神経幹細胞(NSCは)自己再生および3神経系統に分化することができる細胞を指します。ここでは、クローン性条件下でニューロスフェア形成および分化を使用して、指定された細胞集団におけるNSCの周波数を決定するためのプロトコルを説明します。
アストロサイト、ニューロンおよびオリゴデンドロサイト – 神経幹細胞(NSCは)自己再生および3の主要な神経系統を生成する能力を持っています。 NSCは神経前駆細胞(NPS)は、ニューロスフェアとしてin vitroで一般的に培養されます。このプロトコルは、クローンの条件下で与えられた細胞集団におけるNSC周波数を決定する方法を詳細に説明しています。プロトコルはクローンニューロスフィアの生成を可能にする密度で細胞の播種から始まります。ニューロスフェアは、その後のチャンバーカバーグラスに移し、ニューロスフェアの分化能を最大化する馴化培地中のクローンの条件で区別されます。最後に、NSC周波数はニューロスフェアの形成及び多分化能力に基づいて算出されます。このプロトコルのユーティリティは、候補NSCマーカーの評価、NSCの精製、及びNPのからのNSCを区別する能力が含まれます。この方法は、多くのsとなる、実行するために13日かかりますNSCの周波数を列挙するための現在の方法よりもhorter。
神経幹細胞(NSC)自己複製することができる中枢神経系(CNS)の細胞であり、多能です。 NSCは、最初の胚の前脳の開発中に指定されており、このような側脳室の脳室下帯(SVZ)および海馬の歯状回(DG)のように特定の領域での成人の脳に固執し続けています。 NSC線の数は、バッテン病1と脳卒中および他の神経学的疾患の治療のための臨床試験で使用されています。
NSCは神経前駆細胞(NPS)は、ニューロスフェアと呼ばれる3次元回転楕円体構造をフローティングとして、培養中で増殖させます。それらは、胚および成体の皮質細胞は、上皮増殖因子(EGF)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)2-4の存在下で分割できることが分かった場合に神経球培養系は、1990年代初期にレイノルズとワイスによって開発されました。ニューロスフェアは、cの異機種混在で構成され異なる発達段階5でサブクラスからなるells。特にによるNPの存在のために神経球から得られたデータを用いたNSCを研究するために困難です。したがって、神経球からのNSCを豊かにすることが重要です。現在では、4つの主な方法は、in vitroでのNSCを濃縮するために使用されています。第一の細胞表面マーカーの使用です。ルイス-X(LEX)とCD133(もProminin1として知られている)が最も顕著な細胞表面NSCマーカー6-9です。シンデカン1、ノッチ-1とインテグリン-β1は、NSCの10を濃縮する他の表面タンパク質です。第二には、色素排除です。蛍光DNA結合色素ヘキスト33342を送り出すためのユニークな能力を持っているサイドポピュレーション細胞は、NSCの11のために濃縮されていることが示されています。第三には、形態学的選択の使用です。増加した細胞サイズおよび粒度を有する細胞は、それらの対応5,12,13以上のNSCを保有することが実証されています。第四は、NSCのsuの追加です培養培地へのrvival要因。これは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの添加が示されており、アポリポタンパク質Eは、NSCの生存を増強し、従ってNSC周波数14,15を増加させます。転写因子を含む多くのマーカーがNSCの16,17に関連付けられてきたが、これらのマーカーのいずれも、純度のNSCを豊かにすることはできません。決定的なNSCマーカーの欠如のために、それはのNSCを定量化し、in vitroでのNPと区別するために、課題です。
初期の研究では、NSCを7,11,13を定量化するためにニューロスフェア形成アッセイ(NFA)を使用します。このアッセイでは、解離した細胞は、ニューロスフェアを形成するために培養し、神経球の数が決定されるめっきすべて100個の細胞に対して生成されました。この値は、ニューロスフェア形成ユニット(NFU)と呼ばれています。すべてのニューロスフェアはNSCのから発生した場合NFUは、NSCの周波数に等しいです。しかし、神経球は、両方のNSによって形成されるNFUはNSCの頻度を過大評価することが示されましたCsと早期のNP 5。したがって、もっぱらニューロスフェア形成に基づいたNSCを列挙するために不正確です。自己再生広範囲に増殖し、多能ニューロスフェアを生成するそれらの能力に基づいたNSCを定量化することが可能であってもよいです。
EGFおよびbFGF応答性であるNSCは、通常、少なくとも10継代のために生き残るため、文化4,18-20で豊富な自己再生能力を表示します。 EGFおよびbFGFが同様に応答性であるNPは、また、いくつかの通路のためではなく、長期間の神経球を生成することができます。したがって、広く善意のNSCは、少なくとも10継代のためのニューロスフェア形成に基づく公正な精度で列挙できることが受け入れられてきました。ほとんどの研究では、しかし、自己再生は通常により10継代のために必要な長い実験時間に第二又は第三ニューロスフェアの形成に基づいて測定されます。したがって、二次NFAは広く自己再生能力賭けを比較するために使用することができますWEEN集団は、しかし正確にNSCの周波数を列挙するために使用することはできません。
NSCは、NPのに比べて大きな増殖能を有しています。 NSCのこのプロパティは、ルイらによって使用されました。神経コロニー形成細胞アッセイ(NCFCA)21,22 – NSC列挙するためのアッセイを開発します。このアッセイでは、単一の細胞がコラーゲンを含む半固体マトリックス中に3週間培養されます。これらの培養条件下では、直径2mm上記のニューロスフェアを形成する細胞がtripotentあり、長期自己再生することができることが示されました。これらの細胞は、NSCのように定義されます。したがって、NSCは、NPをより効果的に区別されます。
NSCは、アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよび神経細胞に分化する能力を有します。神経球の分化は、増殖因子を除去し、血清を培地に添加されます。すべての3つの神経系統は、そのニューロスフェアを開始し、その後、細胞神経球で観察されている場合、私NSCは、S。しかし、分化アッセイは、いくつかの制限を有します。まず、分化のために使用される培養条件は、3つすべての神経系統の生成のために最適ではないかもしれません。実際には、単一の神経球の分化過程において、有意な細胞死が発生し、主にアストロサイトの生成は(未発表、タムMとアーメド・S)が発生します。第二に、クローン性の問題があります。 NSCの正確な計数のために、ニューロスフェアの形成と分化は、各ニューロスフェアを単一細胞から生じる場合には、クローン性条件下で行われなければなりません。バルク懸濁培養では、凝集は、細胞および神経球のレベル23-25の両方で発生します。各ニューロスフェアは、多分化の神経球計数および評価を複雑にする、複数のセルまたはニューロスフェアから発生するしたがって、それは可能です。最近の証拠は、細胞の凝集が0.5細胞/μL以下または低いプレーティング密度で発生していないことを示し、そして培養プレートをNEU中に移動されていない場合rosphere形成15。したがってクローン性を確実にするような低密度で細胞を培養します。
現在、NCFCAはNPのからのNSCを区別し、NSCの周波数を列挙するための最も一般的に使用される方法です。 NCFCAは、しかし、3週間、比較的長い時間を要します。ここでは、多能性神経球を形成するNSCの能力に基づいて、NSCの周波数を列挙するためのプロトコルを説明します。このプロトコルは、実行するためにのみ13日かかります。コラーゲンマトリックスは、ニューロスフェアの移動を防止するようNCFCAは、クローン性を保証します。このプロトコルで使用される培養条件はまた、クローンを全体にわたって維持されることを可能にします。例えば、50ウェルチャンバーカバースリップの使用は、ニューロスフェアが互いに接触することなく区別するようになります。さらに、我々は、神経球の分化能( 図1)を最大化するために、分化中の神経栄養因子を提供する馴化培地を使用します。
私たちは姫クローン性条件下でのNSCの列挙について説明します。重要なステップは、新鮮なNSCの増殖および分化培地の使用、またコートに新たに調製したPLL /ラミニン溶液を用いチャンバーカバーグラスだけでなく、培養皿を含みます。これは、ニューロスフェアの最適な増殖と分化条件を確保します。良質の抗体の使用は、効果的に、ニューロンおよびグリア、並びに他の神経球に接触していないクローンのニューロスフェアの選択的なピッキングを検出するために、重要です。さらに、それを拾って、神経球が枯渇しないようにすることが重要です。すべての10の神経球をピッキングした後、各ウェルに分化培地の10μLを追加することをお勧めします。異なるサンプルからの神経球の間のクロストークを回避するために、サンプルごとに10cmの皿の一方チャンバーカバーガラスを使用することが重要です。 2カバースリップ(異なる試料からそれぞれ含む神経球)に配置されている場合同じ10cmディッシュ、1カバーガラスからの神経球は、特定の系統に分化するために、他のカバースリップにニューロスフェアの傾向を変更することができる因子を放出する可能性があります。同じ10cmの皿の中の二つのカバースリップはまた、サンプル間のミックスアップになることがあります。
NFUまたはNSC周波数が予想よりも低い場合には、低継代数のニューロスフェアが使用されていることを確認してください。健全な低継代のニューロスフェアは、馴化培地を生成するために使用されていることも重要です。ニューロスフェアは、96ウェル皿のように小径、とのウェル中で培養される場合は次に、操縦し、マイクロピペットを用いて、ニューロスフェアを選択することが困難になります。この場合、ピッキングの前に6ウェル皿のようなより大きな培養皿に神経球を移します。選んだニューロスフェアの一部は、文化や免疫染色の間のチャンバーカバーガラスから持ち上げことがあります。培養中のチャンバーカバーガラスの動き、およびより少ない集中的な洗浄を最小限に抑えます免疫染色の際にる、ニューロスフェアの剥離を回避するのに役立つだろう。
初期の研究では、唯一のNFA 7,11,13を使用したNSCを定量化しました。両方のNSCおよび早期NPは、神経球5を生成するようしかし、NFAは、NSCの周波数を過大評価します。ルイらは NCFCA 21,22として知られているのNSCを定量化するための別の方法を開発しました。 NCFCAは、クローン性を保証するために、コラーゲンベースのマトリックス中に単一細胞を培養することを含む、それが直径2mm上記ニューロスフェアのみのNSCによって形成されることが示されました。 NCFCAと同様に、クローンは、このプロトコルを通じて確保されています。これは、クローン密度でのニューロスフェアを生成し、チャンバーカバーガラスでニューロスフェアを微分することにより達成されます。チェンカバースリップの使用は多くの利点を与えます。チャンバーカバースリップは、それによって分化の間にクローン性を確保し、他のサンプルのニューロスフェアと物理的に接触しなくても、区別するために、各サンプルのニューロスフェアを可能にします。チャンバーカバーガラスサンプル神経球を連続的に調整することができるように、最大の分化を確実にするために分化培地に懸濁し配置することができます。分化中の馴化培地と血清の非存在下では、ニューロスフェアの生存率は低下し、神経球を主にアストロサイト(タムMとアーメドS、未発表)を生成します。また、免疫染色ニューロスフィアは、好都合に長期間保存することができ、チャンバーカバースリップを顕微鏡用スライドガラス上に直接取り付けることができます。 1はすぐに、よくチャンバー小で神経球を見つけるのイメージをキャプチャし、次のウェルに移動することができるように加えて、免疫染色ニューロスフェアの撮像が容易になります。
我々は、この原稿27とNCFCA 28に記載されているプロトコルの両方を使用してE14.5マウスニューロスフェア培養におけるNSCの周波数を決定しました。私の両方によって決定さE14.5マウスニューロスフェアでNSC周波数thodsは同等です。 NCFCAは多能であり、長期自己再生能力を持っているのNSCを列挙します。我々の方法からNSC周波数はNCFCAからそれに匹敵するので、私たちのプロトコルからの読み出しは、NSCの周波数を過大評価していないようです。 NCFCAが完了するまでに3週間を必要とし、主に細胞播種と培地補充を必要とします。ここで説明するプロトコルは、実行するために13日を要するとステップの異なるシリーズ、 例えば 、神経球のピッキング及び免疫染色を伴います。このプロトコルは、NSCのを列挙するための代替法として役立つ可能性があります。研究者は、その試料中のNSCの周波数を確認するためにNCFCAと、このプロトコルの両方を使用することができます。
このプロトコルの1つの制限は重要な一連のステップは、すべての条件培地、サンプルのニューロスフェアのNFUの決意、そして50ウェルのチャンバーカバースリップへのサンプルのニューロスフェアの転送の準備をしなければならない8日目に行わなければならないことですダ上で実行Y 8.一つは、これらのステップを完了するまでに時間がかかる場合があります。また、効率的な方法でこれらの手順を実行するには練習が必要です。
ニューロスフェアは、広くNSC機能および挙動を研究するために使用されています。しかし、神経球のNSCとNPの両方で構成されています。したがって、NSCの生物学を研究するために、神経球からのNSCを豊かにすることが重要です。現在、細胞表面マーカー、色素排除性並びに細胞サイズおよび粒度は、NSCを6,7,9-13,29,30を濃縮するために使用されてきました。このプロトコルは、潜在的なNSCマーカーによってNSCの富化を定量化し、決定的なNSCマーカーの探索を容易にするために使用することができます。四つの最近の研究では、NSCの周波数5,14,15,26を列挙するために、このプロトコルを使用しています。
The authors have nothing to disclose.
我々は、この研究に資金を提供するための科学技術研究庁(* STARの)、シンガポールに感謝します。
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |