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Neuroscience

クローンのアッセイを用いて神経幹細胞の列挙

doi: 10.3791/54456 Published: October 4, 2016

Summary

神経幹細胞(NSCは)自己再生および3神経系統に分化することができる細胞を指します。ここでは、クローン性条件下でニューロスフェア形成および分化を使用して、指定された細胞集団におけるNSCの周波数を決定するためのプロトコルを説明します。

Abstract

アストロサイト、ニューロンおよびオリゴデンドロサイト - 神経幹細胞(NSCは)自己再生および3の主要な神経系統を生成する能力を持っています。 NSCは神経前駆細胞(NPS)は、ニューロスフェアとしてin vitroで一般的に培養されます。このプロトコルは、クローンの条件下で与えられた細胞集団におけるNSC周波数を決定する方法を詳細に説明しています。プロトコルはクローンニューロスフィアの生成を可能にする密度で細胞の播種から始まります。ニューロスフェアは、その後のチャンバーカバーグラスに移し、ニューロスフェアの分化能を最大化する馴化培地中のクローンの条件で区別されます。最後に、NSC周波数はニューロスフェアの形成及び多分化能力に基づいて算出されます。このプロトコルのユーティリティは、候補NSCマーカーの評価、NSCの精製、及びNPのからのNSCを区別する能力が含まれます。この方法は、多くのsとなる、実行するために13日かかりますNSCの周波数を列挙するための現在の方法よりもhorter。

Introduction

神経幹細胞(NSC)自己複製することができる中枢神経系(CNS)の細胞であり、多能です。 NSCは、最初の胚の前脳の開発中に指定されており、このような側脳室の脳室下帯(SVZ)および海馬の歯状回(DG)のように特定の領域での成人の脳に固執し続けています。 NSC線の数は、バッテン病1と脳卒中および他の神経学的疾患の治療のための臨床試験で使用されています。

NSCは神経前駆細胞(NPS)は、ニューロスフェアと呼ばれる3次元回転楕円体構造をフローティングとして、培養中で増殖させます。それらは、胚および成体の皮質細胞は、上皮増殖因子(EGF)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)2-4の存在下で分割できることが分かった場合に神経球培養系は、1990年代初期にレイノルズとワイスによって開発されました。ニューロスフェアは、cの異機種混在で構成され異なる発達段階5でサブクラスからなるells。特にによるNPの存在のために神経球から得られたデータを用いたNSCを研究するために困難です。したがって、神経球からのNSCを豊かにすることが重要です。現在では、4つの主な方法は、in vitroでのNSCを濃縮するために使用されています。第一の細胞表面マーカーの使用です。ルイス-X(LEX)とCD133(もProminin1として知られている)が最も顕著な細胞表面NSCマーカー6-9です。シンデカン1、ノッチ-1とインテグリン-β1は、NSCの10を濃縮する他の表面タンパク質です。第二には、色素排除です。蛍光DNA結合色素ヘキスト33342を送り出すためのユニークな能力を持っているサイドポピュレーション細胞は、NSCの11のために濃縮されていることが示されています。第三には、形態学的選択の使用です。増加した細胞サイズおよび粒度を有する細胞は、それらの対応5,12,13以上のNSCを保有することが実証されています。第四は、NSCのsuの追加です培養培地へのrvival要因。これは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの添加が示されており、アポリポタンパク質Eは、NSCの生存を増強し、従ってNSC周波数14,15を増加せます。転写因子を含む多くのマーカーがNSCの16,17に関連付けられてきたが、これらのマーカーのいずれも、純度のNSCを豊かにすることはできません。決定的なNSCマーカーの欠如のために、それはのNSCを定量化し、in vitroでのNPと区別するために、課題です。

初期の研究では、NSCを7,11,13を定量化するためにニューロスフェア形成アッセイ(NFA)を使用します。このアッセイでは、解離した細胞は、ニューロスフェアを形成するために培養し、神経球の数が決定されるめっきすべて100個の細胞に対して生成されました。この値は、ニューロスフェア形成ユニット(NFU)と呼ばれています。すべてのニューロスフェアはNSCのから発生した場合NFUは、NSCの周波数に等しいです。しかし、神経球は、両方のNSによって形成されるNFUはNSCの頻度を過大評価することが示されましたCsと早期のNP 5。したがって、もっぱらニューロスフェア形成に基づいたNSCを列挙するために不正確です。自己再生広範囲に増殖し、多能ニューロスフェアを生成するそれらの能力に基づいたNSCを定量化することが可能であってもよいです。

EGFおよびbFGF応答性であるNSCは、通常、少なくとも10継代のために生き残るため、文化4,18-20で豊富な自己再生能力を表示します。 EGFおよびbFGFが同様に応答性であるNPは、また、いくつかの通路のためではなく、長期間の神経球を生成することができます。したがって、広く善意のNSCは、少なくとも10継代のためのニューロスフェア形成に基づく公正な精度で列挙できることが受け入れられてきました。ほとんどの研究では、しかし、自己再生は通常により10継代のために必要な長い実験時間に第二又は第三ニューロスフェアの形成に基づいて測定されます。したがって、二次NFAは広く自己再生能力賭けを比較するために使用することができますWEEN集団は、しかし正確にNSCの周波数を列挙するために使用することはできません。

NSCは、NPのに比べて大きな増殖能を有しています。 NSCのこのプロパティは、ルイによって使用されました。神経コロニー形成細胞アッセイ(NCFCA)21,22 - NSC列挙するためのアッセイを開発します。このアッセイでは、単一の細胞がコラーゲンを含む半固体マトリックス中に3週間培養されます。これらの培養条件下では、直径2mm上記のニューロスフェアを形成する細胞がtripotentあり、長期自己再生することができることが示されました。これらの細胞は、NSCのように定義されます。したがって、NSCは、NPをより効果的に区別されます。

NSCは、アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよび神経細胞に分化する能力を有します。神経球の分化は、増殖因子を除去し、血清を培地に添加されます。すべての3つの神経系統は、そのニューロスフェアを開始し、その後、細胞神経球で観察されている場合、私NSCは、S。しかし、分化アッセイは、いくつかの制限を有します。まず、分化のために使用される培養条件は、3つすべての神経系統の生成のために最適ではないかもしれません。実際には、単一の神経球の分化過程において、有意な細胞死が発生し、主にアストロサイトの生成は(未発表、タムMとアーメド・S)が発生します。第二に、クローン性の問題があります。 NSCの正確な計数のために、ニューロスフェアの形成と分化は、各ニューロスフェアを単一細胞から生じる場合には、クローン性条件下で行われなければなりません。バルク懸濁培養では、凝集は、細胞および神経球のレベル23-25の両方で発生します。各ニューロスフェアは、多分化の神経球計数および評価を複雑にする、複数のセルまたはニューロスフェアから発生するしたがって、それは可能です。最近の証拠は、細胞の凝集が0.5細胞/μL以下または低いプレーティング密度で発生していないことを示し、そして培養プレートをNEU中に移動されていない場合rosphere形成15。したがってクローン性を確実にするような低密度で細胞を培養します。

現在、NCFCAはNPのからのNSCを区別し、NSCの周波数を列挙するための最も一般的に使用される方法です。 NCFCAは、しかし、3週間、比較的長い時間を要します。ここでは、多能性神経球を形成するNSCの能力に基づいて、NSCの周波数を列挙するためのプロトコルを説明します。このプロトコルは、実行するためにのみ13日かかります。コラーゲンマトリックスは、ニューロスフェアの移動を防止するようNCFCAは、クローン性を保証します。このプロトコルで使用される培養条件はまた、クローンを全体にわたって維持されることを可能にします。例えば、50ウェルチャンバーカバースリップの使用は、ニューロスフェアが互いに接触することなく区別するようになります。さらに、我々は、神経球の分化能( 図1)を最大化するために、分化中の神経栄養因子を提供する馴化培地を使用します。

Protocol

動物の治療は、IACUCとNACLARガイドラインに従って行われ、動物部門((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11)によって承認されました
注:以前5に記載のようにニューロスフェア培養物を胚(E14)C57BL / 6マウスの前脳から調製しました。

文化クローンサンプル神経球の1(1日目)

  1. / 10 NG:、EGF(最終濃度:20 ngの/ mL)を:B27サプリメント(1×最終濃度)を含むダルベッコ改変イーグル培地/栄養F-12(DMEM / F12)培地を組み合わせることにより、NSCの増殖培地を準備し、bFGFの(最終濃度mL)およびペニシリン/ストレプトマイシン(最終濃度:1×)。
  2. 1 mLのNSCの増殖培地、室温で7分間1 mLの0.05 N水酸化ナトリウムでのE14.5マウスニューロスフェアを解離します。上下ピペット細胞は時折、懸濁液中の細胞を維持します。ニュートラルに0.05 N塩酸の1 mLを加えアルカリをIZE。
    注:ニューロスフェア細胞を10cm培養皿で20,000細胞/ mLで播種し、37℃、5%CO 2で5日間培養します。予想収量は後に10cmディッシュあたり約10万個の細胞です。次いで、これらの細胞を解離し、ステップそれぞれ1.2および1.3に記載のクローン密度で播種します。
    1. トリパンブルー染色し、血球計数器を用いて細胞数を実行します。
  3. 96ウェルディッシュ中/ mLの以下100μLNSCの増殖培地中で50個の細胞の密度で種単E14.5マウスニューロスフィア細胞。クローンのニューロスフェアを生成するために、wは37℃で1、5%CO 2で細胞をインキュベートします。
    注:細胞が互いに接触しないようにクローン性は、この密度でニューロスフェア形成中に確保されています。

馴化培地のための神経球の2.文化(3日目)

  1. ステップ1.2で説明したようにE14.5マウスニューロスフェアを解離します。
  2. Eからシード単細胞10cmの培養皿中で10 mLのNSCの増殖培地中に20,000細胞/ mlの密度で14.5マウスニューロスフェア。バルク培養ニューロスフェアを生成するために、5日間、37℃、5%CO 2で細胞をインキュベートします。

条件培地ニューロスフィアの調製(8日目)

  1. 700μLを混合して塗布液を調製し、0.01%ポリ-L-リジン(PLL)、70の1mgμL/ mlのラミニンとのリン酸緩衝生理食塩水6,230μL(PBS)。
  2. 被膜を37℃で2時間、PLL /ラミニン溶液の7mLのと10cmの培養皿。
  3. 10 mLの血清学的ピペットを使用して、15 mLのコニカル遠心分離管にすべてのバルク培養ニューロスフェアを転送します。室温で1分間、171×gでニューロスフェアを遠心分離し、上清を完全に除去します。
  4. B27(最終濃度:1×)を含むDMEM / F12培地を組み合わせることにより、NSCの分化培地を調製し、ウシ胎児血清(FBS)(最終濃度:0.5%)広告ニューロスフェアへのNSCの分化培地のD 10ミリリットル。アップピペットで数回上下ニューロスフェアを再懸濁します。
  5. 10cmの培養皿から吸引し、PLL /ラミニンおよび10 mLのPBSで1回洗浄。 PLL /ラミニンでコーティングされた10cmの培養皿にすべての神経球を転送します。皿に付着するの神経球を37℃、5%CO 2でO / Nインキュベートします。

サンプルニューロスフィアのNFUの4決意(8日目)

  1. (;セクション1 1日目に播種)だけでなく、顕微鏡下でそれぞれに形成された神経球の数をカウントします。
    注:NFUを与えるメッキ100細胞当たりに形成されるニューロスフェアの数を、決定します。

50ウェルチェンカバースリップ(8日目)にサンプルニューロスフィアの5.移転

  1. 被膜を37℃で2時間、PLL /ラミニンコーティング溶液10μLで50ウェルチャンバーカバースリップの各ウェル。
    注:に記載のように塗布液を調製ステップ3.1。
  2. PBSそれぞれの30 mLを含む3×50 mLのコニカル遠心チューブを準備します。滅菌ピンセットを用いて、コーティングした50ウェルチャンバーカバースリップを削除します。塗布液を洗い流すために、第二、次いで、PBSの第3チューブに続いてPBSの第1のチューブの中にチャンバーカバースリップを浸します。
  3. チャンバーカバーガラスのウェルから残りの液体を吸引します。
  4. 静かに96ウェルディッシュの各ウェルからすべてのメディアとニューロスフェアをピペットし、単一の10cmの培養皿に移します。
  5. 顕微鏡下で、10μLピペットチップを装着したP10マイクロピペットを用いてサンプルのニューロスフェアを選択します。単一の神経球を2μLにピペット列を設定して、各時間に取得されていることを確認してください。各ニューロスフェアのために新しいピペットチップを使用してください。
  6. コーティングした50ウェルチャンバーカバースリップの井戸の中心に神経球を転送します。
  7. 繰り返して、チェンカバースリップコンタの各ウェルまで5.5と5.6ステップニューロスフェアをINS。
    注:ニューロスフェアは、層流フード内またはベンチトップ上に置かれ、顕微鏡下で採取することができます。
  8. チェンカバースリップの各ウェルに10μLNSCの分化培地を追加します。 NSCの分化培地の乾燥を防ぐために、皿の縁に沿って10cmの培養皿とピペットPBSでチャンバーカバーガラスを置きます。 1 10cmの培養皿に2室のカバースリップまで置きます。 37℃、5%CO 2で一晩(10cmの培養皿に含まれている)のチャンバーカバースリップをインキュベートします。

サンプルニューロスフェアの6分化(9日目)

  1. 15 mLのコニカル遠心チューブに(部3からの)バルク培養した神経球から分化培地を転送します。分化培地の2-3 mLの取り外しから接着細胞を防止するために、培養皿に残っていることを確認してください。 20 mLの滅菌注射器を使用して、0.2μを通じて分化培地を渡しますメートルフィルタは、任意の細胞や破片を除去します。
  2. バック付着した細胞を含有する10cmの培養皿にフィルタリング分化培地を転送します。
  3. 滅菌ピンセットを使用して、静かにサンプルのニューロスフェアを下向きにしているような反転方法で分化培地上にチャンバーカバースリップを配置。 37℃で3日間分化培地とチャンバーカバースリップをインキュベートし、5%CO 2。
    注:サンプルの神経球分化培地と接触しているではなく、分化細胞と接触して下。

分化した神経球の7.固定(12日目)

  1. 静かに滅菌ピンセットを用いて、10cmの培養皿からチャンバーカバースリップを削除します。静かに馴化培地を洗い落とすためにPBSにカバースリップを浸します。
  2. カバーガラスからシリコンガスケットをはがし。カバーガラスを破損しないために静かに、ゆっくりと、これを実行します。サイド番目の点に注意してください電子分化した神経球が接着されています。
  3. カバースリップの大きさにパラフィンフィルムの切断片の上に4%パラホルムアルデヒド(PFA)のピペット1ミリリットル。ゆっくりとPFAと接触して下向きにニューロスフェアとパラフィン膜の上にカバースリップを配置。 RTで20分間のニューロスフェアを修正しました。
    注意:PFAは、液体および蒸気形態の両方で毒性があり、可燃性です。蒸気の吸入を避け、皮膚や目に接触。常に換気ドラフト内でPFAを扱います。
  4. パラフィンフィルム片の上にPBSのピペットで1 mLです。穏やかに神経球を室温で10分間、PBSに接触して下方に向けてカバースリップを配置することによって、ニューロスフェアを洗浄します。
  5. 繰り返しステップ7.4をさらに2回。

分化した神経球の8. O4染色(12日目)

  1. PBS中の3%ウシ血清アルブミン(BSA)を準備します。パラフィンフィルム片の上に3%BSAをピペット1ミリリットル。優しくplacinによってニューロスフェアをブロックRTで30分間、BSAと接触している(下に向けてニューロスフェアで)グラムカバースリップ。
  2. ピペット1マウスmLの抗O4 IgM抗体(1:3%BSAで300倍希釈)パラフィンフィルム片の上に及び抗体と接触して下向きにニューロスフェアにパラフィンフィルム上にカバースリップを配置。 O4染色は室温で2時間に発生することができます。
  3. ステップ7.4で説明したようにPBSで2回カバースリップを洗ってください。
  4. 緑色蛍光色素コンジュゲート抗マウスIgM二次抗体のピペット1mLの(1:500 3%BSAで希釈)パラフィンフィルム片へと抗体と接触して下向きにニューロスフェアパラフィンフィルム上にカバースリップを配置。暗所で室温で1時間放置。
    注:これ以降のステップから暗い環境で免疫染色を行います。
  5. ステップ7.4で説明したようにPBSで2回カバースリップを洗ってください。

9.するTuj1およびグリア細胞繊維性酸性タンパク質(GFAP)染色分化した神経球の(12日目)

  1. 3%BSAに:トリトンX-100(0.5%最終濃度)を添加することによって浸透溶液を調製します。パラフィンフィルム片に溶液を透過性のピペットで1 mLです。 RTで20分間透過化溶液と接触下向きにニューロスフェアとパラフィン膜の上にカバースリップを置きます。
  2. ステップ7.4で説明したようにPBSで2回カバースリップを洗ってください。
  3. マウスのピペット1mLの抗するTuj1のIgG 2aは抗体(1:500 3%BSAで希釈)およびウサギ抗GFAP IgG抗体(1:3%BSA 1,000希釈)パラフィンフィルムと場所カバースリップの一片上に抗体と接触して下向きにニューロスフェアとパラフィンフィルム。 Tuj1およびGFAP染色は室温で2時間に発生することができます。
    注:両方の抗体は、単一の溶液として調製することができます。
  4. ステップ7.4で説明したようにPBSで2回カバースリップを洗ってください。
  5. 赤色蛍光色素のピペットで1 mLのコンジュゲート抗マウスIgG 2A(1:3%BSA中で500倍希釈)および遠赤色蛍光色素コンジュゲート抗ウサギIgG(1:3%BSA中で500希釈)パラフィンフィルムと場所の一片上に二次抗体抗体と接触して下向きにニューロスフェアとパラフィン膜の上にカバースリップ。室温で1時間放置。
    注:両方の抗体は、単一の溶液として調製することができます。
  6. ステップ7.4で説明したようにPBSで2回カバースリップを洗ってください。
  7. PBSで300 nmの4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)ストック溶液を希釈します。核染色のため、室温で2分間DAPIと接触して下向きにニューロスフェアとパラフィン膜の上にパラフィンフィルムと場所カバーグラスの作品へのDAPIのピペットで1 mLです。
  8. ステップ7.4で説明したように、脱イオン水で1回PBSで二回カバースリップを洗ってください。適切なマウンティング培地を用いてガラススライド上にカバースリップをマウントし、室温でO / Nを乾燥させます。

10.いま分化した神経球のエージング(13日目)

  1. 40Xを用いた共焦点顕微鏡下で画像のニューロスフェア。それぞれ、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよびアストロサイトを検出するために、488 nmの、594 nmおよび647 nmでレーザーを使用してください。
  2. 単能性、両能とtripotentニューロスフェアの割合を決定します。
    注: -オリゴデンドロサイト、ニューロンおよびアストロサイト5,14,15,26効力は3神経系統に分化する神経球の能力によって決定されます。オリゴデンドロサイトは、O4のための陽性染色(セクション8)によって識別されます。ニューロンをするTuj1(セクション9)のための陽性染色により同定されます。アストロサイトはGFAPのための陽性染色(セクション9)によって識別されます。単能性神経球は、系統のいずれか一方のみに分化し、積極O4、GFAPまたはのTuj1のいずれかを染色する必要があります。両能性の神経球は、任意の2つの系統に分化し、積極O4およびGFAPまたはO4とするTuj1またはGFAPとするTuj1を染色する必要があります。異なるtripotentのニューロスフェアすべての3つの系統にiatesと積極O4、GFAPとのTuj1を染色する必要があります。
  3. 以下の式を用いて、目的の集団におけるNSCの周波数を決定します。
    NSC周波数=(tripotentのニューロスフェアのNFUののx%)/ 100%。

Representative Results

私たちは、NSCのを濃縮するために、LEX、既知の細胞表面NSCマーカー7の能力を評価するために、このプロトコルを使用しています。この研究からのデータは、NSCを、プロトコルにクローンアッセイを使用して列挙されている方法を説明するために使用されます。 E14.5マウスニューロスフェア細胞を抗LEX抗体と共にインキュベートしました。その後、LEX(LEX - )を発現しないレックス(LEX +)細胞を発現する細胞(FACS)を蛍光活性化細胞選別により50細胞/ mLで播種し、1週間のためのクローンのニューロスフェアを生成させました。タイムラプスイメージングは、ニューロスフェアは、( 図2)クローンである50細胞/ mLで生成されたことを示しています。 LEX +とLEXのためのNFU -細胞を決定しました。細胞( 図3G) - LEX +細胞がLEXと比較して有意に高いニューロスフェアの形成能を有することが示されています。生成されたニューロスフェアは、その後、分化させましたクローン条件下で、続いて免疫染色と( 図3a-e)を撮像しました。細胞( 図3F) - LEX +細胞はLEXよりも有意にtripotentのニューロスフェアを生成します。 NSC周波数は次にNFUとtripotentニューロスフェア( 図3G)の%に基づいて算出しました。 LEXに基づく選択は、NSCマーカーとしてLEXを検証し、14以上の倍NSC周波数を豊かにします。また、このプロトコル27とNCFCA 28を使用して、E14.5マウスニューロスフェアのNSCの周波数を決定しました。どちらの方法でも、E14.5マウスニューロスフェアで約2%の同等のNSCの周波数を報告しています。

図1
クローン条件の下で神経球の分化のために 、図1 のプロトコル。クローン性条件下で成長させたサンプルニューロスフェアは、個別に各PLL /ラミニン-Cに配置されています50ウェルのチャンバーカバースリップでもoated、およびO / Nを付着させました。同日、バルク培養ニューロスフェアは、PLL /ラミニンでコーティングされた10cmの皿に分化培地に播種し、O / Nを付着させます。翌日、バルク培養した神経球からの条件培地を濾過し、10cmの皿に戻されます。サンプルニューロスフェアは、その後。馴化培地上に反転し、3-4日間28分化させている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
クローン神経球の 図2. 成長。E14.5神経球由来細胞を分離し、96ウェルディッシュに50細胞/ mLで播種しました。個々の細胞は、タイムラプスイメージングにより6日間追跡しました。 Oの画像神経球に成長ね、そのようなセルが示されています。ニューロスフェアは、クローン性を維持することに注意してください。 (a)は、0日。 (b)は 1.19.45。 (c)は 2.95.37。 (d)の 3.32.76。 (e)は 4.46.53。 (f)は 5.61.44。最初の数日を指し、2番目の数値は一日の割合を意味し、第3の数は、hの割合を指します。倍率10倍。スケールバー、100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図クローン神経球およびNSC周波数のEnumerationの3分化。シングルニューロスフェアは、3日間50ウェルチャンバーカバースリップで拾い、分化させました。 tripotentのニューロスフェアの駅の代表画像(a)は、DAPIでINEDおよび(b)GFAP免疫染色のため、(C)のTuj1および(d)O4。 (D) - (e)は (a)ののオーバーレイを表示します。スケールバー、65μmで。 (f)の単能性、両能とtripotent LEX +とLEXで生成されたニューロスフェアの% -細胞(平均±SEM; n = 3) でした 。 LEX +およびLEX(g)においてNSC周波数- 。NFUの製品とtripotentニューロスフェアの%として計算されるセルは、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

私たちは姫クローン性条件下でのNSCの列挙について説明します。重要なステップは、新鮮なNSCの増殖および分化培地の使用、またコートに新たに調製したPLL /ラミニン溶液を用いチャンバーカバーグラスだけでなく、培養皿を含みます。これは、ニューロスフェアの最適な増殖と分化条件を確保します。良質の抗体の使用は、効果的に、ニューロンおよびグリア、並びに他の神経球に接触していないクローンのニューロスフェアの選択的なピッキングを検出するために、重要です。さらに、それを拾って、神経球が枯渇しないようにすることが重要です。すべての10の神経球をピッキングした後、各ウェルに分化培地の10μLを追加することをお勧めします。異なるサンプルからの神経球の間のクロストークを回避するために、サンプルごとに10cmの皿の一方チャンバーカバーガラスを使用することが重要です。 2カバースリップ(異なる試料からそれぞれ含む神経球)に配置されている場合同じ10cmディッシュ、1カバーガラスからの神経球は、特定の系統に分化するために、他のカバースリップにニューロスフェアの傾向を変更することができる因子を放出する可能性があります。同じ10cmの皿の中の二つのカバースリップはまた、サンプル間のミックスアップになることがあります。

NFUまたはNSC周波数が予想よりも低い場合には、低継代数のニューロスフェアが使用されていることを確認してください。健全な低継代のニューロスフェアは、馴化培地を生成するために使用されていることも重要です。ニューロスフェアは、96ウェル皿のように小径、とのウェル中で培養される場合は次に、操縦し、マイクロピペットを用いて、ニューロスフェアを選択することが困難になります。この場合、ピッキングの前に6ウェル皿のようなより大きな培養皿に神経球を移します。選んだニューロスフェアの一部は、文化や免疫染色の間のチャンバーカバーガラスから持ち上げことがあります。培養中のチャンバーカバーガラスの動き、およびより少ない集中的な洗浄を最小限に抑えます免疫染色の際にる、ニューロスフェアの剥離を回避するのに役立つだろう。

初期の研究では、唯一のNFA 7,11,13を使用したNSCを定量化しました。両方のNSCおよび早期NPは、神経球5を生成するようしかし、NFAは、NSCの周波数を過大評価します。ルイらは NCFCA 21,22として知られているのNSCを定量化するための別の方法を開発しました。 NCFCAは、クローン性を保証するために、コラーゲンベースのマトリックス中に単一細胞を培養することを含む、それが直径2mm上記ニューロスフェアのみのNSCによって形成されることが示されました。 NCFCAと同様に、クローンは、このプロトコルを通じて確保されています。これは、クローン密度でのニューロスフェアを生成し、チャンバーカバーガラスでニューロスフェアを微分することにより達成されます。チェンカバースリップの使用は多くの利点を与えます。チャンバーカバースリップは、それによって分化の間にクローン性を確保し、他のサンプルのニューロスフェアと物理的に接触しなくても、区別するために、各サンプルのニューロスフェアを可能にします。チャンバーカバーガラスサンプル神経球を連続的に調整することができるように、最大​​の分化を確実にするために分化培地に懸濁し配置することができます。分化中の馴化培地と血清の非存在下では、ニューロスフェアの生存率は低下し、神経球を主にアストロサイト(タムMとアーメドS、未発表)を生成します。また、免疫染色ニューロスフィアは、好都合に長期間保存することができ、チャンバーカバースリップを顕微鏡用スライドガラス上に直接取り付けることができます。 1はすぐに、よくチャンバー小で神経球を見つけるのイメージをキャプチャし、次のウェルに移動することができるように加えて、免疫染色ニューロスフェアの撮像が容易になります。

我々は、この原稿27とNCFCA 28に記載されているプロトコルの両方を使用してE14.5マウスニューロスフェア培養におけるNSCの周波数を決定しました。私の両方によって決定さE14.5マウスニューロスフェアでNSC周波数thodsは同等です。 NCFCAは多能であり、長期自己再生能力を持っているのNSCを列挙します。我々の方法からNSC周波数はNCFCAからそれに匹敵するので、私たちのプロトコルからの読み出しは、NSCの周波数を過大評価していないようです。 NCFCAが完了するまでに3週間を必要とし、主に細胞播種と培地補充を必要とします。ここで説明するプロトコルは、実行するために13日を要するとステップの異なるシリーズ、 例えば 、神経球のピッキング及び免疫染色を伴います。このプロトコルは、NSCのを列挙するための代替法として役立つ可能性があります。研究者は、その試料中のNSCの周波数を確認するためにNCFCAと、このプロトコルの両方を使用することができます。

このプロトコルの1つの制限は重要な一連のステップは、すべての条件培地、サンプルのニューロスフェアのNFUの決意、そして50ウェルのチャンバーカバースリップへのサンプルのニューロスフェアの転送の準備をしなければならない8日目に行わなければならないことですダ上で実行Y 8.一つは、これらのステップを完了するまでに時間がかかる場合があります。また、効率的な方法でこれらの手順を実行するには練習が必要です。

ニューロスフェアは、広くNSC機能および挙動を研究するために使用されています。しかし、神経球のNSCとNPの両方で構成されています。したがって、NSCの生物学を研究するために、神経球からのNSCを豊かにすることが重要です。現在、細胞表面マーカー、色素排除性並びに細胞サイズおよび粒度は、NSCを6,7,9-13,29,30を濃縮するために使用されてきました。このプロトコルは、潜在的なNSCマーカーによってNSCの富化を定量化し、決定的なNSCマーカーの探索を容易にするために使用することができます。四つの最近の研究では、NSCの周波数5,14,15,26を列挙するために、このプロトコルを使用しています。

Acknowledgments

我々は、この研究に資金を提供するための科学技術研究庁(* STARの)、シンガポールに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes  BD 352096
50 mL conical centrifuge tubes  BD 352070
20 mL sterile syringe   BD 300141
50 mL sterile syringe  BD 300144
Fetal Bovine Serum (FBS)  Biowest S1810
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody Covance MMS-435P-100
Rabbit anti-GFAP IgG antibody Dako Z033401
Hemocytometer  Hausser Scientific 3100
Microscope fitted to laminar flow hood  Leica MZ6
Glass slides Marienfeld-superior 1000200
Mouse anti-O4 IgM antibody  Merck Millipore MAB345
Hydromount National Diagnostics HS-106
Microscope Nikon Eclipse TS100-F
Laminar flow hood NuAire NU-543
96-well culture dishes NUNC 167008
10-cm culture dishes  NUNC 150350
Paraffin film Parafilm PM999
Human Epidermal Growth Factor (EGF)  Peprotech AF-100-15
Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)  Peprotech 100-18B
0.2 µm filter  Sartorius Stedim 16534-K
0.45 µm filter Sartorius Stedim 16555-K
1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH)  Sigma-Aldrich S2770
1.0 N Hydrochloric acid (HCl)  Sigma-Aldrich H9892
Trypan Blue  Sigma-Aldrich T8154
Poly-L-Lysine (PLL)  Sigma-Aldrich P8920
Paraformaldehyde (PFA) powder  Sigma-Aldrich P6148 Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA) powder  Sigma-Aldrich A7906
50-well chambered coverslips  Sigma-Aldrich C7735
Stir plate with heat function  Stuart UC152
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320-033
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140-122
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017-015
1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190144
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Thermo Fisher Scientific A21042
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific A21135
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody Thermo Fisher Scientific A31573
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)  Thermo Fisher Scientific D3571
Cell-culture centrifuge Thermo Fisher Scientific  RT1 75002383
Pasteur pipettes Thermo Fisher Scientific 10006021
CO2 incubator
Ventilated fume-hood
Aspirator
Confocal microscope
Micropipettes
Micropipette tips
Plastic pipettes
Multichannel pipettes
Glass beaker
Sterile forceps
pH meter

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References

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クローンのアッセイを用いて神経幹細胞の列挙
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Narayanan, G., Yu, Y. H., Tham, M., Gan, H. T., Ramasamy, S., Sankaran, S., Hariharan, S., Ahmed, S. Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays. J. Vis. Exp. (116), e54456, doi:10.3791/54456 (2016).More

Narayanan, G., Yu, Y. H., Tham, M., Gan, H. T., Ramasamy, S., Sankaran, S., Hariharan, S., Ahmed, S. Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays. J. Vis. Exp. (116), e54456, doi:10.3791/54456 (2016).

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