molto e generare neurosfere multipotenti.
NSC, che sono EGF e bFGF reattivo, di solito sopravvivono per almeno dieci passaggi e visualizzare così ampia capacità di auto-rinnovamento nella cultura 4,18-20. NP, che sono EGF e bFGF reattivo così, potrebbe anche generare neurosfere per un paio di passaggi, ma non per un periodo di tempo prolungato. Quindi, è stato ampiamente accettato che bona fide NSC possono essere enumerati con fiera precisione basato sulla formazione neurosfere per almeno dieci passaggi. Nella maggior parte degli studi, tuttavia, auto-rinnovamento è di solito misurato sulla base di formazione neurosfere secondaria o terziaria a causa del lungo tempo sperimentale richiesto per dieci passaggi. Quindi, il NFA secondario può essere utilizzato per confrontare in linea di massima la capacità di auto-rinnovamento scommessapopolazioni Ween, ma non possono essere utilizzati per enumerare accuratamente frequenza NSC.
NSC hanno una maggiore capacità proliferativa rispetto a NP. Questa struttura di NSC è stato utilizzato da Louis et al. per sviluppare un test per l'enumerazione NSC – il dosaggio neurale formanti colonia di cellule (NCFCA) 21,22. In questo saggio, cellule singole sono coltivate per 3 settimane in una matrice di collagene semisolido contenente. In queste condizioni di coltura, è stato dimostrato che le cellule che formano neurosfere sopra i 2 mm di diametro sono tripotent e possono auto-rinnovarsi per il lungo termine. Queste cellule sono definiti come NSC. Pertanto, le NSC sono effettivamente distinti da NP.
NSC hanno la capacità di differenziarsi in astrociti, oligodendrociti e neuroni. Per la differenziazione di neurosfere, fattori di crescita vengono rimossi e siero viene aggiunto al mezzo di coltura. Se tutte e tre le linee neurali sono osservati in un neurosfere, allora la cellula che ha avviato che neurosfere is un NSC. Tuttavia, il saggio differenziazione ha alcune limitazioni. Innanzitutto, le condizioni di coltura utilizzati per la differenziazione potrebbero non essere ottimale per la generazione di tutte le tre linee neurali. Infatti, in un unico processo di differenziazione neurosfere, si verifica la morte delle cellule significativo e per lo più si verifica generazione astrociti (Tham M e Ahmed S, inedito). In secondo luogo, c'è la questione della clonalità. Per precisa enumerazione di NSC, la formazione e la differenziazione delle neurosfere dovrà essere effettuata in condizioni clonali, dove ogni neurosfere nasce da una singola cellula. In colture in sospensione di massa, l'aggregazione avviene sia a livello cellulare e neurosfere 23-25. Quindi, è possibile per ogni neurosfere sorgere da più celle o neurosfere, che complica conteggio neurosfere e valutazione di multipotenza. Dati recenti indicano che l'aggregazione delle cellule non si verifica a bassa densità di placcatura di 0,5 cellule / ml o al di sotto, e quando piastre di coltura non vengono spostati durante neuformazione rosphere 15. Così coltura di cellule a così bassa densità garantirebbe clonality.
Attualmente, il NCFCA è il metodo più comunemente utilizzato per distinguere NSCs da NP ed enumerare la frequenza NSC. Il NCFCA, tuttavia, richiede un tempo relativamente lungo di tre settimane. Qui, descriviamo un protocollo per enumerare frequenza NSC basata sulla capacità di NSC di formare neurosfere multipotenti. Questo protocollo richiede solo 13 giorni di tempo per eseguire. Il NCFCA assicura clonalità come la matrice di collagene impedisce il movimento delle neurosfere. Le condizioni di coltura utilizzate in questo protocollo permette anche clonalità essere mantenuto per tutto. Per esempio, l'uso di 50-well coprioggetti camerata assicura che le neurosfere si differenziano senza contatto tra loro. Inoltre, utilizziamo condizionati mezzo che fornisce fattori neurotrofici durante la differenziazione per massimizzare il potenziale di differenziazione delle neurosfere (Figura 1).
Descriviamo hee l'enumerazione di NSC in condizioni clonali. Passaggi critici includono l'uso di crescita e differenziazione medio NSC fresco, e anche l'uso della soluzione PLL / laminina appena preparato per rivestire i coprioggetti camerata, così come le piastre di coltura. Ciò assicura condizioni di crescita e differenziazione ottimali dei neurosfere. L'uso di anticorpi di buona qualità per rilevare efficacemente i neuroni e glia, nonché la raccolta selettiva di neurosfere clonali che non sono in contatto con altri neurosfere, sono critici. Inoltre, è importante assicurare le neurosfere raccolte non seccare. Si raccomanda di aggiungere 10 ml di media differenziazione per ogni pozzetto dopo aver raccolto ogni 10 neurosfere. È importante utilizzare un coprioggetto camerata in un piatto 10 centimetri per campione per evitare diafonia tra neurospheres da campioni differenti. Se due coprioggetto (ciascuna contenente neurosfere da campioni diversi) vengono inseriti nellastesso 10 centimetri piatto, neurosfere da un vetrino potrebbe rilasciare fattori che possono alterare la propensione del neurosfere nell'altro coprioggetto di differenziarsi in linee specifiche. Due coprioggetto nello stesso piatto 10 centimetri possono anche provocare confusione tra i campioni.
Nel caso in cui la NFU o la frequenza NSC è inferiore al previsto, in modo che basso numero di passaggio neurosfere sono utilizzati. E 'anche importante che sani neurosfere passaggio basso sono utilizzati per generare mezzo condizionato. Quindi, se le neurosfere sono coltivate in pozzetti di piccolo diametro, ad esempio in 96 pozzetti piatto, allora sarà difficile da manovrare e scegliere neurospheres utilizzando una micropipetta. In questo caso, trasferire i neurosfere ad un grande piatto di coltura, ad esempio un piatto 6 pozzetti, prima della raccolta. Alcune delle neurosfere raccolti possono sollevare dal vetrino a camera durante la coltura e immunocolorazione. Minimizzare il movimento del vetrino a camera durante la coltura, e meno lavaggio intensivoing durante immunostaining, aiuterebbe ad evitare il distacco di neurosfere.
Gli studi iniziali quantificati NSC utilizzando solo la NFA 7,11,13. Tuttavia, la NFA sovrastima la frequenza NSC sia come NSC e primi NP generano neurosfere 5. Louis et al. Sviluppato un altro metodo per quantificare NSC conosciuto come il NCFCA 21,22. Il NCFCA comporta coltura di cellule singole in una matrice a base di collagene per assicurare clonalità, ed è stato dimostrato che neurosfere sopra i 2 mm di diametro sono formate da solo NSC. Simile al NCFCA, clonalità è garantita nel corso di questo protocollo. Ciò si ottiene mediante la generazione di neurosfere a densità clonale e differenziando le neurosfere in coprioggetti incamerata. L'uso di coprioggetto a camera conferisce una serie di vantaggi. Il vetrino camerata permette ad ogni neurosfere campione di differenziare senza avere un contatto fisico con altri neurosfere di esempio, in tal modo assicurando clonalità durante la differenziazione.Il vetrino camerata può essere posizionato in sospensione sul mezzo di differenziazione per consentire le neurosfere campione da continuamente condizionati e per garantire la massima differenziazione. In assenza di mezzo condizionato e siero durante il differenziamento, la sopravvivenza delle neurosfere diminuisce e le neurosfere principalmente generare astrociti (Tham M e S Ahmed, non pubblicati). Inoltre, le neurosfere immunostained possono essere convenientemente conservati per lunghi periodi di tempo e le coprioggetti camerata possono essere montati direttamente sui vetrini da microscopio. Inoltre, l'imaging delle neurosfere immunostained è facile come si può individuare rapidamente il neurosfere nel piccolo camerata bene, scattare una foto, e passare a quello successivo bene.
Abbiamo determinato la frequenza NSC in E14.5 cultura del mouse neurosfere utilizzando sia il protocollo descritto in questo manoscritto 27 e 28 NCFCA. La frequenza NSC in E14.5 neurosfere topo determinata sia da methods sono paragonabili. Il NCFCA enumera NSC che sono multipotenti e hanno la capacità di auto-rinnovamento a lungo termine. Poiché la frequenza NSC dal nostro metodo è paragonabile a quella da NCFCA, la lettura dei protocolli non sembra sovrastimare la frequenza NSC. Il NCFCA richiede tre settimane per essere completato e coinvolge principalmente la placcatura delle cellule e medie rifornimento. Il protocollo qui descritto richiede 13 giorni per eseguire e comporta una serie di passi, ad esempio, raccolta neurosfere e immunocolorazione. Questo protocollo potrebbe servire come metodo alternativo per enumerare NSC. I ricercatori possono utilizzare sia NCFCA e questo protocollo per verificare la frequenza NSC nei loro campioni.
Una limitazione di questo protocollo è che una serie di passi importanti devono essere tutte eseguite il giorno 8. La preparazione del mezzo condizionato, la determinazione di NFU di neurosfere campione, e il trasferimento di neurosfere di esempio sul vetrino 50-bene a camera deve essere eseguita su day 8. Si potrebbe prendere tempo per completare la procedura. Inoltre, si richiede pratica per eseguire queste operazioni in modo efficiente.
Neurosfere sono stati ampiamente utilizzati per studiare la funzione e il comportamento NSC. Tuttavia, neurosfere sono costituiti da entrambe le NSC e NP. Quindi, è importante per arricchire NSC da neurosfere per studiare la biologia NSC. Attualmente, marcatori di superficie delle cellule, di proprietà esclusione del colorante nonché le dimensioni delle cellule e la granularità sono stati utilizzati per arricchire per NSC 6,7,9-13,29,30. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per quantificare l'arricchimento di NSC da potenziali marcatori NSC, e per facilitare la ricerca di un marcatore definitiva NSC. Quattro studi recenti hanno utilizzato questo protocollo per enumerare frequenza NSC 5,14,15,26.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo l'Agenzia per la Scienza, Tecnologia e Ricerca (A * STAR), Singapore per il finanziamento di questa ricerca.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |